Abstract

Fundo

Relatórios recentes têm sugerido um possível envolvimento de um só objetivo homólogo 2 (SIM2) em cancros sólidos humanos , incluindo câncer de próstata. No entanto, o papel exacto do SIM2 no cancro, em geral, e no cancro da próstata, em particular, permanece em grande parte desconhecida. Este estudo foi desenhado para elucidar o papel do SIM2 no cancro da próstata utilizando uma abordagem baseada em shRNA na linha de células de câncer de próstata PC3.

Métodos

Lentivirus shRNA foram usadas para inibir o gene e proteína SIM2 níveis em células PC3. RT-PCR quantitativo e ADN ramificado foram realizados para avaliar a expressão de transcrição. nível de expressão da proteína SIM2 foi medida por western blot. Profiling da expressão do gene abrangendo todo o genoma, bem como metabolômica polares de várias das principais vias metabólicas foi realizada para identificar as principais desregulações da via.

Resultados

produtos de genes e proteínas SIM2 foram significativamente reprimidos por lenti -shRNA na linha de células PC3. Esta baixa expressão de SIM2 afetados perfil de expressão gênica, revelando mudanças significativas nas principais vias de sinalização, redes e funções. Além disso, as principais vias metabólicas foram afetados.

Conclusão

Em conjunto, nossos resultados sugerem um envolvimento do SIM2 nos traços fundamentais da biologia de células tumorais da próstata e pode subjacentes a uma contribuição deste fator de transcrição para aparecimento de câncer de próstata e progressão

Citation:. Lu B, Asara JM, Sanda MG, Arredouani MS (2011) o papel do Fator de Transcrição SIM2 no câncer de próstata. PLoS ONE 6 (12): e28837. doi: 10.1371 /journal.pone.0028837

editor: Klaus Roemer, Universidade de Saarland Medical School, Alemanha |

Recebido: 26 de agosto de 2011; Aceito: 16 de novembro de 2011; Publicação: 09 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo NIH-NCI Detecção precoce Research Network conceder UO1-CA11391 (M. Sanda) Departamento de Defesa Prostate Cancer Training Award W81XWH-09-1-0626 (B. Lu) e Investigator Award Prostate Cancer Foundation Young (, MS Arredouani ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Single-minded homólogo 2 (SIM2) gene está localizado no cromossoma humano 21q22.2 e é membro das PAS básicos hélice-alça-hélice (bHLH-PAS) da família [per-Arnt-Sim] de factores de transcrição [1], [2]. SIM2 foi originalmente pensado para contribuir para a síndrome de Down (SD) [3]. Como um fator de transcrição (TF), murino SIM2 (mSIM2) medeia a expressão do gene através CNS linha média potenciador (CME) elemento com o seu parceiro ARNT dimerização através ARNT carboxi-terminal [4]. O fator de transcrição c-myb regula SIM2 transcrição em células de glioblastoma, e um sinal de localização nuclear (NLS) medeia a localização nuclear de SIM2 [5].

A antes

in silico

bioinformática abordagem utilizando o Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) do banco de dados do National Cancer Institute (NCI) identificaram SIM2 como associado com cólon, pâncreas e próstata carcinomas, estando ausente nos tecidos normais correspondentes [6]. Duas isoformas de splicing diferentes de SIM2 transcrição, SIM2-longa (SIM2-l) e SIM2 de curto (SIM2-s), têm sido relatados, enquanto sua função diferencial em seres humanos ainda não são conhecidos [1]. SIM2-s foi especificamente expressos em estágios iniciais de câncer de cólon. Inibição anti-sentido de expressão SIM2-s por oligos antimensageiros causou inibição do crescimento e apoptose na linha celular de cancro do cólon RKO e o crescimento do tumor em ratinhos nus e também na linha celular de cancro pancreático CAPAN-1 [7], [8]. A apoptose foi induzida por inibição SIM2-s na linha celular de cancro do cólon RKO [9]. SIM2-S também se verificou ter actividade supressora de tumores em cancro da mama [10]. A capacidade de invasão de glioblastoma foi reduzida significativamente pela inibição SIM2s, consistente com uma diminuição na expressão de metaloproteinase da matriz 2 em ambos os níveis de mRNA e proteína [11].

Descrevemos previamente SIM2 como um biomarcador potencial e imunoterapia alvo para câncer de próstata humana [12]. Embora a expressão SIM2-S (conforme medido por imuno-histoquímica de espécimes de prostatectomia) tem sido associado com a histopatologia agressivo no cancro da próstata, e que sobre-expressam SIM2s ectópicas sobrevivência melhorada em certas condições em células PC3AR + [13], [14], o papel funcional do gene SIM2 na próstata célula cancerosa é em grande parte desconhecido.

neste estudo procurou-se elucidar o papel funcional do SIM2 em CaP usando uma abordagem de silenciamento de genes e caracterização de alterações moleculares e funcionais, tanto de perfil de expressão gênica e perfis metabolômica.

Materiais e Métodos

as linhas celulares

o PC3 humana, linhas de células LNCaP, VCaP e DU145 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas de acordo com o protocolo do ATCC. células PrEC benignos, como descrito em Berger R et al, 2004, foram gentilmente cedidas pelo Dr. W. Hahn no Instituto de Câncer Dana-Farber, Boston, MA.

Transdução de Partículas

O pLKO partículas de transdução de controle lentiviral 0,1-puro, a missão de luciferase de controle shRNA partículas de transdução lentiviral e Missão SIM2 shRNA partículas de transdução lentiviral foram utilizados para infectar linha de células PC3 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

a selecção de amostras, purificação de ARN e a transcrição reversa

Dez amostras de tecido da próstata benigna e catorze radical do tumor foram obtidas e ARNs totais foram processados ​​tal como descrito no nosso trabalho anterior [12]. ARN total da linha celular foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. RNA purificado foi quantificado por NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington, DE). 500 ng de cada RNA total de células foi de transcrição reversa em cDNA utilizando oligo dT e sobrescrito III transcriptase reversa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) sob as instruções do fabricante.

microarrays expressão gênica e análise

250 ng de ARN total foi amplificado utilizando o estojo de amplificação de ARNm MessageAmp II da Ambion. A biotina-UTP foi incorporado durante o dia para o outro no passo de transcrição in vitro de acordo com o protocolo do fabricante. a expressão do gene foi avaliada por meio da Affymetrix (Santa Clara, CA) matriz GeneChip U133 (mais 2,0 chip) matrizes que representam toda a transcrições genoma humano. 15 ng de cRNA foi fragmentado e hibridado com agregados ‘de acordo com os protocolos do fabricante, tal como descrito anteriormente [15]. A qualidade das imagens digitalizadas matrizes foram determinados com base em valores de fundo, por cento presentes ligações, os factores de escala, e 3’-5 ratio de β-actina e GAPDH utilizando os pacotes BioConductor R. O valor do sinal para cada transcrito foi resumido usando o algoritmo de modelagem sinal somente PM com base descrito no dchip. Os PM única base de modelação baseados em algoritmos rendimentos menos número de falsos positivos em comparação com o modelo PM-MM. Desta forma, o valor do sinal corresponde ao nível absoluto de expressão de um transcrito [16]. Estes valores de sinal normalizado e modelado para cada transcrito foram usadas para análise posterior bioinformática alto nível. Durante o cálculo dos valores de sinal expressão modelo base, matriz e valores atípicos sonda são interrogados e imagens spike são tratados como valores extremos de sinal. A detecção de outlier foi realizada utilizando dchip algoritmo de detecção de outlier. Um chip é considerado como um outlier se a sonda, percentual outlier único ou matriz exceder um limite padrão de 5%. Ao comparar os dois grupos de amostras para identificar genes enriquecidas em um determinado fenótipo, se 90% de confiança inferior ligado (LCB) da mudança de dobragem (FC) entre os dois grupos foi acima de 1,2, o gene correspondente foi considerado para ser expresso diferencialmente. LCB é uma estimativa rigorosa de FC e foi mostrado ser a estatística melhor classificação [17] Tem sido sugerido que um critério de selecção de genes que têm um LCB acima de 1,2 mais provável corresponde a genes com uma “real” dobrar alteração de, pelo menos 2 na expressão do gene [18]. Os dados foram extraídos a partir de arquivos CEL e normalizada usando RMAexpress (https://rmaexpress.bmbolstad.com/). Os dados foram analisados ​​usando o software MeV (https://www.tm4.org/mev/)

análise via de sinalização celular

A Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity Systems ®, http: //. www.ingenuity.com) aplicações foram usadas para gerar redes e avaliar estatisticamente relevantes, biofunctions vias canónicos e redes associadas com os perfis de genes diferencialmente expressos extraídos a partir dos dados do transcriptoma.

ADN ramificado e quantitativa PCR em Tempo real ( qRT-PCR)

ramificada de ADN foi realizada para avaliar a expressão do gene SIM2L SIM2s e nas amostras de RNA total da próstata humana e normalizada por 2 genes de controlo e ALSA1 HPRT (QuantiGene Sistema de reagentes 2.0, Affymetrix Inc, Fremont, CA ). Para quantitativa de RT-PCR, 1 ul de cDNA foi usada para cada poço reacções de RT-PCR. As amostras foram realizadas em triplicado. Mistura de PCR TaqMan universal Master (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado para a etapa de dois análise em tempo real de RT-PCR sobre um instrumento da Applied Biosystems 7900HT prisma. tempo real iniciadores de PCR Taqman para GAPDH (4310884E) e SIM2L (hs00231925_m1) foram adquiridos a Applied Biosystems (Foster City, CA). Taqman iniciadores de PCR em tempo real para SIM2s foram projetados por nosso grupo e comprado de Biosearch Technologies (Novato, CA). SIM2s frente primário: 5′-gtgccaagct acgaaggtg-3 ‘; SIM2s iniciador reverso: 5’-acttagaagcagaaagagggcaag-3 ‘; sonda: TCAGGTCTGCTCGTGGGGAAGGTG. Expressão de valor SIM2s SIM2L ou numa determinada amostra foi normalizado para a expressão de GAPDH correspondente. O método 2

-ΔΔCt foi usada para calcular a express relativa do gene SIM2 como descrito anteriormente [19], [20].

transdução Lentivirus e linha de células estável selecção

1,6 X 10 células

4 PC3 foram semeadas em placa de 96 poços e incubou-se durante 20 horas. O meio foi removido e 110 ul de meio fresco contendo brometo de hexadimetrina para uma concentração final de 8 ug /ml foram adicionados. partículas lentivirais foram adicionados a cavidades apropriadas em 5 MOI (multiplicidade de infecção) e incubadas durante a noite. Meio fresco foi então adicionado e as células cultivadas durante 2 dias, seguido por uma cultura de 10-12 dias com puromicina (2 ng /ml) adicionado a cada 3 dias.

transdução transiente foi conseguida através de uma incubação de 3 dias.

Western blot

As células foram lavadas duas vezes com PBS duas vezes antes de serem colhidas por raspagem. Os lisados ​​celulares foram preparados em tampão de lise celular (50 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 20 mM de EDTA, 1% de SDS, e 100 mM de NaCl) contendo um comprimido de mistura de inibidor de enzima (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) e PMSF ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A concentração de proteína foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Um total de 20-50 ug de extracto de proteína foi fraccionado por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Immobilon-P; Millipore). A membrana foi bloqueada com TBS-T (0,1% de Tween 20 em PBS) contendo 3% de leite em pó e incubadas com anticorpo primário SIM2s (Santa Cruz, SC-8715, isoforma NM_009586) durante a noite a 4 ° C. Após três lavagens com TBS-T, a membrana foi incubada com Ab secundário conjugado com HRP durante 1 h e, em seguida, lavada com 0,05% de Tween 20 em PBS. Os complexos imunes foram detectados por métodos ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL).

perfil metabólico usando alvejado líquido-Cromatografia Tandem Espectrometria de Massa (LC /MS /MS)

10

6 células em crescimento exponencial em meio basal com soro dialisado foram colhidas em 3 mL de 80% v /v de metanol de grau HPLC, a temperaturas de gelo seco. o meio fresco foi adicionado 24 horas e 2 horas antes da extracção. O material insolúvel em lisados ​​foi centrifugado a 4000 rpm durante 15 minutos e o sobrenadante (teor de metabolito) resultante foi evaporada utilizando um SpeedVac refrigerado a uma pelete. As amostras foram re-suspensas usando água grau de pureza HPLC de 20 uL para análise por espectrometria de massa. 10 � foram injetados e analisados ​​utilizando um triplo espectrómetro 5500 QTrap de massa de quadrupolo (AB /Sciex) acoplada a um sistema de proeminência UFLC de HPLC (Shimadzu), através de reacção seleccionado monitorização (SRM) de um total de 255 metabolitos solúveis em água endógenos para análises de estado estacionário amostras. Alguns metabolitos foram alvo tanto no modo de ião positivo e negativo para um total de 298 transições SRM. tensão ESI foi + 4900V no modo de iões positivos e -4500V no modo de iões negativos. O tempo de espera foi de 5 ms por transição SRM eo tempo total do ciclo foi 2,09 segundos. Cerca de 8-10 pontos de dados foram adquiridos por metabólito detectado. As amostras foram apresentadas para a MS através de cromatografia de fase normal utilizando um 2,0 milímetros d.i. x 15 centímetros coluna Luna NH2 HILIC (Phenomenex) a 285 ul /min. Os gradientes foram corridos a partir de 85% de tampão B (acetonitrilo grau HPLC) e 42% B a partir de 0-5 minutos; 42% de B até 0% de B a partir de 5-16 minutos; 0% B foi realizado de 16-24 minutos; 0% de B até 85% B a partir de 24-25 minutos; 85% de B foi realizado durante 7 minutos para re-equilibrar a coluna. O tampão A foi composta de hidróxido de amónio a 20 mM /acetato de amónio 20 mM (pH = 9,0) em 95: 5 de água: acetonitrilo. As áreas de pico da corrente total de iões para cada transição metabólito SRM foram integrados utilizando software v1.1 MultiQuant (AB /Sciex).

As medições foram realizadas em triplicata e os dados foram normalizados por número de celular. Apenas os metabolitos que foram determinados em todas as 6 amostras foram mantidas e analisados ​​utilizando MetaboAnalyst [21], [22].

foram analisadas análise estatística

dados de matriz de expressão de gene tal como descrito em Materiais e Métodos. Com base em nosso trabalho anterior [12], testamos para SIM2 regulação positiva em tumores em comparação com os controles com um teste t unilateral e comparada com um limiar de valor-p de 0,05.

Quantitative PCR em Tempo Real (qRT -PCR).

Validação de genes expressos diferencialmente foi realizada por qRT-PCR. 200 ng de amostras de ARN de elevada qualidade foram transcrito reversamente em ADNc e ADNc 1 uL da primeira cadeia foi usado para cada cavidade de reacção de RT-PCR. As amostras foram realizadas em triplicado. SYBR Verde mistura de PCR Master (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado para a etapa de dois análise em tempo real de RT-PCR sobre um instrumento da Applied Biosystems 7900HT prisma. sequências de iniciadores de PCR ‘para genes alvo são mostrados na Tabela S3. As sequências para GAPDH: GAPDH-F (5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 ‘) e GAPDH-R (5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3’). valor da expressão do gene alvo numa dada amostra foi normalizado para a expressão de GAPDH correspondente. O 2 método

-ΔΔCt foi usado para calcular a expressão relativa dos genes-alvo.

Resultados

gene SIM2 é diferencialmente expressos em próstata normal e prostatectomia câncer e linhas celulares

Nós avaliamos a expressão do gene SIM2 em um total de 24 amostras normais e tumorais prostatectomia mostrado na tabela 1. uma vez que existe gene SIM2 em duas isoformas, SIM2 curtas (SIM2s) e SIM2 longa (SIM2L), confirmou-se a expressão de ambas as isoformas em ARN extraído de prostatectomia usando técnicas de DNA ramificado (Figura 1A . 1B). SIM2s e SIM2L mostrou sobre-expressão significativa em amostras de tumor quando comparados com amostras benignas, com p 0.000003 e p 0,00005, respectivamente. No entanto, a razão entre a SIM2s SIM2L expressão houve diferença entre benigno e tumor (Tabela 1, t-teste com p = 0,85). A expressão SIM2s e SIM2L foram 7,03 e 6,95 vezes superior, respectivamente, nos tumores comparando as médias dos dois grupos depois de um ajustamento de log para assegurar a normalidade e variância constante dentro de cada grupo. Expressão de SIM2s e SIM2L também foi avaliada em quatro linhas celulares de cancro da próstata humana, PC3, LNCaP, DU145 e VCaP, e na linha de células epiteliais da próstata PrEC normais. Ambas as isoformas SIM2L SIM2s e foram altamente expresso em células de capnografia, enquanto houve um nível moderado de expressão em células PC3 e uma expressão muito baixa em DU145, LNCaP e células PrEC (Fig. 1C). Porque há apenas alguns anticorpos disponíveis para SIM2, só temos sido capazes de identificar claramente a curto isoforma da SIM2 (SIM2s) em extratos de proteínas celulares por Western Blot. Esta escassez de anticorpos complicado a nossa tarefa de estudar a função do SIM2 isoforma longa. O nível de expressão da proteína SIM2s foi consistente com a sua expressão de genes em linhas de células normais e de cancro da próstata. (Fig. 1D).

Expressão quantitativa do SIM2 isoforma curta (A) e SIM2 isoforma longa (B) foram avaliados pela técnica do DNA ramificado em 10 normais e 14 espécimes de prostatectomia câncer humanos. Os dados foram quantificados usando ALSA1 e HPRT como os normalizadores. (C) Quantificação de expressão dos SIM2 isoformas curtas e longas na próstata humana linhas de células normais e cancerosas por tempo real RT-PCR. Os dados foram quantificados pela

método ΔΔC T e normalizadas para GAPDH. Coluna em branco representa SIM2 isoforma curta e coluna em cinza representa SIM2 isoforma longa. (D) Western blot foram realizadas em linhas de células da próstata normais e cancerosas para SIM2s.

Silenciando expressão SIM2 em células PC3

Para alcançar a maior infra-regulação da expressão de SIM2 usando lentivírus shRNA, nós selecionamos a linha de células PC3 como um modelo. células PC3 foram transduzidas com cinco vectores de expressão de SIM2 shRNA diferentes, quatro dos quais (shRNA48, shRNA49, shRNA50 e shRNA51) mostrou efeito inibidor significativo em relação ao controle shRNAs. Mais de 80% de silenciamento de expressão de genes foi conseguida utilizando shRNA51 (Fig 2A . B). Duas linhas de células de controlo foram gerados utilizando quer um vector expressando estavelmente luciferase shRNA segmentação ou um vector vazio. Um padrão inibidora semelhante foi observado para a expressão do gene SIM2L nestas linhas celulares PC3 estavelmente infectadas. Do mesmo modo, eficiente silenciamento transiente de SIM2S e SIM2L foi conseguida em PC3 (Figura S1).

em tempo real de RT-PCR foi realizada em triplicado (A) e a expressão da proteína foi avaliada por Western blot (B). Controle 1: Luciferase shRNA vetor, Controle 2: PLKO vetor. sh48, sh49, SH50, SH50, SH51 e SH52: vectores que expressam shRNA alvo gene SIM2 em diferentes sites. Coluna com “*” representa regulação negativa significativa da expressão do gene por SIM2 shRNA comparando a ambos controle 1 e controle 2 (P 0,05).

Impacto de SIM2 silenciamento de um gene do perfil de expressão em células PC3

Apesar do seu papel suspeita de câncer, muito pouco se sabe sobre a contribuição do factor de transcrição SIM2 à regulação da expressão genética [23]. Estudámos, portanto, os efeitos da regulação negativa da SIM2 em células cancerosas da próstata. Para este fim, o shRNA que produziu a maior taxa de silenciamento de SIM2, isto é shRNA51, foi seleccionado. células PC3 tratadas com shRNA51 foram comparados a um controle shRNA (shRNAc).

perfis de PC3 SIM2 expressão Gene

linhas celulares de baixa e PC3 controle foram avaliados usando um array Affymetrix GeneChip U133 (mais 2,0 chip) que consiste em 52.000 transcrições de transcrições de genomas humanos completos. A Figura 1 é um mapa de calor que mostra a desregulação do gene após derrubar a expressão de SIM2 em células PC3. A expressão de um grande número de transcritos exibiu uma alteração de pelo menos 2 vezes (Figura 3A e Tabela S4). Pathway Analysis revelou que muitos transcritos altamente expressos diferencialmente representam genes que pertencem a caminhos de sinalização conhecidos, tais como a via PI3K /AKT vias de sinalização (Figura 3B), cujo envolvimento na tumorigénese é bem documentada [24], [25] e PTEN. genes específicos envolvidos em cada via de sinalização são mostrados na Tabela S1. Entre estes genes, CCL5, MAPK1, P38, ERK e DDR1 desempenhou um papel central na rede via (Figura 4). Os genes desta rede ter sido envolvido na morte celular, metabolismo, desenvolvimento celular, e apresentação de antígenos tumor. Mais genes envolvidos nas redes maiores de pontuação são mostrados na Tabela S2. Outras análises mostraram que um número de funções biológicas importantes são desregulados seguinte SIM2 silenciamento (Figura 3C). Curiosamente, várias funções celulares relacionadas ao metabolismo, como o metabolismo de drogas e doença metabólica, estão entre os principais classificados funções.

A. Controlo A: PC3 luciferase shRNA; Controle B: PC3 PLKO vector; SIM2 C: sh48 SIM2; SIM2 D: SH51 SIM2. expressão dos genes foram para cima ou para baixo superior a 2 vezes o SIM2

baixo foram listados. B. Top desregulado vias de sinalização no SIM2

células de baixa PC3. C. Top desregulado funções celulares em SIM2

células PC3 baixos.

Esta rede continha 16 genes focais com uma pontuação de 29. As formas diferentes do nó representam diferentes grupos de genes de foco. A intensidade da cor nó indicado o grau de cima (vermelho) e baixo nível de expressão do gene (verde). As funções principais desta rede são movimento celular, tráfico de célula imunológica, lesão do organismo e anormalidades.

Validação por RT-PCR de um grupo de genes diferencialmente expressos (Tabela S3) parcialmente confirmada a nossa análise in silico transfectante de células PC3 estável e transiente (Figuras 5 6)

validação qRT-PCR de ARNm de níveis de expressão de genes individuais foi realizada por meio de dois passos em tempo real a análise de RT-PCR em Applied Biosystems 7900HT prisma. instrumento. *, P 0,05; **, P 0,01; *** P 0,001. As medições foram realizadas em triplicado e os dados apresentados como a média ± DP.

validação qRT-PCR dos níveis de expressão de genes individuais de ARNm foi realizada por dois-passo análise em tempo real de RT-PCR em Applied Biosystems 7900HT instrumento de prisma. *, P 0,05; **, P 0,01; *** P 0,001. As medições foram realizadas em triplicata e os dados apresentados como média ± SD.

PC3 SIM2

células de baixa mostraram alterações importantes em seu perfil metabólico

Nós procurou determinar se as mudanças de expressão gênica resultar em mudanças significativas nas vias metabólicas em PC3 SIM2

células de baixa. Este foi dirigida medindo 255 metabolitos polares utilizando espectrometria de massa alvo (LC /MS /MS). Comparação do perfil metabólico das células de controlo de células-SIM2-tratados shRNA mostrou mudanças significativas em várias vias metabólicas e a produção de metabolitos 39 (Tabelas 2 3). A via metabolismo das purinas foi o top uma via desregulada com níveis de 11 metabólitos significativamente para cima ou para baixo-regulado fora do total de 92 metabólitos nesta via no SIM2 silenciando as células PC3. via do metabolismo pirimidina listado como o segundo caminho desregulado com 6 de um total de 60 metabolitos com níveis alterados significativa (Tabela 2, Fig. 7). As alterações significativas no metabolismo do ácido nucleico pode indicar o seu importante papel no desenvolvimento do cancro da próstata.

metabolitos foram extraídos do SIM2

células normais baixos e PC3 utilizando-se metanol e a abundância de 239 metabolitos foram medidos usando alvo LC /MS /MS. Os dados foram analisados ​​usando o software MetaboAnalyst. As vias metabólicas organizadas de acordo com a pontuação da análise de enriquecimento (eixo y) e da análise de topologia (eixo X). medições em triplicado foram realizadas.

Discussão

Em nossos esforços de identificação de biomarcadores anteriores, identificamos SIM2 como um potencial biomarcador para CaP. Graças à sua sobre-expressão em tumores da próstata e a sua expressão altamente restringido em seres humanos, propôs-se utilizar SIM2 como um alvo da imunoterapia e foram capazes de identificar 5 HLA-A2.1, epitopos imunogénicos derivados SIM2-[12]. No presente estudo, nós tentativa de caracterizar o papel da SIM2 no cancro da próstata usando uma abordagem de silenciamento induzido curto hairpin RNA de genes em células PC3 como um modelo. Estamos focados em perfilar tanto o transcriptoma e metaboloma em SIM2

células baixas e normais PC3, e avaliou o impacto da SIM2 silenciamento sobre a sinalização celular e função.

A isoforma SIM2s foi relatado para ser expresso em cólon , tumores do pâncreas, da próstata e estando ausente nos tecidos benignos correspondentes [8]. Descobrimos que genes SIM2 são detectáveis ​​em todas estas células cancerosas da próstata por PCR em tempo real. No entanto, os níveis de expressão em DU145 e LNCaP são relativamente mais baixos do que outras células cancerosas da próstata, enquanto as células PC3 expressar nível moderado de genes SIM2 que são consistentes com outro relatório [14].

Todo o espectro de regulação da expressão gênica por o fator de transcrição SIM2 é ainda pouco definido. O nível de regulação pode ser refletida pela expressão diferencial de cerca de 200 genes como revelado através de perfis de PC3 SIM2

células de baixa expressão do gene. Outros grupos têm relatado genes específicos que são reguladas pela SIM2. Os únicos 2s espírito fatores de transcrição bHLH /PAS foi relatado para promover a glândula mamária diferenciação lactogênica pela regulação da expressão Csn2 [26]. SIM2 regula a expressão de MMP-2 e TIMP-2, que dirige o seu papel em células de glioblastoma [11]. SIM2s reprime BNIP3, um gene pró-apoptótico, através do seu elemento de resposta de hipoxia em células PC3 [14]. Nosso perfil de expressão gênica em PC3 SIM2

células de baixa mostrou alteração significativa no PTEN, PI3K /AKT e receptor Toll-like (TLR) vias que estão envolvidos em grande parte na progressão tumoral sinalização. PTEN controla negativamente a via de sinalização de PI3K para o crescimento e sobrevivência celular por desfosforilação da posição 3 de fosfoinositidos [24], [25]. TLR regula a proliferação e sobrevivência celular central e moléculas de sinalização activadas por mitogénio proteína quinase (MAPK) e PI3K desempenham um papel chave [27]. Os nossos dados mostram que a inibição do gene em células PC3 Sim2 afecta a expressão de vários genes que codificam para proteínas que estão organizadas em torno de uma rede de p38MAPK. Estas proteínas, que incluem CCL5, MAPKs, ERK e DDR1 (Figura 4), ter sido referida como estando envolvida no desenvolvimento do tumor. A quimiocina CCL5 foi relatado para ser expresso pelas células da próstata e afectar o seu crescimento e sobrevivência. Após a activação de p38 MAPK e ERK1 /2 em células LNCaP, a expressão de CCL5 aumenta, resultando em proliferação celular aumentada [28], [29]. proliferação de células PC3 e invasão foram também significativamente suprimida após DDR1 knockdown por siRNA [30], [31].

Nossos dados RT-PCR revelou discrepâncias entre silenciamento transiente e estável de SIM2 em células PC3. Isto pode ser um resultado de 1) a existência de duas isoformas de SIM2 que são silenciados em graus diferentes em ambas as configurações, ou 2) SIM2 podem regular a expressão de genes de outros genes, quer directa ou indirectamente.

Análise de função igualmente revelou que três funções relacionadas com o metabolismo celular tinha sido desregulado nos PC3 SIM2

células de baixa. Isto sugeriu que SIM2 pode ter consequências metabólicas. Nós avaliamos a produção por células PC3 de 255 metabolitos que englobam um grande número de vias metabólicas humanos. Destes, os dados foram obtidos para 239 metabolitos. Nossa análise revelou alterações significativas em metabólitos que constituem vias importantes, como as de purina e pirimidina vias.

Supressão do SIM2 isoforma curta (SIM2s) por oligonucleotídeos antisense reduziram o crescimento do tumor em células de câncer de cólon e induzida CAPAN-1 pancreático morte celular através de apoptose [7], [8], [9]. SIM2s também foi relatado para ser um biomarcador agressiva do cancro da próstata, uma vez proteína SIM2s foi associado com o aumento do antigénio pré-operatória da próstata soro específico (PSA), alto grau histológico, o crescimento tumoral invasivo e aumento da proliferação de células de tumor [13]. Um estudo recente mostrou que SIIM2s pode atenuar processos de morte celular através da repressão BNIP3 em células PC3AR +. No entanto, knockdown de SIM2s no cancro da mama células MCF-7 aumentou tumorigênese e, assim, mostraram atividade tumor supressor [32], [33]. A maioria dos estudos anteriores voltados para os SIM2s por qualquer intrusão ou knockdown de SIM2s, nos falta dos dados que esclareçam o papel funcional da proteína SIM2 incluindo ambas as suas isoformas. O nosso estudo relatado um papel combinado de ambas as isoformas da SIM2 implicados na célula de cancro da próstata. Distinguir os papéis de SIM2s e SIM2L pode ter mais profundo significado para compreender o papel funcional do SIM2 na progressão do cancro da próstata, que é o nosso próximo passo para descobrir mais importância deste gene.

Informações de Suporte

Figura S1 .

silenciamento transiente de SIM2s e expressão SIM2L em células PC3. células PC3 foram transduzidas ou com um controlo (Ctrl) ou shRNA51 (SH51) e cultivados na presença de puromicina durante 3 dias. em tempo real de RT-PCR foi realizada em triplicado para avaliar a expressão do gene de (painel superior) e SIM2 s SIM2L (painel inferior)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s001

(TIF)

tabela S1. Tours A top Pathways desregulado de sinalização na SIM2

células de baixa. vias canônicas Top desregulados foram identificados através de análise de dados de genes diferencialmente expressos, usando o pacote Ingenuity Pathway Analysis

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s002

(DOC)

Tabela S2.

as moléculas no mais alto Networks marcar em SIM2

células de baixa. Os dados que representam genes diferencialmente expressos foram submetidos ao pacote Ingenuity Análise Caminho e redes de alta pontuação foram identificados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s003

(DOC)

Tabela S3. : Lista de iniciadores utilizados para a quantificação de RT-PCR da expressão de genes seleccionados. Os iniciadores foram desenhados utilizando o programa Pimer3:. https://frodo.wi.mit.edu/primer3/

doi: 10.1371 /journal.pone.0028837.s004

(DOC)

Tabela S4.

expressões de genes que eram ou para cima ou para baixo-regulado superior a 2 vezes o SIM2

baixo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s005

(XLSX)