Abstract

A proteína tirosina fosfatase localizada na mitocôndria 1 (PTPMT1) é uma fosfatase de dupla especificidade exclusivamente localizada na mitocôndria, e tem recentemente, foi mostrado ser um componente crítico na via biossintética cardiolipina. A regulação negativa da PTPMT1 em células beta pancreáticas foi mostrada para aumentar os níveis de ATP e a produção celular de insulina, no entanto, o papel de PTPMT1 generalizada em células cancerosas não foi caracterizado. Aqui mostramos que a regulação negativa da actividade PTPMT1 é suficiente para induzir a apoptose das células cancerosas. Além disso, o silenciamento de PTPMT1 diminui os níveis de cardiolipina em células cancerosas, enquanto aumenta selectivamente os níveis de ATP em meios glicolítica. Além disso, a regulação negativa subletal de PTPMT1 sinergiza com doses baixas de paclitaxel de promover a morte de células de cancro. Os nossos dados sugerem que a inibição da PTPMT1 causa uma crise metabólica nas células cancerosas que induz a morte celular, e pode ser um mecanismo pelo qual as células cancerosas podem ser sensibilizadas para terapias actualmente disponíveis

citação:. Niemi NM, Lanning NJ, Westrate LM, MacKeigan JP (2013) regulação negativa do mitocondrial fosfatase PTPMT1 é suficiente para promover o cancro morte celular. PLoS ONE 8 (1): e53803. doi: 10.1371 /journal.pone.0053803

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de maio de 2012; Aceito: 05 de dezembro de 2012; Publicação: 10 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Niemi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo número prêmio R01CA138651 do Instituto Nacional do Câncer para JP MacKeigan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as mitocôndrias, mais comumente conhecida como a “força motriz da célula”, contêm proteínas com extensas modificações pós-translacionais, incluindo a fosforilação e acetilação. Estas alterações, por sua vez influenciar a capacidade metabólica, dinâmica, e homeostase global do organelo [1], [2], [3], [4]. A localização de várias quinases e fosfatases dentro das mitocôndrias sugere que a fosforilação é um processo activamente regulado, que desempenha um papel significativo na função da proteína mitocondrial [5], [6]. Apesar de uma ampla catálogo de eventos de fosforilação, bem como as enzimas que podem catalisar a estes eventos, a regulação global dos processos mitocondriais por fosforilação, e a forma como estes eventos influenciar o destino celular, permanece obscura.

PTPMT1 é uma fosfatase de especificidade dual localizada especificamente e exclusivamente para as mitocôndrias [7]. Ele está ancorada no interior da membrana mitocondrial interna com o seu domínio de fosfatase exposto à matriz, colocando-proximal à numerosas enzimas responsáveis ​​pela produção de energia e metabolismo. Curiosamente, no entanto, iniciais

in vitro

estudos utilizando PTPMT1 recombinante indicou que esta enzima tem uma clara preferência por substratos lipídicos sobre substratos de proteínas [8], sugerindo que PTPMT1 poderia influenciar diretamente o compartimento lipídica da mitocôndria. Um estudo recente confirmou esta, demonstrando que as funções PTPMT1 como o fosfato de fosfatidilglicerol de mamíferos (PGP) fosfatase lipídica, catalisando a penúltima etapa da via cardiolipina biossintética [9]. Importante, cardiolipina é sintetizado e utilizado exclusivamente no interior da mitocôndria, e as outras enzimas sintéticas críticas desta via são conhecidos por estar ancorado na membrana mitocondrial interna [10]. Isto coloca PTPMT1 especificamente e selectivamente no local de biossíntese cardiolipina, e sugere que a modulação deste lípido pode ser uma função crítica desta fosfatase.

Perturbações na homeostase cardiolipina foram anteriormente ligados a apoptose. A cardiolipina no interior da membrana mitocondrial interna tem sido demonstrado que se ligam a citocromo C, e foi proposto que a oxidação de lípidos esta é necessária para a libertação de citocromo c cheio e subsequente apoptose mitocondrial-dependente [11]. Além disso, cardiolipina tem sido implicada na orientação das numerosas proteínas pró-apoptóticas para a mitocôndria, incluindo tBID, uma proteína somente BH3 conhecida por induzir a libertação do citocromo c, através da promoção da permeabilização da membrana mitocondrial externa [12]. Como um bloco na apoptose é considerada como sendo uma característica de cancro [13], a desregulação da cardiolipina poderia afectar o potencial tumorigénico de células influenciando a sua capacidade de sofrer morte celular. Além disso, alterações na via biossintética cardiolipina também têm sido associadas a apoptose. knockdown mediada por ARNi da sintase cardiolipina (CLS1; nome do gene da

CRLS1

). é suficiente para a libertação de citocromo c a partir da membrana mitocondrial interna, e sensibiliza as células cancerosas a estímulos apoptóticos [14]

Apesar impressionante homologia entre PTPMT1 e fosfatase outro lípido, PTEN, dentro dos seus domínios catalíticos [8], uma abordagem de triagem química identificado um composto, dicloridrato de alexidina, que é específico para PTPMT1

in vitro

[15]. Alexidina dicloridrato é um composto bisbiguanide inicialmente identificados pelas suas propriedades anti-bacterianas, mas curiosamente também identificados como um indutor de apoptose disfunção mitocondrial e [16]. Como PTPMT1 está localizada especificamente no interior da mitocôndria, alexidina dicloridrato poderia ser modular disfunção mitocondrial e subsequente pro-apoptótica afecta por meio da inibição da actividade da fosfatase PTPMT1.

O papel proposto para a cardiolipina do processo de apoptose normal, juntamente com o robusto de morte celular induzir o fenótipo de dicloridrato de alexidina, levou-nos a hipótese de que a regulação negativa da expressão do gene PTPMT1 induziria um destino celular por apoptose em células cancerosas. Para explorar esta hipótese, utilizou-se RNAi para knockdown PTPMT1 e determinar a consequência da perda celular deste produto de gene específico. Além disso, explorou os efeitos do composto-PTPMT1 segmentação, dicloridrato de alexidina, na sua capacidade de induzir tanto a morte celular em células cancerosas, bem como para sensibilizar estas células a agentes quimioterapêuticos em doses subletais. Aqui, demonstramos que o silenciamento de RNAi-mediada de PTPMT1 é suficiente para induzir a morte de células de cancro. Este fenótipo morte celular está associada a alterações marcantes metabólicas, incluindo uma regulação negativa significativa de cardiolipina após a perda de PTPMT1, bem como um aumento nos níveis de ATP selectivamente em meios contendo glucose. Estes dados iluminar um papel para PTPMT1 como um gene crítico de sobrevivência nas células cancerosas, e sugerem que a segmentação deste fosfatase poderia ser uma forma eficaz de sensibilizar células cancerosas para atualmente quimioterápicos disponíveis.

Resultados

RNAi Knockdown mediada de PTPMT1 Causas Cell Death

Para examinar os efeitos de derrubar PTPMT1 sobre o destino da célula, utilizamos duas sequências de siRNA únicas dirigidas regiões não sobrepostas do quadro de leitura aberta PTPMT1. Cada um destes ARNic fornece knockdown robusta do mRNA transcrito PTPMT1 30 horas após a transfecção, ambos com PTPMT1 siRNAs que dá mais de 98% em relação ao knockdown GAPDH (Figura 1A). Para determinar se estes siRNAs efectivamente interromper a expressão de proteína PTPMT1, determinou-se a capacidade de cada siRNA para derrubar sobre-expresso, proteína FLAG-tag (Figura 1B, painel superior), bem como PTPMT1 endógena (Figura 1B, painel do meio). Estas experiências demonstram claramente o silenciamento de expressão da proteína PTPMT1 48 horas após a transfecção com cada ARNsi.

(A) análise de RT-PCR quantitativa de níveis de ARNm em células HeLa PTPMT1 após knockdown com dois não-sobreposição siRNAs PTPMT1-specfic ou controle de um não-alvo. células (B) HeLa foram transfectadas com dois PTPMT1 siRNAs ou um controlo não segmentação durante 48 h. Numa experiência, foi superexpresso PTPMT1 (com um identificador FLAG) durante 20 horas (tempo total de ARNsi de transfecção de 48 horas) e a expressão foi sondada com um anticorpo FLAG (painel superior). siRNA knock down também foi determinada para PTPMT1 endógena (painel do meio). Tubulina (painel inferior) mostra igual carga de lisados ​​de proteína em todas as pistas. células (C-E) HeLa foram transfectadas com ARNsi de controlo ou PTPMT1 e recolhidas após vezes indicadas, em que a morte celular foi ensaiado por exclusão de iodeto de propídio. As barras de erro indicam o desvio padrão de três experiências. A significância estatística foi calculada utilizando o teste t de Student; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001. células (F) HeLa foram transfectadas com ARNsi de controlo ou PTPMT1 e ensaiadas quanto à viabilidade em tempo real ( 120 horas). utilizando o sistema de xCELLigence

Curiosamente, ambos estes sequências de siRNA causar morte celular após 72 horas de knockdown, que se tornou mais proeminente em 96 e 120 horas pós-knockdown (Figuras 1C-e, F). Para determinar a percentagem de células que sofrem morte celular, foi realizada a análise de FACS de células positivas iodeto de propídio a 72, 96, e 120 horas pós-knockdown siRNA em células transfectadas com ARNsi PTPMT1 ou um controlo não segmentação. Como esperado, as células transfectadas com um ARNsi de controlo não-alvo mostrou pouca morte celular ao longo do período de 120 horas monitorizada, com a morte celular máxima 10,8% observada durante este período de tempo (o que é apenas ligeiramente maior do que as células HeLa basalmente tratados (p = 0,2 -0.9, ns)). Pelo contrário, ambos os siRNA alvejando PTPMT1 causou morte celular robusto, particularmente evidente durante 96 horas (PTPMT1 siARN # 1 P 0,001; PTPMT1 siRNA # 2 P 0,05) e 120 horas (PTPMT1 siARN # 1 P 0,01; PTPMT1 siRNA # 2 p . 0.001), que se mostrou significativa sobre ambas as células não tratadas (0 condição hr, as Figuras 1C-e) e tempo-correspondida controles não-alvo

Para determinar a cinética mais precisas desta morte celular, acompanhámos em tempo real a viabilidade celular por transfecção de células HeLa, quer com um controlo não segmentação de siRNA (azul) ou uma das duas sequências únicas PTPMT1 siRNA (PTPMT1-1, verde; PTPMT1-2, laranja) (Figura 1F). Recapitulando os dados de morte celular iodeto de propídio, ambas as sequências de siRNA começou a diminuir a proliferação celular aproximadamente 72 horas pós-transfecção e promovido descolamento celular significativa (indicativa de morte celular) durante 96 e 120 horas pós-transfecção. Estes dados demonstram que é necessário para a expressão de PTPMT1 viabilidade celular em células HeLa e sugere que PTPMT1 pode ser necessária para a viabilidade em células cancerosas.

PTPMT1 knockdown Provoca Bax /Bak Dependente apoptose

Anterior relatórios têm associado regulação baixa dos níveis de cardiolipina com a libertação de citocromo c e sensibilização à morte celular por apoptose em células cancerosas, bem como cardiomiócitos [14]; [17]. Assim, a hipótese de que o fenótipo morte celular visto em resposta a PTPMT1 knockdown foi uma resposta intrínseca, ou dependentes de mitocondrial, apoptótica. Para determinar se PTPMT1 knockdown induz a apoptose, que ensaiado caspase-3 clivada, bem como a clivagem do seu substrato bem caracterizado, PARP. As Figuras 2A e B demonstram que às 96 horas pós-transfecção, as células transfectadas com um ARNsi não segmentação não mostrar o enriquecimento em qualquer caspase-3 ou PARP clivagem. No entanto, a transfecção com qualquer PTPMT1-siRNA alvejando induziu um enriquecimento robusta, tanto a caspase-3 (Figuras 2C e D) e a clivagem de PARP (Figuras 2E e F). Importante, tanto caspase-3 clivada e pista de clivagem PARP em conjunto nestas experiências, enfatizando o fenótipo apoptótica após PTPMT1 knockdown.

células (A-F) HeLa foram transfectadas com o controle não-alvo siRNA (A, D ), PTPMT1 siARN # 1 (B, e), ou PTPMT1 siRNA # 2 (C, F) durante 96 horas. As células foram recolhidas e coradas para a caspase-3 clivada (painéis superiores) ou PARP clivada (painéis inferiores) sob cada condição, com positividade indicado como um aumento na fluorescência sobre o histograma de FACS (quadrante inferior direito). células (G-I) HeLa foram transfectadas com o controlo, PTPMT1, e /ou BAX /BAK siRNAs durante 96 horas. As células foram recolhidas e coradas para a caspase-3 (G, H) ou positividade iodeto de propídio (I). As barras de erro indicam o desvio padrão de três experiências. A significância estatística foi calculada utilizando o teste t de Student; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001

Enquanto caspase-3 é um marcador da morte celular por apoptose, que é activado em resposta aos dois sinais apoptóticos intrínsecos e extrínsecos.. Para determinar se a apoptose induzida PTPMT1 knockdown-dependente mitocondrial, foram utilizados os siRNAs para knockdown duplamente as proteínas pró-apoptóticas BAX e BAK, cuja expressão é necessária para a apoptose clássica, dependente da mitocondrial [18]. Na presença de um controlo não segmentação normalizada para a concentração de ARNsi, PTPMT1 induzida clivagem de caspase-3 com uma cinética semelhantes como pode ser visto na Figura 2C (Figura 2G). Surpreendentemente, no entanto, Bax /Bak dupla knockdown eliminado completamente a indução de apoptose PTPMT1-mediada (figura 2H). Para assegurar que PTPMT1 knockdown não está a causar uma morte de células não apoptóticas na presença de Bax /Bak knockdown, repetimos estas experiências e as células ensaiadas para positividade iodeto de propídio. Consistente com os nossos dados anteriores, PTPMT1 siRNA causa um aumento na positividade iodeto de propídio sobre um controle não-alvo (Figura 2I, barras azuis). Este aumento da morte celular está completamente bloqueada por Bax /Bak knockdown, que proporciona uma protecção significativa de absorção de iodeto de propidio visto nas células PTPMT1 knockdown (Figura 2I, barras verdes; p 0,01 para PTPMT1 siARN # 1, p 0,001 para PTPMT1 siRNA # 2). Estes dados demonstram que a expressão do Bax /Bak é necessário para a morte celular induzida por PTPMT1, e sugerem que PTPMT1 knockdown induz uma morte intrínseca, dependente da célula apoptótica mitocondrial que é dependente de libertação de citocromo c.

PTPMT1 knockdown Provoca apoptótica a morte celular em várias linhas celulares de cancro

Enquanto os nossos dados mostraram que dois sobrepostos não-siRNAs independentes, alvo-PTPMT1 promover uma morte celular por apoptose em células HeLa, inativação gênica dos PTPMT1 em fibroblastos de rato embrionárias ou células hematopoiéticas tem pouco efeito sobre a viabilidade celular. Nossa hipótese é que a regulação negativa em células transformadas poderia ter um efeito alternativo sobre o destino de células relativas a estas células não transformadas, primários. Para determinar se a perda de PTPMT1 induz a morte celular em apenas um subpainel de linhas celulares (tais como HELAS), ou tem efeitos semelhantes noutras células transformadas, nós escolhemos um painel de linhas celulares de cancro que são altamente passível de siRNA transfecção (todos 95% transfectáveis, dados não mostrados). Estas linhas de células de cobrir uma ampla gama de tipos de tumor (sarcomas e carcinomas); tecidos de origem (osso, cérebro, pulmão e rim); e tumorigenicidade

in vivo

. Semelhante às nossas experiências anteriores, estas linhas de células foram transfectadas com um ARNsi não segmentação ou PTPMT1 siARN # 1 ou # 2. 120 horas pós-transfecção, as células foram recolhidas e analisadas quanto a apoptose através de Anexina V positividade (Figuras 3A do eixo y-C) e iodeto de propídio positividade (eixo dos x, as Figuras 3A-C). Como mostrado nas Figuras 3B e C, a transfecção de ambos os siRNAs PTPMT1 causada robusto aumento na coloração de anexina V e PI, indicando que estes siRNAs causar estas linhas de células a sofrer apoptose. Na maior parte das linhas de células testadas, esta foi uma resposta robusta, com uma 3.8- 3.9- e aumento médio vezes na morte celular que ocorre em seis de oito linhas celulares testadas com PTPMT1 siARN # 1 ou ARNsi # 2, respectivamente (Figura 3D). Descobrimos que 786-0 células renais, a linhas celulares de carcinoma, não foram significativamente afectados pela PTPMT1 knockdown ou com ARNsi (dados não mostrados). Estes dados demonstram que PTPMT1 knockdown provoca a morte celular neste subconjunto de linhas celulares de cancro, sugerindo que a sua expressão é crítica para a sobrevivência destas linhas celulares.

(A-C) A linha celular de carcinoma pulmonar H1299 e o osteossarcoma HOS linha celular foram transfectadas com os não-direccionamento (A), PTPMT1 siARN # 1 (B) ou PTPMT1 siRNA # 2 (C). Após transfecção destes ARNic para 120 horas, a população de células que sofrem morte celular e a apoptose foi medida por meio de propídio positividade iodeto (eixo y) e anexina V positividade (eixo x). (D) Um painel de linhas celulares altamente transfectáveis ​​derivados de muitos tipos de tecidos (ver etiquetas coloridas acima heatmap) foram transfectadas com não-segmentação ou PTPMT1 siRNAs. A morte celular e apoptose foram analisados ​​por iodeto de propídio e anexina V positividade como em (A-C). Fold mudança na apoptose foi determinada através da normalização da morte celular por cento visto em células transfectadas com um controlo não-direccionamento para um, com a mudança vezes reflectindo a quantidade de morte celular superior a este limiar em células knockdown PTPMT1. O mapa de calor mostra uma série de mudanças vezes a partir de 1 (quadrados pretos) para 5+ (cinco ou mais vezes, quadrado vermelho).

A titulação de PTPMT1 Knockdown Altera Efeitos sobre a Viabilidade celular

ARNi titulação tenha sido utilizado anteriormente para determinar um limiar de expressão do gene requerida para a viabilidade celular [19]. Nestas experiências, os oligonucleótidos de siRNA foram diluídas e titulou-se para baixo para um nível nanomolar baixa para compreender o nível de expressão em que um gene deve manter para induzir ou impedir que um destino celular específica, tais como a morte celular. Para compreender mais completamente a morte celular induzida por siARN que tinha visto em células knockdown PTPMT1, que titulada cada PTPMT1 siRNA, bem como um ARNsi de controlo não-direccionamento, e examinaram os efeitos diferenciais destes knockdowns sobre a viabilidade das células HeLa e proliferação. Como esperado, a titulação de um controlo não segmentação de 50 nM até 5 nM teve pouco efeito sobre a viabilidade ou a proliferação de células HeLa capacidade ao longo de um período de tempo 120 horas (Figura 4A, B e os pontos de azul marinho de dados). PTPMT1 expressão foi diferencialmente regulados negativamente por titulação de ambas única PTPMT1 siRNAs, com o aumento da eficiência knockdown como cada concentração de ARNsi aumentou de 5 nM a 50 nM (os dados não mostrados). Curiosamente, a titulação de cada PTPMT1 siRNA alterados os perfis de proliferação e viabilidade das células knockdown PTPMT1; enquanto que 25 a 50 nm de PTPMT1 siARN # 1 ou # 2 é suficiente para induzir o descolamento celular, indicativas de morte celular, de 5 a 10 nM do mesmo ARNip parece interromper a proliferação sem induzir descolamento celular, tal como indicado por um declive neutro sobre o tempo real viabilidade parcelas (Figura 4A, B).

células HeLa (a) foram transfectadas com uma dose-resposta de não-alvo (linha azul), PTPMT1 # 1 (linha verde) ou PTPMT1 # 2 (laranja line) siRNA mais de 120 horas. As células foram transf ectadas com 0, 5, 10, 25, ou 50 nM de cada viabilidade siRNA e em tempo real foi monitorado utilizando xCELLigence. (B) Taxa de variação na impedância celular, refletindo mudanças na proliferação (inclinação positiva) e /ou de viabilidade (inclinação negativa) em células transfectadas com o controle ou siRNAs PTPMT1. A menor taxa de alteração da impedância está associada com a diminuição da adesão celular, indicativa de morte celular. As barras de erro indicam o desvio padrão de três experiências. A significância estatística foi calculada utilizando o teste t de Student; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001

Knockdown de PTPMT1 sensibiliza células cancerosas para subletal doses de Paclitaxel

A observação de que diferenciais níveis de knockdown de PTPMT1 mudou o destino da célula cancerosa levantou a possibilidade de que. knockdown sub-óptima de PTPMT1 (para um nível não é suficiente para induzir a apoptose) podem sensibilizar células de cancro aos baixos níveis de quimioterapêutico que de outra forma seriam relativamente ineficiente. Para testar esta hipótese, foram transfectadas 5 nM de ARNsi de controlo ou específicas do PTPMT1 em células HeLa, durante 30 horas antes da exposição destas células a concentrações baixas (5 nM) de paclitaxel quimioterapêutico para um período adicional de 24 horas. A Figura 5 demonstra que a transfecção de células HeLa com baixos níveis de siRNA não segmentação não promove a sensibilização a doses baixas de paclitaxel, com 5 nM de paclitaxel induzindo uma redução de 21% na viabilidade celular não segmentação siRNA (Figura 5A). A transfecção de 5 nM PTPMT1 foi suficiente para sensibilizar as células para o tratamento com paclitaxel: enquanto que 21% das células de controlo foram submetidos a morte de células na presença de 5 nM de paclitaxel, 38% ou 57% de 5 células tratadas com siRNA nM PTPMT1 sofreu significativamente mais morte celular sob as mesmas condições (siRNAs 1 e 2, respectivamente; p 0,01 para PTPMT1 siARN # 1, p 0,001 para PTPMT1 siRNA # 2, Figuras 5B e C). Importante, 5 nM de cada siRNA alvejando PTPMT1 não provoca toxicidade celular significativa em 72 horas (Figura 5D, E), demonstrando que a morte induzida por 5 nM PTPMT1 siARN combinada com 5 nM de tratamento com paclitaxel é provável uma interacção sinérgica. Para confirmar estas observações, determinou-se a população de células que sofrem morte celular após a exposição paclitaxel após incubação com 5 nM PTPMT1 siRNA. Embora nem o 0,1 nM ou 1 nM de paclitaxel induz propídio positividade iodeto nas células transfectadas com um não-targeting siRNA (Figura 5F, barras pretas), ambas as doses de paclitaxel aumentar significativamente a população de células que sofrem morte celular após a transfecção com PTPMT1 siRNAs ( Figura 5F, barras cinzentas). No geral, estes dados demonstram que a sub-letal knockdown mediada por ARNi do PTPMT1 é suficiente para sensibilizar células HeLa a doses sub-letais de paclitaxel quimioterapêutico.

células (A-C) HeLa foram transfectadas com 5 nM não -targeting siRNA (a), PTPMT1 siARN # 1 (B), ou PTPMT1 siRNA # 2 (C) durante 30 horas antes do tratamento com uma resposta à dose subletal de paclitaxel (até 5 nM) durante 24 horas. A viabilidade foi medida usando celular Titer Glo. (D) Viabilidade de células HeLa não tratadas transfectadas com ARNsi em cada 54 horas. (E, F) quantificação da viabilidade das células HeLa (E) ou HeLa morte celular por exclusão com iodeto de propidio (F) com 5 nM não segmentação ou PTPMT1 siRNA (54 h de tratamento total) e 5 nM de tratamento com paclitaxel (24 h de tratamento total) . Para cada experiência, as barras de erro indicam o desvio padrão de três experiências. A significância estatística foi calculada utilizando o teste t de Student; * – P 0,05; ** – P 0,01; . *** – P 0,001

PTPMT1 Knockdown induz significativas alterações metabólicas em células cancerosas

Ao ser identificado como uma fosfatase mitocondrial, função PTPMT1 estava ligado com o metabolismo mitocondrial quando era mostrado que PTPMT1 knockdown provoca um aumento robusto em níveis de ATP celular em células pancreáticas beta [7]. Recentemente, PTPMT1 foi identificado como uma fosfatase chave na biossíntese de cardiolipina, um lípido mitocondrial chave ligada tanto metabolismo mitocondrial e apoptose. Importante, deficiências nos níveis de cardiolipina celulares têm sido associados a apoptose [14], [20], levando-nos a investigar se PTPMT1 knockdown em células cancerosas altera este lípido mitocondrial. As células HeLa foram transfectadas com um não-segmentação ou piscina de PTPMT1 siARN (siARN # 1 + # 2) durante 72 horas, após o que os lípidos celulares foram marcadas radioactivamente, extraiu-se, e resolvido através de cromatograf ia em camada fina. Consistente com os resultados previamente publicados [9], a ablação de expressão PTPMT1 provoca uma diminuição robusta em níveis de cardiolipina em relação a células que expressam um controlo não segmentação (77% de decréscimo, p 0,001, as Figuras 6A e B). Estas alterações na composição do lípido mitocondrial foi demonstrado que alteram a capacidade metabólica das células, com a perda de expressão PTPMT1 resultando num aumento nos níveis de ATP resultantes de uma mudança compensatória a glicólise aumentada [9]. Para determinar se o metabolismo mitocondrial é alterado nas células de knockdown PTPMT1, os níveis de ATP foram medidos nas células que expressam tanto um não-segmentação ou piscina PTPMT1 siARN (siARN # 1 + # 2). Como mostrado na Figura 6C, as células knockdown PTPMT1 têm significativamente mais ATP por célula que as células transfectadas com um controlo não segmentação quando cultivadas em meios convencionais que contêm glucose (40,5% mais ATP /célula, p 0,001). Para determinar se este aumento é dependente do metabolismo da glicose, também realizado nesta experiência em células cultivadas em meio contendo apenas piruvato como fonte de carbono, não permitindo o programa glycolyic a ser engatada. Nestas condições, não há mudança significativa nos níveis de ATP em células knockdown PTPMT1 em relação às células de controlo (10% mais ATP /célula, Figura 6C, p = 0,178). Colectivamente, estes dados sugerem que PTPMT1 knockdown diminui os níveis de cardiolipina em células HeLa, levando a um aumento transitório nos níveis de ATP independentes do metabolismo mitocondrial, o mais provável devido à glicólise aumentada.

(A, B) As células HeLa foram transfectadas com não-segmentação ou um pool de PTPMT1 siRNAs (# 1 + # 2) por 72 horas. As células foram incubadas com lípidos

32P-ortofosfato e radiomarcados foram extraídos e resolvidos por meio de cromatografia em camada fina. A cardiolipina é mostrada como o ponto mais alto trabalhada sobre as placas de TLC (A), e os níveis totais de cardiolipina foram quantificados (B). (C) ATP /célula total foi testada em células transfectadas com um não-segmentação ou piscina PTPMT1 de siRNAs durante 72 horas. ATP /celular foi determinada em células que crescem em ambos os meios contendo glucose altas ou mídias contendo apenas piruvato. As barras de erro indicam o desvio padrão de pelo menos três experiências. A significância estatística foi calculada utilizando o teste t de Student; * – P 0,05; ** – P 0,01; . *** – P 0,001

Alexidina Dihydrochloride Inibe PTPMT1

In vitro induz a apoptose Comprar e em células cancerosas

Uma publicação recente identificou a dicloridrato composto alexidina como um inibidor selectivo da PTPMT1

in vitro

[15]. Nós procurado para validar esses dados usando PTPMT1 recombinante. Como um controlo, também se testou a capacidade de dicloridrato de alexidina para inibir MKP-3, uma fosfatase de especificidade dual com pouca homologia com PTPMT1. Consistente com os dados gerados por Doughty-Shenton et al., Alexidina dicloridrato inibe a actividade de fosfatase de PTPMT1 com um IC significativamente menor

50 do que outras fosfatases, incluindo MKP-3 (2,5 uM para PTPMT1 v. 265 uM para MKP-3 , Figura 7A). Antes da sua identificação como um inibidor específico da actividade de fosfatase PTPMT1, dicloridrato de alexidina tinha sido demonstrado que induzem a apoptose em células cancerosas [21]. Para determinar se alexidina dicloridrato de morte celular induzida no nosso sistema experimental, foi realizada uma experiência simples de resposta à dose em que se expuseram células HeLa a duas diluições em série de dicloridrato de alexidina durante 24 horas. Consistente com o relatório anterior, alexidina dicloridrato promoveu morte celular robusta, com uma CE

50 perto de 2,8 mM (Figura 6B). Mais importante, esta concentração é perto da concentração que inibe especificamente PTPMT1 recombinante

In vitro

, sugerindo que o direccionamento específico de fosfatase esta poderia ser responsável por este fenótipo morte celular.

(A) recombinante PTPMT1 e MKP-3 foram tratados com várias concentrações de dicloridrato alexidina,

in vitro

ensaios de fosfatase foram realizados, e os efeitos resultantes sobre a atividade enzimática medidos. O IC

50 para cada enzima foi calculado e exibido usando SigmaPlot. células (B) HeLa foram tratados com uma dose resposta de dicloridrato de alexidina durante 24 horas e as alterações resultantes na viabilidade celular foram medidos usando Titer Glo. células (C, D) HeLa foram tratados com dicloridrato de alexidina durante 24 horas antes de se medir a morte celular (C) por coloração com iodeto de propídio (C) ou indução de apoptose por coloração com anexina V (D). Para cada experiência, as barras de erro indicam o desvio padrão de três experiências. A significância estatística foi calculada utilizando o teste t de Student; * – P 0,05; ** – P 0,01; . *** – P 0,001

Para confirmar que dicloridrato alexidina foi induzir uma morte celular por apoptose semelhante ao que vimos com PTPMT1 siRNA knockdown, expusemos as células HeLa para uma resposta à dose de dicloridrato de alexidina, determinar quais as concentrações induzir a morte celular (por meio de coloração com iodeto de propídio) e se esta morte celular era apoptótica (por determinação de Anexina V positividade). Estes dados demonstram que existe um aumento dramático na morte de células HeLa entre 2,5 e 5 uM de tratamento alexidina dicloridrato (Figura 7C), o que está de acordo com a curva de resposta à dose inicial. Importante, este desvio para a morte celular é apoptótica, tal como um aumento semelhante em células positivas para anexina V é vista com a mesma resposta à dose (Figura 7D), e é na gama micromolar baixa, o que especificamente alvejado actividade de fosfatase PTPMT1

in vitro

. Estes dados sugerem que o fenótipo apoptose induzida pelo tratamento dicloridrato alexidina poderia ser devido à inibição da atividade da fosfatase PTPMT1.

subletal Doses de Alexidina Dihydrochloride são suficientes para sensibilizar células cancerosas para baixos níveis de Paclitaxel, mas não são completamente dependentes PTPMT1 Inibição

Os nossos dados sugerem que knockdown sub-letal de PTPMT1 pode sensibilizar as células a doses sub-letais de quimioterapêutico sugeriu que as doses sub-letais de dicloridrato de alexidina também poderia resensitize células para quimioterapêutico. Usando as curvas de resposta à dose analisados ​​na Figura 6, que as células HeLa tratadas com uma dose sub-letal de 0,5 uM ou 1 uM de dicloridrato de alexidina durante 24 horas. Importante, nem concentração de morte celular induzida por drogas neste período de tempo (Figura 7B-D). Em seguida, expuseram as células tratadas dicloridrato alexidina, ou células tratadas com apenas veículo de controlo, para uma resposta à dose de paclitaxel durante mais 24 horas antes do ensaio de viabilidade. Ambas as doses de dicloridrato de alexidina foram suficientes para sensibilizar as células a uma vasta gama de concentrações de paclitaxel. Curiosamente, 0,5 uM alexidina dicloridrato não foi capaz de sensibilizar células de forma significativa a doses de paclitaxel abaixo seus sub CE

50 (doses variando 0,01-7,8 nM, Figura 8A). No entanto, em doses mais elevadas, todas as quais excedem 15,6 nM de paclitaxel, alexidina dicloridrato de pré-tratamento é capaz de sensibilizar de forma significativa as células para o tratamento com paclitaxel (15,6 doses nM, P 0,05, para o 31,25-250 nM de paclitaxel, p 0,01, figura 8A). Em comparação, 1 uM alexidina dicloridrato sensibiliza células a paclitaxel em todas as doses examinadas (por dose de 0,01 nM, P 0,05; em todas as outras doses, p 0,001, Figura 8B). Para confirmar estes dados, determinou-se a percentagem de células expostas a níveis sub-letais de dicloridrato de alexidina (0,5 uM ou 1 uM), que coraram positivamente para o iodeto de propídio após o tratamento com 1 nM de paclitaxel. Embora o tratamento de células com um veículo só tem efeitos mínimos com células de controlo expostas a paclitaxel (8,0% v. De morte celular de 8,6%, p = 0,24, NS, Figura 8c), pré-tratamento das células quer com 0,5 uM ou 1 uM alexidina