Abstract
O uso de inibidores da tirosina quinase (TKI) contra EGFR /c- Reuniram-se em cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) tem sido demonstrado ser eficaz no aumento da sobrevivência livre de progressão paciente (PFS), mas a sua eficácia é limitada devido ao desenvolvimento de resistência e recorrência de tumor. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de resistência aos medicamentos em NSCLC é necessário para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras e eficazes para melhorar o resultado paciente. Este estudo visa compreender o mecanismo de /c-Met inibidor da tirosina quinase (TKI) Resistência EGFR em NSCLC. linhagens de células H2170 e H358 foram feitas resistentes a SU11274, um inibidor de c-Met, e erlotinib, um inibidor EGFR, através de aumentos passo a passo na exposição TKI. A IC
50 concentrações de linhas resistentes exibiu um aumento de 4-5 e 11-22 vezes por SU11274 e erlotinib, respectivamente, quando comparados com as linhas parentais. Além disso, a mTOR e de sinalização Wnt foi estudado em ambas as linhas celulares para determinar o seu papel na mediação da resistência TKI. Foi observada uma regulação positiva 2-4 vezes de proteínas de sinalização de mTOR e uma sobre-regulação de 2 a 8 vezes de proteínas de sinalização de Wnt na erlotinib H2170 e as células resistentes SU11274. H2170 e H358 células foram ainda tratados com everolimus o inibidor de mTOR e o inibidor XAV939 Wnt. células resistentes H358 foram inibidos em 95% por uma combinação tripla de everolimus, erlotinib e SU11274 em comparação com 34% por uma dupla combinação destas drogas. células H2170 parentais não apresentaram nenhuma sensibilidade ao XAV939, enquanto que as células resistentes foram inibiu significativamente (39%) por XAV939 como um agente único, bem como em combinação com SU11274 e erlotinib. Resultados semelhantes foram obtidos com células resistentes H358. Este estudo sugere um mecanismo molecular novela de resistência a drogas em câncer de pulmão
Citation:. Fong JT, Jacobs RJ, Moravec DN, Uppada SB, Botting GM, Nlend M, et al. (2013) alternativos vias de sinalização como potenciais alvos terapêuticos para superar o EGFR e c-Met de resistência aos inibidores de Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (11): e78398. doi: 10.1371 /journal.pone.0078398
editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de abril de 2013; Aceito: 11 de setembro de 2013; Publicação: 04 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Fong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Research relatou nesta publicação foi apoiada pelo National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio https://www.nih.gov R21CA158965-01A1 para Neelu Puri. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: Dr. Marie Nlend é empregado pela Thermo Fisher Scientific . Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
EGFR e c-Met são altamente expressos em tumores NSCLC e compartilhar vias de sinalização comuns [1] – [3]. Enquanto TKI contra EGFR e c-Met estão na vanguarda da terapia do cancro, as suas eficácias individuais estão limitados [4], devido ao desenvolvimento de resistência [5]. contas de amplificação c-Met para mais de 20% de resistência adquirida ao EGFR TKI em NSCLC tanto
in vitro
e
in vivo
[6], [7]. Além disso, o desenvolvimento de “gatekeeper” contas T790M mutação secundária para 50% de toda a resistência adquirida ao EGFR TKI ambos
in vitro
e
in vivo
[8]. Além disso, a sua presença antes do tratamento com inibidores da tirosina quinase resulta em resistência primária para a terapia de TKI de EGFR [9]. Portanto, para explorar mecanismos de resistência é importante para conduzir
in vitro
estudos adicionais para determinar proteínas-alvo responsáveis pela resistência TKI em NSCLC.
SU11274 é um inibidor pequena molécula ATP-competitiva do actividade catalítica de c-Met [10] e é eficaz contra NSCLC [11]. Tivantinib, um c-Met TKI que inibe o crescimento do tumor em ratos [12], está actualmente na Fase III de ensaios clínicos e tem sido demonstrado que o aumento PFS de 9,7 para 16,1 semanas, quando administrado em combinação com erlotinib [13], [14]. Nestes ensaios, apenas determinados subgrupos de pacientes (mutantes KRAS, histologia não-escamosas e de status de EGFR de tipo selvagem) exibiu um aumento de PFS [14], o que sugere que os novos inibidores da tirosina quinase têm de ser adicionados a esta combinação significativamente. Além disso, o tratamento com uma combinação de MetMAb (anti c-Met mAb) e erlotinib reduziu o risco de morte por três vezes, em apenas um subconjunto de pacientes positivos para a expressão de c-Met [15]. Embora o uso de modalidades de terapia combinada pode limitar a capacidade dos tumores para desenvolver resistência [7], a compreensão do mecanismo de resistência é a melhor abordagem para melhorar a terapia-alvo [16].
Estudos realizados por nosso grupo e outros indicam que c-Met e EGFR tem crosstalk considerável, que aumenta a eficácia de combinações de TKI
in vitro
[1], [17]. Isto é devido ao facto de que o HGF pode transactivar o EGFR e fosforilação do EGFR pode activar c-Met resultando em efeitos sinérgicos sobre o crescimento de tumores [18] – [20]. Por isso, foi investigada uma nova abordagem terapêutica para superar a resistência a EGFR, c-met e /EGFR terapias de combinação com c-Met TKI em NSCLC. Para entender melhor como as células desenvolver esta resistência desenvolvemos linhas de células H2170 e H358 NSCLC com resistência adquirida a inibidores da tirosina quinase de c-Met, EGFR e uma combinação de ambos. Estas linhas celulares foram escolhidas porque expressam níveis elevados de EGFR e c-Met, são sinergicamente inibida por EGFR /c-met e TKI de EGFR não têm pré-existente ou resistência de c-Met causando mutações.
Anterior estudos demonstraram um aumento de eficácia com as terapias de combinação quando em comparação com as monoterapias [13], [14], [21] – [24]. A rapamicina inibidor de mTOR é capaz de cooperar com PHA665752 inibidor de c-Met em NSCLC [25]. Além disso, usando erlotinib e rapamicina ou everolimus (um derivado administrado por via oral de rapamicina) em combinação mostrou efeitos sinérgicos sobre a viabilidade celular, proliferação e autofagia [26], [27]. Esta combinação também foi mostrado para restaurar a sensibilidade a gefitinib [28]. No entanto, estes estudos administrado apenas inibidores de EGFR e de mTOR em combinação. Em nossos estudos, descobrimos que os inibidores de mTOR pode aumentar a eficácia da terapia de combinação EGFR /c-Met TKI para NSCLC
in vitro
. Além disso, tem sido sugerido que a diafonia entre o EGFR e a via Wnt podem participar na iniciação e progressão de tumorigénese e diafonia entre ligandos de vias mediadas pela RTK distintas podem facilitar a resistência a inibidores da tirosina quinase [29]. Hiperactividade de Wnt no cancro da mama tem sido mostrado para transactivar o EGFR e, inversamente, o EGFR activado pode contribuir para o aumento do efeito da via canonical Wnt [30] – [33]. Além disso, estudos sobre secções de tumores de pacientes têm mostrado uma correlação positiva entre mutações de activação de EGFR e acumulação nuclear de β-catenina em NSCLC primário [34]. Também tem sido mostrado que a via /β-catenina Wnt tem um papel importante na manutenção de células, patogénese e resistência após a inibição do EGFR em NSCLC [35].
nossos dados demonstram que a adição de inibidores de Wnt ao TKI SU11274 e os resultados erlotinib no diminuiu significativamente a viabilidade em linhas de células com resistência adquirida à combinação de terapia EGFR /c-Met TKI. Sugerimos que a activação de vias de sinalização alternativas é possível um mecanismo molecular da resistência aos medicamentos em NSCLC, utilizando os inibidores de c-Met, EGFR, mTOR e Wnt poderia melhorar significativamente o prognóstico do cancro do pulmão do paciente e ser a base para novos ensaios clínicos.
Materiais e Métodos
Reagentes e anticorpos
SU11274: [(3Z) -N- (3-clorofenil) -3 – ({3,5-dimetil-4 – [(4 -methylpiperazin-1-il) carbonil] 1H-pirrol-2-il} metileno) -N-metil-2-oxo-2,3-di-hidro-1H-indole-5-sulfonamida] e XAV939: [3,5, 7,8-tetra-hidro-2- [4- (trifluorometil) fenil] -4H-tiopirano [4,3-d] pirimidin-4-ona] foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O erlotinib e everolimus foram obtidos a partir de LC Laboratories (Woburn, MA). Tivantinib foi obtido a partir de Chemietek (Indianapolis, IN). Todos os inibidores foram suspensos em DMSO e manteve-se em alíquotas de 0,1 ml a -20 ° C. O HGF foi obtido a partir de Peprotech (Rocky Hill, NJ) e EGF foi obtido a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). mAb de coelho fosfoespec�ico para p-EGFR (Tyr1068, Clone D7A5), p-mTOR (Ser2448, Clone D9C2) e p-4E-BP1 (Thr37 /46, clone 2855) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA) . Os anticorpos policlonais de coelho para fosfoespec�ico P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, 2532) e p-p70S6K (Tyr421 /Ser424, 9208) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. Um anticorpo policlonal de coelho para o p-c-Met (Tyr 1003, 44882G) foi obtido a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Um mAb de rato activa para β-catenina (clone 8E7, 05-665) foi obtida a partir da Millipore (Billerica, MA). Para sinalização Wnt estudos, todos os anticorpos foram obtidos a partir kit amostrador anticorpo sinalização Wnt da Cell Signaling Technology (2915). mAb de coelho não fosforilado para p70S6K (2708) e mTOR (2983) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. Não fosforilada com c-Met (C-12, SC-10) e EGFR (1005, SC-03) foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Um mAb de rato para β-actina (A5441) foi obtido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Rato (7076) e (7074) anticorpos secundários IgG de coelho foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. Todos os anticorpos foram utilizados como descrito nas instruções do fabricante.
Linhas Celulares e Cultura de Células
H358 e linhas celulares de NSCLC H2170 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, CRL-5807 e CRL-5928, respectivamente) e cultivadas de acordo com as suas instruções. As linhas celulares foram incubadas a 37 ° C e 7% de CO
2 e mantido em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) forma (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, N ° Cat: SH3002701) suplementado com 10% (v /v) soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) e 1% (v /v) de antibiótico /antimicótico (Invitrogen, Cat No: 15240). Para estudar os efeitos de erlotinib e SU11274 como agentes terapêuticos individuais, bem como em combinação, H358 e H2170 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e tratadas depois de 24 horas. Em seguida, os ensaios de viabilidade MTT e transferências de Western foram realizados como descrito abaixo. IC
50 valores para cada linha celular foram calculados utilizando Sigma Plot V12.0 (SYSTAT Software, San Jose, CA).
celular MTT de viabilidade Ensaios
A viabilidade celular foi medido por um ensaio colorimétrico de redução do corante MTT (Sigma, St. Louis, MO) utilizando ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) de acordo com as instruções do fabricante. Cada experiência foi realizada em placas de 96 poços em réplicas de seis para cada condição de tratamento e repetido três vezes. As células foram plaqueadas a 5000 células /cavidade e tratados com inibidores após 24 horas de crescimento. Em 96 horas após o plaqueamento, a viabilidade celular foi calculada por cento em relação ao controlo medindo a absorvância a um comprimento de onda de 570 nm. As células tratadas com tivantinib só foram expostos durante 24 horas, após o qual o fármaco foi removido. As células foram então lavadas e incubadas durante um período adicional de 72 horas tal como descrito por investigadores anteriores [12].
Preparação de Lisados Celulares e Western Blotting
As células foram cultivadas e lisadas, como descrito anteriormente [36] , [37] em tampão contendo Tris 20 mM (pH, 8,0), NaCl 150 mM, glicerol a 10%, NP-40 a 1%, 0,42% NaF, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, e um cocktail inibidor de protease de 10 mM (Sigma-Aldrich). Os lisados celulares foram separados por 7,5% ou 10% SDS-PAGE sob condições redutoras. As proteínas foram então transferidas para membranas de imobilização (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As membranas foram então sondadas com os anticorpos acima mencionados. As manchas foram visualizadas utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) e quantificação de proteínas de modulação diferentes foi realizada utilizando o software ImageJ NIH.
fosforilação específica de c-Met /EGFR e outras vias de sinalização através HGF /EGF e a sua inibição
As células foram privadas de factores de crescimento por incubação durante 24 horas em meio isento de soro contendo BSA a 0,5% com ou sem inibidores. Após o tratamento, as células foram estimuladas com 40 ng /mL de HGF durante 7,5 minutos, ou 5 ng /mL de EGF durante 5 minutos a 37 ° C. Depois de preparar lisados, transferência de Western foi realizada como descrito acima.
Imunofluorescência
10000 células foram plaqueadas em lâminas de câmara de vidro (Lab-Tek, Scotts Valley, CA) e deixadas a aderir durante 24 horas em meio isento de soro com 0,5% de BSA. As células foram então tratadas com EGF durante 15 minutos, fixado com 1:01 de acetona: metanol e visualizados com p-EGFR (Y1068) anticorpo primário, anti-coelho DyLight 488 (verde) anticorpo secundário (Thermo Fisher Scientific) e corante Hoechst para nuclear coloração (azul) usando uma fluorescente microscópio Zeiss Axio Observer Z1. software ImageJ NIH foi usado para medir a intensidade de fluorescência celular total de mais de 8 campos microscópicos por condição e os valores foram a média.
DNA Sequencing
5 milhões de células foram plaqueadas em placas de 150 mm de diâmetro e deixadas aderir e crescer em meio, como descrito acima. O DNA foi extraído usando o Qiagen DNeasy® Blood Tissue kit (Cat. no. 69504) seguindo as instruções do fabricante. A PCR foi então realizada para amplificar exões 18-21 de EGFR utilizando os iniciadores descritos por Paez et al [38], usando o AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems, cat. N. 4327058). Os produtos de PCR foram purificados utilizando o Kit de Purificação de PCR GeneJET ™ (cat. No. K0701) e foram então sequenciados na facilidade Universidade de Illinois ADN Serviços.
A análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas usando SPSS 17.0 software. medidas repetidas de ANOVA com múltiplas comparações de pares e personalizado contrasta com os ajustes de Bonferroni foram realizadas. A significância estatística foi determinada com α de 0,05. Para confirmar as diferenças entre tratamentos
t
-test também foi usado um Student bilateral emparelhado. Para todas as análises, um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Criação de linhas de células resistentes aos medicamentos
Para identificar concentrações adequadas de SU11274 , erlotinib e uma combinação de ambos os inibidores da tirosina quinase para o desenvolvimento de linhas de células resistentes, as linhas de células H2170 e H358 foram tratados com concentrações progressivamente crescentes de SU11274 (2,5-17? M) [1], erlotinib (0. 5-14 uM) [39 ], ou ambos SU11274 (1,25-13,5 ^ M) e erlotinib (0,25-9 ^ M) durante 96 horas. linhagens de células H2170 e H358 foram selecionados porque eles não têm mutações TK EGFR ou c-Met. IC
50 valores para TKI individuais ou numa combinação foi determinada para cada linha celular (Tabela 1). As células foram então tratadas com concentrações crescentes de SU11274 [1], erlotinib [39] ou uma combinação de várias semanas, após o que cinco clones resistentes individuais foram isoladas a partir de células individuais, expandida e, em seguida, verificada a resistência estável após cada passagem em série (uma vez por semana ) [40]. As células resistentes foram cultivadas na ausência de inibidores da tirosina quinase durante 12 passagens (12 semanas) e foram encontrados para manter a resistência. Os clones resistentes a partir de linhas celulares descritas na Tabela 1, com IC
50 concentrações (determinada como descrito na secção de materiais e métodos) 4-5 vezes maior para SU11274, 11-22 vezes maior para erlotinib, e 6-8- vezes maior para SU11274 e 15-30 vezes maior para erlotinib em combinação, foram isoladas e seleccionadas para mais estudos. concentrações mais baixas eram necessárias para a resistência combinação, uma vez que observamos efeitos do erlotinib e SU11274 reforçada quando eles foram usados em combinação. Foram obtidos resultados semelhantes com outros clones resistentes (dados não mostrados).
células (SR) SU11274 resistentes exibem diminuição da sensibilidade ao inibidor de c-Met oral, tivantinib
O efeito de tivantinib, um veículo oral com c-Met TKI actualmente em ensaios clínicos [12], [14], sobre a inibição do crescimento celular em células parentais resistentes e foi investigada. As células foram tratadas com concentrações variáveis de tivantinib durante 24 horas, após o que a droga foi removido [12]. As células foram então lavadas e incubadas durante um período adicional de 72 horas e, finalmente, um ensaio de viabilidade MTT foi realizado. Como mostrado na Fig. 1, a 0,1 uM tivantinib, células parentais H2170 foram inibidos em 32% em comparação com as células parentais não tratadas, enquanto que as células resistentes foram apenas inibida por 10% em comparação com células resistentes não tratados (p 0,01). Munshi et ai também mostraram sensibilidade ao concentrações submicromolares de tivantinib em NSCLC como observado nos nossos estudos [12]. Um decréscimo de 3 vezes na inibição foi observada em células resistentes H2170 em comparação com as células parentais (n = 6, p 0,01). Em células tratadas com H358 SR 0,2 uM tivantinib, uma redução de 3,7 vezes na inibição foi observada em células resistentes comparativamente com as células parentais (n = 6, p 0,01) (Fig1B). Estes dados sugerem que as células SR são também resistentes à tivantinib.
H2170 e células H358 foram tratados com tivantinib (0,01-0,4 ^ M) durante 24 horas, tivantinib foi removido, e as células foram incubadas durante 72 horas, após o que ensaio de viabilidade MTT foi realizado. células H2170 SR mostrou uma redução de 3,2 vezes na sensibilidade para o efeito anti-proliferativo de tivantinib a 0,1 uM em comparação com tivantinib células parentais. Uma redução de 3,7 vezes na inibição do crescimento foi também observada em células H358 SR com 0,2 uM tivantinib em comparação com as células parentais. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes, mostrando resultados semelhantes (n = 6, p 0,01).
A mutação secundária T790M não é necessário para a resistência erlotinib
Os resultados de ADN de Sanger seqüenciamento dos produtos de PCR de exons 18-21 de células parentais e resistentes H2170 e H358 não mostrou erlotinib /T790M gefitinib ou resistência D761Y mutações pontuais secundárias [41]. Estes resultados confirmam que as nossas células não ter sabido mutações secundárias que causam resistência. Assim, o mecanismo pelo qual eles são resistentes pode ser devido à sinalização alternativa através de outros receptores do que o EGFR.
Efeito de EGF e erlotinib sobre a fosforilação do EGFR e proteínas de sinalização em dois modelos NSCLC resistentes
para entender o mecanismo de resistência erlotinib, comparamos duas linhas diferentes resistente erlotinib celulares, H2170 ER e H358 ER, com suas respectivas linhas celulares parentais. As células foram tratadas com qualquer diluente, EGF, erlotinib ou EGF + erlotinib. Erlotinib resistentes (RE) H2170 células pareciam exibir EGFR constitutivamente autofosforilada (Y1068) na ausência do seu ligando, o EGF (aumento de 19 vezes), enquanto que as células ER H358 exibiram uma diminuição de 6 vezes na p-EGFR (Y1068) na presença de EGF (Figura 2A). Estes resultados foram confirmados por imunofluorescência que demonstrou um efeito mínimo de EGF na fosforilação de EGFR em células ER H2170. Após o tratamento de +/- EGF, as células parentais e H2170-H2170 ER foram coradas utilizando um anticorpo primário anti EGFR específica de anticorpo fosfo-(Y1068) e DyLight 488 conjugado de cabra anti-rato secundária EGFR fosforilado (verde) e os núcleos foram coradas azul com corante Hoechst. Isto sugere a autofosforilação do EGFR (Fig 2B). Quando as unidades totais de fluorescência foram medidos, um aumento 3.8- e 1,7 vezes na fluorescência foi observada na presença e na ausência do EGF, respectivamente, em células resistentes, em comparação com as células parentais (n = 8, p 0,01). Curiosamente, não houve diferença significativa na fluorescência em células ER H2170 na presença e na ausência de EGF (p 0,01).
. O EGFR é autofosforilada em H2170 ER e regulados negativamente em linhas de células resistentes H358-E4. p-mTOR (S2448) e a sua proteína de sinalização a jusante fosfo-p70S6K (T389) são regulados positivamente em ambas as linhas de células resistentes. As linhas celulares parentais resistentes e H2170 e H358 foram deixados em jejum durante a noite em 0,5% de BSA e em seguida tratou-se com ou sem 7,0 fiM de erlotinib durante 24 horas e as células foram estimuladas com 10 ng /mL de EGF durante 2,5 minutos. Maiores concentrações de erlotinib foram usados uma vez que estas linhagens de células NSCLC têm nenhuma mutação EGFR TK. A autofosforilação do EGFR em Y1068 foi observado na ausência de EGF em células ER H2170 que não foi visto em células ER H358-E4. A sobre-regulação de p-mTOR e a sua proteína a jusante phosho-p70S6K (T389) é vista nas linhas resistentes H2170 +/- erlotinib. células ER H2170 mostram aumento da fosforilação de EGFR +/- EGF. A sobre-regulação de p-ERK (2-5 vezes), também foi observado em células H2170 e H358 ER em +/- erlotinib B. Para confirmar a autofosforilação do EGFR, as células foram plaqueadas em lâminas com câmara, deixou-se aderir durante 24 horas e, em seguida, faminto durante a noite. As células foram então tratadas com +/- EGF durante 15 minutos, fixadas com acetona: metanol e visualizados com p-EGFR (Y1068) anticorpo primário e anticorpo anti-coelho secundário DyLight (Thermo Fisher Scientific) (verde) ou corante Hoechst para marcação nuclear ( azul) em uma fluorescente microscópio Zeiss Axio Observer Z1. Gráfico mostrando unidades totais médios relativos de fluorescência celular por 8 campos microscópicos. Houve um aumento de 3,8 vezes na fluorescência quando comparando parental para células resistentes na ausência de EGF em células H2170.
Estudámos ainda mais o efeito de resistência erlotinib na via mTOR, um regulador chave da o crescimento de células de cancro [42], através da medição p-mTOR e o seu substrato a jusante de p-p70S6K. Em células ER H358 e H2170, a regulação positiva (2-4 vezes) de p-mTOR foi observada na presença de erlotinib (Fig 2A). Além disso, a regulação positiva (duas vezes) de p-p70S6K foi também observada em células H2170 ER e H358 na presença de erlotinib. Além disso, a p-ERK também foi regulada positivamente (2-5 vezes) do ER e em H2170 H358 células na presença e na ausência de erlotinib (Fig 2A). Nenhuma modulação de um total de mTOR, EGFR, p70S6K ou ERK foi observada (Fig S1). Os nossos resultados indicam que a via mTOR e outros receptores pode regular positivamente p-p70S6K mediando assim a resistência através de dois mecanismos separados em modelos NSCLC H358 e H2170.
Efeito do HGF e SU11274 na fosforilação de c-Met e proteínas de sinalização em dois modelos NSCLC
para entender o mecanismo de resistência aos inibidores de c-Met, estabelecemos H2170 SR e SR linhas de células H358 e tratados-los com diluente, HGF, SU11274 e HGF + SU11274. células H358 H2170 e SR SR exibiu uma regulação baixa de 4 e 1,5 vezes de p-c-Met (Y1003), respectivamente, sem alterações em níveis totais de c-Met como analisado por western blot (Fig 3). Downregulation parece ser totalmente independente de qualquer tratamento SU11274 uma vez que a regulação negativa foi observada após seis passagens na ausência da droga. Isto pode indicar que H2170 SR e H358 não utilizam p-c-Met como meio de resistência, o que sugere um mecanismo separado. Semelhante a células ER, em células H2170 SR não tratados, verificou-se uma regulação positiva acentuada (20 vezes) de ácido p-p70S6K, uma proteína a jusante de mTOR que está envolvido na sobrevivência de células de cancro [42], e uma regulação positiva foi observada em células tratadas com HGF e SU11274 (Figura 3). A sobre-regulação de 2 vezes na p-4E-BP1, proteína a jusante de mTOR que promove a tumorigenicidade, foi observado em ambas as células H2170 e H358 SR (Fig 3). Nenhuma modulação de mTOR total de EGFR, p70S6K ou ERK foi observada em ambas as linhas de células (Fig S1). Estes resultados indicam que a via mTOR podem estar envolvidos na mediação da resistência.
As células foram jejuadas durante a noite e depois tratou-se com ou sem 8,0 fiM SU11274 durante 24 horas. As células foram estimuladas com 40 ng /mL de HGF durante 2,5 minutos, após o que análise por Western blot foi realizada. Regulação negativa do p-C-Met (Y1003) foi observada em ambas as linhas celulares. A sobre-regulação de p-p70S6kinase (S371) foi observada em células H2170 SR. A sobre-regulação de p-4E-BP1 (T37 /46) foi também observada em ambas as linhas de células +/- SU11274.
A activação da via Wnt contribui para a resistência de EGFR /c-Met TKI
A via Wnt regula a proliferação celular e desempenha um papel chave no desenvolvimento de cancro do pulmão [43], [44]. Uma vez que a sinalização β-catenina foi mostrado para activar a via de sinalização de ERK [45], examinámos p-ERK (T202 /Y204) e β-catenina activo em resposta a HGF ao longo do tempo nas células H2170 SR. Verificou-se que P-ERK permaneceu elevada durante mais de 120 minutos nas células H2170 SR mas somente durante 30 minutos em células parentais (Figura 4A). Interessantemente, em células não estimuladas, os níveis basais de β-catenina activo (2 vezes) e p-ERK (5,6 vezes) foram maiores e permaneceram elevados durante 120 minutos após o tratamento do HGF em células H2170 SR em comparação com as células parentais após um 60 minutos de incubação (N = 3, p 0,01) (Figura 4A), o que sugere que a interferência da via c-Met, mTOR e Wnt. A seguir ao tratamento com SU11274 e HGF, observou-se um aumento de 3-8 vezes na β-catenina activa na presença e na ausência de células H2170 em SU11274 SR (Fig 4B). A sobre-regulação de 2-3 vezes de p-LRP6 na presença e ausência de SU11274 foi também observada. A sobre-regulação de proteínas associadas com a via Wnt foi confirmada em células ER H2170. Observou-se um aumento de 2-4 vezes e aumento de 3-5 vezes de p-LRP6 na ausência ou na presença de erlotinib, respectivamente. LRP6 fosforilação pode indicar a activação da via Wnt [46]. Observou-se também um aumento de 2-3,5 vezes na expressão de AXIN1, um regulador de LRP6 e, posteriormente, a via Wnt [31] (Fig 4C).
A. Em células H2170 SR, HGF induzida sinalização de p-ERK pronunciada em comparação com as células parentais. As células foram fome de 48 horas e depois estimuladas com 40 ng /ml de HGF. Western blot em H2170 SR indicaram que, de HGF activada p-ERK (T202 /Y204) manteve-se elevado durante 120 minutos em comparação com as linhas parentais. Os níveis basais de β-catenina activa foram também duas vezes maior e manteve-se elevado (3,6 vezes) durante 120 minutos após o tratamento do HGF em células H2170 SR em comparação com aqueles em células parentais mais de 60 minutos de incubação. Estas experiências foram realizadas em triplicado. densitometria relativa de p-ERK /β-actina em células H2170 SR foi descrito que é uma média de três experiências independentes (n = 3, p 0,01). B. Regulação da proteínas na via de sinalização Wnt após o tratamento de H2170 com SU11274. A sobre-regulação de pLRP6 (2-3,0 vezes) e β-catenina (3-8,0 vezes) foram observados em células resistentes H2170 na presença ou ausência de SU11274. C. Regulação de proteínas na via de sinalização Wnt após o tratamento de células H2170 com ER erlotinib. A sobre-regulação de LRP6 (2 a 5 vezes), e AXIN1 (2 a 3,5 vezes) foram observados em células resistentes H2170 na presença ou ausência de erlotinib.
O crescimento de combinação H2170 e H358 células resistentes (CR) são inibidos por everolimus e XAV939
Uma vez que a via mTOR está envolvida em anti-cancro da resistência a drogas [47], a sensibilidade à inibição de mTOR em CR H2170 e linhas de células H358 foi testado. O tratamento com 1 uM inibido everolimus H358 células parentais em 40% e as células resistentes por apenas 20%. Curiosamente, a mesma concentração de everolimus inibiu o crescimento de células parentais completamente e células resistentes em 95%, quando usado em combinação quer com SU11274 (8 uM) ou erlotinib (8 uM) (Fig 5A). Resultados semelhantes foram observados em células H2170 CR (99% de inibição de crescimento, dados não mostrados). Em seguida, testaram o efeito de inibição de Wnt em células resistentes. As linhas celulares parentais e CR H2170 foram tratadas com concentrações crescentes de XAV939 e um ensaio de viabilidade MTT foi realizado. Interessantemente, as células parentais mostrou pouca ou nenhuma resposta aos XAV939, no entanto, as células foram CR inibida de uma maneira responsiva dose (Fig 5B). Além disso, quando foi combinado com XAV939 SU11274 (8 uM) e erlotinib (8 uM), uma diminuição de 85% na viabilidade foi observada nas células CR. Isto sugere que a sinalização de Wnt tem um papel importante em células resistentes.
As células foram tratadas por inibição de crescimento de 96% foi observada quando foi utilizado com everolimus tanto SU11274 e erlotinib. B. células H2170 parental mostrar pouca ou nenhuma inibição quando administrado concentrações de XAV939 crescente. Por outro lado, as células H2170 CR quando tratados com XAV939, foram inibidas de uma maneira responsiva dose. células H2170 CR mostrando inibição 40% de Wnt antagonista XAV939 (10 uM) sozinho, mostrou uma inibição de 85% com a tripla combinação de XAV939, SU11274 e erlotinib (p 0,01). Cada experimento para cada condição de tratamento foi repetido três vezes.
Discussão
Molecularly alvo TKI tornaram-se parte integrante da terapia utilizada pelos médicos para combater anteriormente intratável NSCLC. No entanto, a resistência adquirida a inibidores da tirosina quinase foi severamente limitada na medida em que esta terapia pode ser utilizada de forma eficaz. Ao contrário dos estudos anteriores, que se concentraram em mutações EGFR [8], [48], investigamos alternativa possível vias em linhas de células resistentes aos medicamentos sinalização. Foram estudadas duas linhas celulares de NSCLC modelo que não mostraram a sobre-regulação (H2170) ou a regulação negativa (H358) de p-EGFR e regulação negativa de p-c-Met (H2170 e H358). As células resistentes não exibir ou a T790M ou mutações D761Y, sugerindo a utilização de um mecanismo de sinalização alternativa para vencer a sensibilidade erlotinib. Interessantemente, tanto H2170 e as células resistentes H358 exibir supra-regulação da via mTOR. Além disso, as linhas celulares resistentes H2170 mostrou modulação de ambas as vias de Wnt mTOR e que sugere o seu papel no mecanismo de resistência.
Actualmente nenhuma ligação foi estabelecida entre a resistência de c-Met e TKI de mTOR em NSCLC. No entanto, estudos anteriores sugerem que a inibição da actividade de c-Met quinase conduz à activação reduzida do AKT /via PI3K /mTOR em células transformadas [25]. No entanto, no presente estudo, não se observou a fosforilação de c-Met em H2170 e linhas de células resistentes H358 quando tratados com SU11274. Isto sugere que SU11274, enquanto um inibidor eficaz da fosforilação de c-Met, tem pouco efeito sobre a inibição de mTOR e as suas vias de sinalização a jusante necessários para o crescimento e sobrevivência celular em linhagens resistentes a [25]. Uma vez que as linhas de células resistentes foram mostrados a proliferar na presença de SU11274, sugerimos vias alternativas têm um papel importante em superar a inibição de c-Met e direccionamento molecular adicional pode ser necessário para inibir o crescimento celular. O papel da via mTOR em mecanismos de resistência é evidenciado por um aumento de 2-4 vezes de p-mTOR em células H2170 e H358 resistentes em comparação com as células parentais em resposta ao tratamento com erlotinib. Por outro lado, P-p70S6K, e p-4E-BP1 também são regulados positivamente em linhas de células resistentes, assim, a via mTOR parece estar fortemente activado quando expostos a EGFR /c-Met TKI.