Sumário

Organotípicas, modelos tridimensionais de cultura de células (3D) de tipos de tumores epiteliais, tais como o cancro da próstata recapitular os principais aspectos da arquitetura e histologia de tumores sólidos. A análise morfométrica dos Organóides 3D multicelulares é particularmente importante quando os componentes adicionais, tais como a matriz extracelular e microambiente do tumor são incluídos no modelo. A complexidade de tais modelos, até agora limitado a sua implementação bem sucedida. Há uma grande necessidade de ferramentas automáticas, precisos e robustos de segmentação de imagem para facilitar a análise de tais modelos de cultura celular 3D biologicamente relevantes. Nós apresentamos um método de segmentação com base em campos aleatórios de Markov (MRFs) e ilustrar o nosso método utilizando dados de imagem pilha 3D a partir de um modelo 3D organot�ica de células de câncer de próstata co-cultivadas com fibroblastos associados ao câncer (FAC). A saída de segmentação 3D sugere que estes tipos de células estão em contacto físico com o outro no interior do modelo, o que tem importantes implicações para a biologia do tumor. desempenho segmentação é quantificada utilizando verdade rótulos terrestres e mostramos como cada passo do nosso método aumenta a precisão da segmentação. Nós fornecemos a verdade chão etiquetas junto com os dados de imagem e código. Usando dados de imagem independente mostramos que o nosso método de segmentação é também mais geralmente aplicáveis ​​a outros tipos de microscopia celular e não só limitado a microscopia de fluorescência

Citation:. Robinson S, Guyon L, Nevalainen J, Toriseva M, Åkerfelt M, Nees M (2015) Segmentação de dados de imagem Complexo Modelos organotípicas 3D de Câncer tecidos com Campo aleatório de Markov. PLoS ONE 10 (12): e0143798. doi: 10.1371 /journal.pone.0143798

editor: Olivier de Wever, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 03 de julho de 2015; Aceito: 10 de novembro de 2015; Publicação: 02 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Robinson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. VTT Oy é uma organização sem fins lucrativos, instituição integralmente detida pelo governo de pesquisa que sucede oficialmente a organização anterior, fundada em 1942, anteriormente conhecido como Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus ou VTT (Centro de Pesquisa Técnica Nacional de Finlândia). VTT Oy foi incorporada em 2015/01/01 e mantém a estrutura de uma instituição de pesquisa em grande escala. A pesquisa descrita aqui é de natureza exclusivamente académica, não relacionados de alguma forma para produtos comerciais, serviços ou a investigação do contrato em curso com terceiros realizadas em VTT Oy. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, conceder números 284.619 (M A) e 267.326 (MN). SR é o beneficiário de um contrato tese CEA-Indústria e um contrato tese VTT. VTT forneceu apoio sob a forma de salários para SR autores, MA, e MN, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. MT tem trabalhado como pesquisador externo filiado à VTT através do grupo de pesquisa (liderado pelo MN). Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção autor contribuições

Conflito de interesses:. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem relacionada com a sua afiliação com VTT. Esta filiação não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os processos celulares ocorrem naturalmente em três dimensões (3D) e as células são tipicamente incorporados em matriz extracelular , que é um componente-chave do microambiente celular. Assim, fisiologicamente modelos de cultura de células relevantes são cada vez mais concebidas em formatos 3D embutidos na matriz extracelular para capturar complexa biologia tecido-como mais fielmente [1]. Um tumor sólido representa um tecido e complexa perturbado com a sua própria característica e a homeostase do tecido circundante microambiente do tumor. plasticidade de células tumorais e propriedades importantes tais como a diferenciação contra a invasão de células de tumor são fortemente influenciadas pelo microambiente do tumor. Recapitulando as características de tumores sólidos in

in vitro

requer ensaios baseados em células que imitam, simultaneamente, a matriz extracelular e microambiente tumoral, homeotípica e célula-célula heterotípica contactos, e permitem a formação de interacções célula-matriz relevantes. técnicas de cultura de células Organotípicas 3D atualmente representam os

in vitro

modelos mais biologicamente relevantes para a investigação de diferenciação câncer epitelial, polarização e invasão [1-3]. No entanto, a falta de métodos de análise de imagens de microscopia apropriados, até agora limitado o sucesso da implementação e interpretação de tais modelos.

Além de células cancerosas, células estromais diferentes representam o componente mais crítico do microambiente do tumor. fibroblastos associada a cancro (FAC) são o tipo de célula estromal mais abundante na maior parte dos carcinomas e desempenham um papel essencial na progressão do tumor [4-6]. FAC, portanto, representam um importante alvo para terapias contra o câncer. A interacção entre as células tumorais e FAC ainda é pouco compreendida e modelos de cultura celular mais confiáveis ​​e robustas que recapitular melhor o complexo histologia do

in vivo

tumores são obrigados a estudar interações tumor-estroma.

Nós consideramos os dados de imagem da pilha 3D multicanal a partir de um modelo de cultura celular organot�ica 3D complexo de células tumorais do câncer de próstata co-cultivadas com FAC. Nosso protocolo de modelo de cultura de células e de imagem 3D relaciona-se com o nível multicelular em que os atributos globais do Organóides tumorais e estruturas CAF são mais críticas do que a captura de células individuais ou os núcleos das células. Adquirido com uma relativamente grande distância entre imagens na pilha, a resolução dos dados de imagem dentro de uma imagem foi até 20 vezes a resolução entre as imagens na pilha.

tecidos saudáveis ​​da próstata são formados de ácinos, que são aglomerados de células ocas que formam as menores unidades funcionais de uma glândula secretora. No câncer de próstata fase antecipada dessas ácinos começam a se encher de células pré-malignas ou malignas para tornar-se esferóides sólidos. A forma eo tamanho do Organóides multicelulares contém informações morfométricas valiosa [7] e nosso interesse reside no tumor multicelular e estruturas CAF como objetos informativos distintos. segmentação precisa de tanto do tumor multicelular e estruturas CAF é o primeiro passo na investigação no qual o formato e dimensões, estas tipos de células podem ser formação de contactos de célula-célula directos. Daí o nosso objectivo é produzir uma segmentação automática para ambos os tipos de objetos sem assumir informação da forma prévia ou considerando células individuais.

visão computacional automatizado tipicamente permite maior eficiência e objetividade de análise humana Manual [8]. Segmentação e a identificação de partes da imagem que são de interesse é o primeiro passo para muitas aplicações de visão por computador. métodos de thresholding simples formam a base de muitas metodologias típicos de segmentação [9]. plataformas de análise de imagem de freeware populares, como celular Profiler [10] e ImageJ /Fiji [11] fornecer implementações práticas de tais metodologias de segmentação especificamente concebidos para os dados de microscopia celulares e permitir a análise para além da segmentação em dutos especializados para determinados conjuntos de dados. No entanto tal análise é tipicamente focado em dados de microscopia de alta resolução em uma única célula ou mesmo níveis sub-celulares e também é focado principalmente em duas culturas (2D) de células monocamada dimensionais, embora visualização volume 3D e renderização é possível em ImageJ. produtos de software comerciais que se concentram na análise de imagens de microscopia celular 3D, como Imaris (Bitplane) e Volocity (PerkinElmer) são projetados para análise muito detalhada de imagens de alta resolução no nível da célula única onde não pode ser tão pouco como 0,5

μ

m entre as imagens na pilha 3D. As necessidades específicas dos dados de imagem do nosso modelo de cultura celular 3D complexo, sendo os dados de imagem multicanal 3D onde existem grandes distâncias entre as imagens da pilha 3D, exigem manipulação em profundidade do método de segmentação que não está disponível dentro dessas plataformas.

Markov (MRFs) são utilizados para a visão de computador em muitas áreas diferentes e para uma ampla gama de problemas [12]. Tais modelos são populares porque a estrutura Markov ‘vizinho’ permite que as relações espaciais dos pixels a ser tido em conta, enquanto continuam sendo computacionalmente viável. Para os dados de imagem de microscopia celular, metodologias baseadas MRF foram aplicadas para rastrear células individuais [13, 14], a classificação [15], detecção de movimento [16], a restauração da imagem e deconvolução [17, 18], e identificação da mitose [19, 20]. MRFs também têm sido amplamente utilizado para segmentação de imagens em uma ampla série de áreas, com muitos ‘imagem natural “(não-microscopia) aplicações [21]. Para

in vivo

imagens de microscopia celulares, MRFs têm sido utilizados para a segmentação em aplicações histológicas específicas [22, 23] e para segmentar características específicas, tais como vasos sanguíneos [24]. Eles têm sido utilizados para

in vitro

imagens de microscopia celulares para o segmento núcleos de células individuais [25] incluindo o uso de uma forma específica antes núcleos [26, 27]. Um método baseado MRF também tem sido utilizada para a segmentação e classificação das estruturas sub-celulares no interior das células individuais [28].

implementar o nosso método de segmentação 3D baseado em CAMs e mostram que executa com precisão sobre dados de imagem a partir de complexo modelos 3D organotípicas de câncer de próstata. Os pontos fortes do nosso método de segmentação são demonstrados usando os dados de imagem experimental diferentes, mas estreitamente relacionados e quantitativamente comparando com outros métodos de segmentação usando etiquetas de verdade terrestre. Nós mostramos que o nosso método baseado MRF captura com precisão características biologicamente relevantes, mas muitas vezes mais finos e mais fracas, tais como estruturas CAF complexos e a distinção de tumor contra células do estroma em um ambiente 3D. Também mostramos que o nosso método de segmentação é mais geralmente aplicáveis ​​a outros tipos de dados de imagem de microscopia celular e não só limitado a microscopia de fluorescência.

Materiais e métodos

dados de imagem de microscopia Cellular

Nós utilizamos dados de imagens de microscopia confocal 3D pilha de três modelos de cultura celular 3D organotípicas diferentes, mas estreitamente ligados, o que nos referimos como “IF dados de imagem”, o “dados de imagem ao vivo” e o “dados de imagem FAK ‘. Detalhes completos dos protocolos experimentais e de imagem foram previamente publicados [29] e são brevemente descritos abaixo. Todas as pilhas 3D de imagens de ambos os dados de imagem ao vivo, se e foram segmentadas manualmente pelos biólogos que realizaram os experimentos. A segmentação manual foi realizada em Adobe Photoshop (Adobe Systems) e resultou em cada pixel que está sendo dado um rótulo chão verdade de qualquer ‘em células tumorais foco’, ‘na FAC foco “ou” fora de foco /fundo “. Esses rótulos verdade terrestre são usados ​​na validação do nosso método de segmentação.

preparações da matriz extracelular comercialmente disponíveis (fator de crescimento reduzida Matrigel com uma concentração de estoque de 8 mg /ml e colágeno tipo I com um estoque de 3 mg /mL) foram adquiridos a BD Invitrogen e usada para todas as experiências de co-cultura 3D. Uma diluição de 25% ou 50% de Matrigel e foi usada uma mistura 1: 1 de ambas as preparações foi de rotina usado (2-4 mg /ml de Matrigel, 1,5 mg /mL de colagénio). Tanto as células de tumor e de estroma foram semeadas como suspensões de células individuais, com densidades iniciais de 700-1500 células /poço. As co-culturas em 3D foram preparados utilizando um princípio de “sanduíche”, onde todas as células, incluindo os componentes do estroma foram semeadas na mesma camada planar para facilitar a criação de imagens. Nestas instalações, a densidade de sementeira inicial foi de cerca de 1800 células /cm

2.

na configuração de co-cultura SE 3D, LNCaP de cancro da próstata [30] foram co-cultivadas com o FAC isolado a partir de uma PF179T paciente de cancro da próstata [31], com uma relação de semeadura de células inicial de 1: 2 na matriz extracelular. Após 14 dias de cultura, as células foram fixadas e coloração por imunofluorescência indirecta foi realizada. Utilizou-se um anticorpo específico para o pan-queratina para a coloração específica dos Organóides tumorais, ao passo que FAC foram coradas com um anticorpo contra vimentina humana. células CAF, eventualmente fundidos em grandes estruturas multicelulares, que foram caracteristicamente em torno da periferia da Organóides tumorais.

Na definição de co-cultura 3D LIVE, foram utilizadas variações das mesmas células como para os dados de imagem Se definido. Nesta experiência, as células tumorais LNCaP que expressam a proteína DsRed foram co-cultivadas com FAC PF179T que expressam GFP. As mesmas condições experimentais, extractos de matriz extracelulares e outras configurações foram usadas como acima. A formação, o crescimento, a diferenciação e a morfogénese de Organóides tumorais, bem como a formação de estruturas multicelulares simples de FAC foi monitorizada ao longo de um período de 14 dias, após o que de imagem foi realizada. A configuração de co-cultura 3D FAK era a mesma que a configuração de viver com a adição de quinase de adesão focal (FAK) inibidores Y11 e PF-573228 comprados a partir de Tocris Bioscience. As três condições foram: controle DMSO (0,01%), 5

μ

concentração M de Y11 e 5

μ

concentração M de PF-573228

digitais confocal

Multicanal 3D. as imagens foram obtidas em que as células tumorais e FAC foram visualizados separadamente. Ambos os tipos de células são apresentados abaixo em diferentes (falso) canais de cor: vermelho para células tumorais e verde para FAC. Os dados se e imagem ao vivo foram adquiridos com um microscópio Zeiss Axiovert-200M, equipado com uma unidade confocal girando-disco Yokogawa CSU22 usando um Zeiss Plan-Neofluar 20 × objectivo (abertura numérica 0,17). Os dados de imagem se consistem de 8 pilhas de imagens enquanto os dados da imagem VIVO composto por 12 pilhas de imagens. Cada imagem tem dimensão 512 × 672 pixels e o número de imagens em um único faixas pilha de 9 a 22. Para todas as imagens de ambos os conjuntos de dados, um pixel ≈ 0,5

μ

m dentro de uma imagem e a distância entre imagens adjacentes em uma pilha é de 10

μ

m. Os dados de imagem FAK foram adquiridas com as mesmas configurações de microscópio utilizando um Zeiss Plan-Neofluar 5 × objectivo (abertura numérica 0,16) e consistem de 24 pilhas de imagens (8 para cada condição). Um pixel ≈ 2.5

μ

m dentro de uma imagem e a distância entre as imagens adjacentes em uma pilha é de 40

μ

m. Cada imagem tem dimensão 512 × 672 pixels e o número de imagens em uma única pilha é 18.

Um, menor complexidade imagem 2D conjunto de dados independente (BBBC003v1) fornecido na Coleção de Referência Broad BioImage [32] é também utilizado para a validação de segmentação. Os dados consistem de 15 imagens de embriões único rato multicelulares, cada um dos quais é uma imagem em escala de cinzentos 640 × 480 pixels capturadas com microscopia de contraste de interferência diferencial e com uma segmentação verdade terrestre de toda a estrutura do embrião. Nós, adicionalmente, considerar o desempenho de segmentação com o contraste “Melanoma” fase 2D e dados de imagem ‘Tscratch’ (BBBC019), também a partir da Colecção de Referência Broad BioImage. Os dados de imagem melanoma consistem de 20 imagens, cada uma com dimensão de 1024 x 1280 pixels, enquanto os dados de imagem Tscratch consistem de 24 imagens cada com dimensão 1028 × 1384 pixels. Ambos os conjuntos de dados são a partir de experimentos ‘a cicatrização de feridas’ com segmentações verdade terrestre também fornecidos.

método de segmentação

No âmbito Markov campo aleatório (MRF), é dada cada pixel de uma imagem digital de um rótulo de algum conjunto predefinido (classicamente “primeiro plano” e “fundo” para a segmentação). Encontramos a rotulagem que optimiza uma função de energia correspondente de modo que o rótulo de cada pixel corresponde ao valor do pixel observado e para que haja uma marcação “suave” em toda a imagem. Para cada pixel

i

em uma imagem digital, deixe

X

i

e

Z

i

ser as variáveis ​​aleatórias para rótulo de pixel (não observado) e intensidade pixel (observada), respectivamente. Deixe o conjunto de variáveis ​​aleatórias para todos os pixels têm o gráfico independência condicional dada na Figura 1. Em seguida, o conjunto de variáveis ​​aleatórias é um MRF condicional com função de energia (1) para pixels

i

e pares adjacentes de pixels correspondentes (

i

,

j) com rótulos

l

e

k

, e onde

I

é a função do indicador, ( 2)

Nós encontramos as etiquetas energéticas mínimas (segmentação)

os potenciais unárias

u

i

;

l

estão a ser definido (3) onde

z

i

é o valor do pixel observado e π

l

é a densidade de probabilidade função de correspondente para rotular

l

. Os potenciais de pares

w

ij

;

lk

estão a ser definido (4) onde

z

i Comprar e

z

j Quais são os valores de pixels observados,

λ

0,

λ

1 e

β Quais são os parâmetros a serem estabelecidos e dist (

i

,

j

) é a distância entre pixels

i

e

j

. Note-se que a distância pode ser diferente para pixels vizinhos dentro de uma imagem em comparação com pixels vizinhos entre imagens, dependendo da resolução dos dados de imagem em cada dimensão.

Os vértices e arestas de uma condicional gráfico independência codificam a independência condicional propriedades do correspondente conjunto de variáveis ​​aleatórias. No gráfico MRF condicional (Fig 1), cada aresta corresponde a qualquer um unário (

X

i

,

Z

i

) ou pares (

X

i

,

X

⋅) potencial na função de energia correspondente Eq (1). Figura 1 mostra uma 6-vizinho condicional MRF (6 potenciais pares para cada pixel), que usamos para o nosso método de segmentação 3D. Cada pixel tem 4 vizinhos dentro de uma imagem e 2 vizinhos entre imagens na pilha 3D, com menos vizinhos para pixels nas bordas da pilha.

Os potenciais unários e pares estabelecer a correspondência e “suavidade” do rotulagem de pixel global, respectivamente. Os parâmetros

λ

0,

λ

1 e

β

determinar a quantidade de influência que os potenciais pares têm sobre os potenciais unárias na minimização da função de energia (1). O trade-off é que precisamos de uma rotulagem com as regiões segmentadas ‘suaves’ contíguos (pixels vizinhos têm o mesmo rótulo), mas também deseja preservar as descontinuidades presentes na imagem (S1 Fig). A forma dos potenciais unários e pares é padrão para o problema da segmentação MRF [33]. Os potenciais de satisfazer a condição de sub-modular que garante a existência de uma solução mínima de energia no caso binário etiqueta e permite uma aproximação da solução mínima de energia no caso multirrótulo [34].

para definir os potenciais Eq unários (3) que exigem uma função de densidade π

l

ao longo dos valores de pixels correspondentes a cada etiqueta

l

. O método padrão é empregar um procedimento de “segmentação interativa ‘e que o usuário manualmente regiões” semente “da imagem para cada rótulo [33]. Em seguida, as distribuições empíricas das regiões semeados são utilizados para calcular os potenciais unárias. Em vez de semear manualmente a imagem, que se encaixam um modelo de mistura Gaussiana univariada com três componentes para a densidade dos valores de pixel observado nos canais vermelho e verde separadamente. As densidades utilizados para os rótulos de segmentação são então bivariada misturas dos componentes univariadas obtidas em cada canal de cor (Fig 2)

Os três rótulos são:. ‘Em foco das células tumorais com uma mistura de’ fora de foco ‘FAC e’ background ‘na outra dimensão (vermelho), “em foco” FAC com uma mistura de’ fora de foco ‘células tumorais e’ background ‘na outra dimensão (verde) e uma mistura de “fora de foco” e “fundo” em ambas as dimensões (tracejada).

Os parâmetros

λ

0,

λ

1 e

β

são definidos com base nas distribuições dos potenciais unários para equilibrar o trade-off entre a correspondência e suavidade na saída de segmentação. Embora existam métodos para aprender esses parâmetros usando um conjunto de treinamento de dados de imagem verdade terrestre rotulados, estes métodos são altamente dispendiosa e por isso muitas vezes não é utilizado na prática [35]. Além disso, a rotulagem verdade terrestre raramente está disponível na maioria das aplicações. Para cada pilha de imagens que setandso que os potenciais unários e pares compartilham a mesma gama. O valor de

β

é ajustado manualmente em uma pilha candidato de imagens eo mesmo valor é usado para todas as outras pilhas do mesmo experimento.

Como uma etapa de pré-processamento, usamos um filtro de entropia locais [9] para quantificar a textura local (entropyfilt função embutida no MATLAB imagem Processing Toolbox). O filtro de entropia local é aplicada a ambos os canais de vermelho e verde separadamente. As imagens em escala de cinzentos são matérias-amostrado para baixo para 8 bits, de modo que cada pixel corresponde directamente a um valor de intensidade no conjunto {0, 1, …, 255}. Para cada pixel

i

, a entropia valor filtrado locais iswhere

p

j

é a proporção de pixels na vizinhança que têm a mesma intensidade de pixel de

j

. O bairro de cada pixel

i

é a 9 × 9 quadrado centrado em pixels

i All Inclusive com estofamento simétrica em torno da borda da imagem.

O nosso método de segmentação 3D é resumido nas seguintes etapas (Fig 3):

Processo da pilha 3D das imagens usando o filtro de entropia locais no vermelho (células tumorais) e canais verde (CAFS) separadamente,

univariadas Fit modelos de misturas de gaussianas para os valores filtrados de pixel no vermelho (células tumorais) e verde (FAC) canais separadamente,

Combine as densidades de mistura (Fig 2) e calcular os potenciais unários e pares,

Encontre a rotulagem de energia mínima.

a microscopia confocal é usado para modelos de co-cultura de imagem 3D, resultando em uma pilha 3D de imagens. O nosso método de segmentação 3D é aplicada à pilha 3D de imagens, resultando em saída de segmentação 3D.

Nós implementamos o nosso método de segmentação em MATLAB e usou o

α

-Expansão algoritmo para encontrar o rotulagem energética mínima [34, 36, 37].

método de validação

Sem única ferramenta está disponível para realizar a segmentação exigida para um determinado conjunto de dados. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens e é muitas vezes adaptado para aplicações específicas, tais como a utilização de informação da forma prévia ao segmentar células individuais ou núcleos de células [25-27]. Embora existam muitos métodos de segmentação sofisticados, não temos conhecimento de qualquer que seria adequado a ser aplicado aos dados de imagem pilha 3D a partir de nosso complexo modelo de cultura celular 3D. Assim, para fins de comparação, usamos uma série de métodos de segmentação padrão que podem ser considerados como ‘construir’ a nossa abordagem MRF:

intOtsu usando o método de Otsu [38] até o limiar dos canais de intensidade de vermelho e verde separadamente e combinando os rótulos de modo que “célula tumoral” ou “CAF” substitui o “fundo”, ou se um pixel é rotulado tanto “célula tumoral ‘e’ CAF ‘é atribuído aleatoriamente um desses rótulos.

Entotsu usando o método de Otsu ao limiar da entropia locais filtrada canais vermelho e verde separada e combinando as etiquetas usando o mesmo procedimento acima.

misturas thresholding as imagens entropia locais filtrada utilizando as densidades mistura bidimensionais (Fig 2).

MRF o método apresentado neste trabalho.

o método de Otsu encontra o limite global que maximiza a variância inter-classe dos grupos resultantes e é uma técnica amplamente utilizada para a imagem básica escala de cinzentos segmentação [ ,,,0],9]. modelos de mistura são eles próprios também amplamente utilizado para muitas aplicações de segmentação de imagem [39]. Uma vez que as misturas bivariadas são utilizados para calcular os potenciais unários em nosso método de segmentação MRF com base, método as «misturas» é equivalente ao método de MRF apresentada neste artigo com o

λ

0 =

λ

1 = 0.

a saída dos quatro métodos de segmentação é comparado com os rótulos verdade terrestre usando o macro global F

1-score, a média harmônica da precisão de classificação e recordar [40]. Daí F

1-score = 1 para a rotulagem perfeito. Os dados de imagem IF e VIVO, bem como os dados de imagem do rato embrião independentes são utilizados para validação.

Resultados e Discussão

Nós apresentamos uma série de resultados, a fim de discutir os benefícios da nossa MRF método baseado para a nossa aplicação biológica particularmente complexa, em particular, multicanal dados de imagem em 3D com grandes distâncias entre as imagens da pilha. Usando a saída segmentação 3D, é possível investigar se as células tumorais e FAC formam contactos célula-célula ou são fisicamente separados no nosso modelo de co-cultura em 3D, o que tem importantes implicações para a biologia do tumor. Nós, adicionalmente, mostrar a utilidade do filtro entropia local e que a nossa abordagem baseada em MRF obtém os resultados de segmentação mais precisas. O código para o nosso método de segmentação, os dados de imagem e os rótulos verdade terrestre são fornecidos como material complementar (S1, S2 e S3 Arquivos).

saída de Segmentação sugere o contato físico do tumor multicelular e estruturas CAF

a saída do nosso método de segmentação 3D pode ser usado para investigar se Organóides tumor multicelular e estruturas CAF estão em contato direto.

Usando a microscopia confocal a resultados de cultura de células de imagem 3D em uma pilha 3D de imagens correspondentes a uma série de planos focais paralelas. Uma projeção de intensidade máxima pode ser obtida através da projeção dos valores máximos de pixel intensidade para o (

x

,

y

) avião. Embora uma quantidade substancial de informações podem ser perdidas, a análise de imagens 2D em perspectiva é muito mais desenvolvido e menos dispendiosa do que considerar toda a pilha 3D de imagens. Por estas razões, as estruturas atuais de análise de imagem para modelos de cultura celular 3D do câncer de próstata são baseados em projeções de intensidade máxima [41, 42]. Embora as projecções máximos de intensidade pode ser adequado para analisar os modelos de monoculturas para certas aplicações, eles não são adequados para mais modelos organotípicas complexos, tais como modelos de co-cultura. Desde toda a informação estrutural é projetado no (

x

,

y

) avião, não seria possível determinar se Organóides tumorais e FAC estão em contacto directo ou fisicamente separados usando uma análise 2D .

Figura 4 (a) mostra a projeção de intensidade máxima de ambos os canais vermelho e verde (cor falsa) para uma pilha de exemplo 3D. Ainda não está claro se o tumor central e estruturas CAF estão diretamente em contato. As estruturas CAF parecem estar localizado no interior da estrutura do tumor (seta azul), o qual é biologicamente irrelevante. Em amostras de tumor clínicos, fibroblastos não são normalmente encontradas dentro Organóides tumorais, mas caracteristicamente apenas agregados (de tumor) de surround epiteliais. Apenas ocasionalmente, FAC pode entrar em contacto com as células tumorais na superfície de estruturas de tumor.

(a) projecção máxima intensidade de uma pilha 3D representativa. (B) – (d) diferentes pontos de vista sobre a saída de segmentação 3D correspondente utilizando o nosso método baseado MRF. A seta indica onde o azul FAC parecem estar dentro do tumor organ�de na projecção de intensidade máxima, mas pode ser visto como estando fora na saída segmentação 3D. Ver S1 vídeo para um vídeo da saída de segmentação 3D.

A segmentação 3D das células tumorais (vermelho) e FAC (verde) está ilustrado na figura 4 (b) e 4 (d). A saída segmentação destaca especificamente as regiões segmentadas correspondentes às estruturas da CAF que estão em contacto directo com as regiões segmentadas correspondentes a estrutura de tumor multicelular. Em particular, os FAC que pareciam ser localizado no interior da estrutura do tumor na projecção de intensidade máxima (Fig 4 (a)) pode agora ser visto como estando fora, mas em contacto com ambos os lados do tumor Central organ�de (seta azul). S1 Vídeo fornece pontos de vista adicionais sobre a segmentação 3D.

O 3D rendeu a saída de segmentação (Fig 4 (b) e 4 (d)) parece um pouco ‘blocos’, especialmente em

z

onde o organ�de tumor tem um ‘top flat’. Esta é uma característica dos dados de imagem e é devido à dispersão relativa dos dados em

z

. Não seria apropriado para extrapolar a prestação de modo que os Organóides tumorais parecem mais com “esferóides redondas ‘em 3D como este seria potencialmente confundir informação estrutural importante e não seria apoiada pela resolução dos dados da imagem

.

é possível identificar manualmente se e que segmentado regiões CAF estão em contato direto com os Organóides tumorais segmentado, com a visualização fornecida de nossa produção segmentação 3D. A fim de demonstrar uma prova de conceito de quantificar automaticamente o contacto do tumor de estroma com a saída de segmentação, consideramos os dados de imagem de FAK (S2 FIG). Com a nossa segmentação MRF, consideramos que o contato entre as ‘células tumorais »e nas regiões segmentadas’ cafés ‘vai dar uma estimativa do contato tumor-estroma no modelo.

Figura 5 mostra gráficos de dispersão do volume total , superfície total e contato total das células tumorais “segmentadas e regiões” FAC “nos dados de imagem FAK. O volume total é o número total de pixels marcados, a área de superfície total é o número total de pixels marcados adjacente a um pixel com uma outra etiqueta e total de contacto é o número total de células tumorais ” ‘rotulados e pixels cafs’ que são adjacentes. O volume total e a área de superfície total de ambos os Organóides tumorais e estruturas CAF são geralmente menores mediante inibição da FAK (figura 5 (a) e 5 (b)) e esta está em conformidade com estudos anteriores [29]. controle DMSO exibe uma linha de base de contato com tumor-estroma (figura 5 (c)) e os inibidores de FAK perturbar claramente este contato. Com o inibidor Y11, parece haver menos contacto, em média, no entanto, o contacto também é mais variável. Há duas pilhas de imagens que têm maior volume total, área de superfície e contato em particular (indicadas por asteriscos azuis em S2 Fig). É claro que PF-573228 inibe o crescimento do tumor organ�de (figura 5 (a) e 5 (b)) e, portanto, existem poucos contactos físicos entre os dois tipos de células (Figura 5 (c)). Um teste de Kruskal-Wallis foi realizada em contacto total (Figura 5 (c)) e a hipótese nula de que as diferentes amostras são todas as realizações da mesma distribuição foi rejeitado (valor p = 2,6 x 10

-4). Correspondentes comparações de pares foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney

U

teste.