Abstract

Fundo

Apesar de avanços recentes em análise de DNA circulante permitem a previsão de tumor genomas por meios não invasivos, alguns desafios permanecem, o que limita a introdução generalizada da cfDNA em diagnósticos de câncer. Analisou-se o estado dos dois melhores alterações genéticas e epigenética cancro colorectal caracterizadas (CRC) em uma coorte de pacientes de CRC, e, em seguida, em comparação do grau em que os dois padrões de mover a partir de tecido de plasma, a fim de melhorar a nossa compreensão da biologia modular a concordância entre tecidos e metilação de plasma e perfis de mutação.

Métodos

tecidos tumorais plasma e foram coletados de 85 pacientes (69 ± 14 anos, 56 do sexo masculino).

KRAS Comprar e

SEPT9

estatuto foi avaliada por PCR quantitativa alelo sistema de mutação refractária e PCR específicos de metilação quantitativa, respectivamente. Seis das mutações pontuais mais comuns no códon 12 e 13 foram investigadas para

KRAS

análise.

Resultados

KRAS

mutações e

SEPT9

metilação do promotor estavam presentes em 34% (29/85) e em 82% (70/85) de amostras de tecido de tumores primários. Ambas as análises genéticas e epigenéticas de cfDNA revelou uma alta concordância geral e especificidade em comparação com análises tumor de tecido. Pacientes com alterações tanto genéticas e epigenéticas em amostras de tecido (31,8%, 27/85) foram considerados para análises posteriores. As taxas de metilação medianos em tecidos de tumor e amostras de plasma foram 64,5% (12,2-99,8%) e 14,5% (0-45,5%), respectivamente. A mediana

KRAS

carga mutação (por mutações combinados) foi de 33,6% (1,8-86,3%) em tecidos e 2,9% (0-17,3) em amostras de plasma. O plasma /tecido (p /t) proporção de

SEPT9

taxa de metilação foi significativamente maior do que a proporção p /t de

KRAS

carga mutação, especialmente em cânceres em estágio inicial (p = 0,0108) .

Conclusão

Os resultados deste estudo mostram uma taxa discrepantes de epigenéticas vs. alterações genéticas que se deslocam a partir de tecido de plasma. Muitos fatores podem afetar a mutação análise cfDNA, incluindo tanto a presença de tumor heterogeneidade clonal e estrita compartimentalização da

KRAS

perfil mutação. O presente estudo destaca a importância de se considerar a natureza da alteração ao analisar cfDNA derivado de tumor

Citation:. Danese E, Minicozzi AM, Benati M, Montagnana M, Paviati E, Salvagno GL, et al. (2015) Comparação de alterações genéticas e epigenéticas de tumores primários e amostras de plasma correspondentes em doentes com cancro colorectal. PLoS ONE 10 (5): e0126417. doi: 10.1371 /journal.pone.0126417

Editor do Academic: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Recebido: 11 de fevereiro de 2015; Aceito: 01 de abril de 2015; Publicado em: 06 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Danese et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a prova de que alterações genéticas e epigenéticas tumor específico pode ser detectado em DNA extraído de plasma de pacientes com câncer em circulação tem se mostrado promissora para melhorar o diagnóstico precoce, o prognóstico e acompanhamento da doença. O objectivo global da utilização de DNA livre de células como um biomarcador implica otimização médica prática, o desenvolvimento da medicina personalizada, e melhoria da qualidade de vida, devido à capacidade de invasão mínima de teste de sangue. No entanto, a autenticação de validade clínica real de várias alterações DNA livre de células (cfDNA) como biomarcadores de câncer putativos na prática clínica permanece desafiador [1]. O problema que conduz actualmente representado pelo fato de que os fragmentos de ADN portadores de alterações específicas de tumor circulantes representam uma fracção variável e geralmente pequenas do ADN total em circulação, gerando, assim, uma elevada variabilidade na taxa de concordância entre o padrão de alteração detectável no tecido de tumores primários e correspondentes plasma.

os factores que influenciam a quantitativa, bem como as mudanças qualitativas de cfDNA com relação aos tecidos de pacientes com câncer são muitos e ainda não totalmente explorado até agora. No entanto, os esforços durante a última década levaram a avanços importantes.

Ao avaliar o padrão de metilação do

gene PCDH10

no tecido e no plasma de pacientes com câncer colorretal (CRC) temos demonstrado recentemente que a taxa de metilação detectado no plasma aumentou com a taxa de metilação aumentada em tecidos tumorais apenas na cânceres em estágio inicial, ao passo que esta correlação foi aparentemente perdido em cancros avançados. Além disso, mostrámos que o grau de metilação cfDNA foi associada com algumas características de cfDNA, tais como a sua concentração e integridade, e que estas correlações variaram em força e direcção em paralelo com o estádio do tumor [2].

nos últimos dois anos dois grupos de investigação independentes mostraram que a possibilidade de detectar tumores cfDNA específico no plasma de pacientes de CRC depende em grande parte a sensibilidade do método baseado em PCR para sequências mutadas curtas [3-5], enfatizando assim a importância de minimizar o comprimento de ensaio quando se analisa altamente fragmentado cfDNA, como no cenário de pacientes com câncer.

heterogeneidade intratumoral e evolução clonal durante a progressão são outras questões que complicam o uso de cfDNA como biópsia líquida para o câncer, já que ambos os fatores geram notável diferenças na proporção e padrão de aberrações detectáveis ​​no tumor primário e circula DNA [6,7].

de acordo com esta evidência, os diferentes aspectos técnicos e biológicos devem ser considerados quando se analisa a concordância variável entre as alterações dos tecidos e plasma em pacientes com câncer, não menos importante, a natureza das alterações subjacentes.

aberrações

alterações Ambos epigenéticas e genéticos são bem conhecidos envolvidos na carcinogênese colorretal. Dado o seu enorme potencial como biomarcadores no CRC diagnóstico, estadiamento, prognóstico e resposta ao tratamento, eles têm sido amplamente estudados na última década. No entanto, uma comparação crítica de seu estado de tecido e cfDNA está faltando. Portanto, este estudo teve como objetivo analisar o estado das duas alterações genéticas e epigenéticas melhor caracterizados de CRC (ou seja,

KRAS

mutação e

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metilação do promotor) em uma coorte de pacientes com CCR, a fim de melhorar a nossa compreensão dos aspectos biológicos que modulam a concordância entre tecidos e metilação de plasma e perfis de mutação. Então, nós também comparou o grau em que a genética e os padrões epigenéticos mover a partir de tecido de plasma.

Material e Métodos

Pacientes e amostras

A coorte de estudo incluiu 85 pacientes consecutivos submetidos à cirurgia para CRC no Hospital da Universidade de Verona (Itália) entre janeiro de 2010 e dezembro de 2010. as amostras de sangue foram coletadas antes da ressecção cirúrgica. As amostras de tumor foram obtidas durante a cirurgia, imediatamente congelado em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. O diagnóstico histológico e estágio do tumor foram avaliados de acordo com o sistema de classificação de 2000 da Organização Mundial da Saúde (OMS) para os tumores do aparelho digestivo e American Joint Committee on Cancer sistema (AJCC) estadiamento, respectivamente [8]. Apenas os pacientes com adenocarcinomas colorectais primários não tratados com quimioterapia neoadjuvante rádio-foram incluídos no estudo. Todos os indivíduos deram uma autorização por escrito para serem registadas nesta investigação. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local (Departamento de Vida e reprodução Ciências da Universidade de Verona) e realizado de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975. As informações clínicas foram obtidas nos registros médicos.

isolamento de DNA a partir de plasma e amostras de tecido

As amostras de sangue foram coletadas em 7 tubos de ml de EDTA e processado dentro de 1 h após a coleta. Após dupla centrifugação (800 g durante 10 minutos a centrifugação, seguido por separação e uma segunda 1600g durante 10 minutos a centrifugação), o plasma foi separado, armazenado em alíquotas e congeladas a -80 ° C até processamento. O DNA foi extraído a partir de plasma e cortes de tecido fresco congelado utilizando o kit midi QIAamp DNA do sangue e do Kit Gentra Purgene (Qiagen, Hilden, Alemanha), respectivamente.

concentração cfDNA e Integridade índice

cfDNA fragmentação foi avaliada calculando o índice de integridade do DNA, como previamente descrito [2]. Em resumo, foi determinado através do cálculo da proporção de maior (247 pb) em comparação com (115 pb) alvos mais curtas da sequência de consenso da ALU humano repete. O resultado ALU-qPCR obtidos com iniciadores ALU115 também foi utilizada para quantificar o ADN total.

PCR específica de metilação (MSP)

ADN genómico purificado extraído de tecidos e o plasma foi submetido a tratamento com bissulfito e ADN utilizando o kit de purificação Epitect bissulfito (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Um protocolo detalhado foi previamente relatada noutro local [2].

Bissulfito-modificado ADN foi usado como molde para PCR em tempo real quantitativo usando um MSP verde à base de Sybr. Primers para MSP foram concebidos para amplificar especificamente, quer uma, cadeia não metilado sensível ao bissulfito ou, um fio resistente ao bissulfito metilado na região promotora do gene

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. O MethPrimer software baseado na web (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) foi usado para selecionar uma ilha específica CpG, que foi encontrado recentemente como os mais vulneráveis ​​às mudanças de metilação na sequência adenoma-carcinoma [9] .

as sequências dos conjuntos de iniciadores foram os seguintes:

M-Fo: TTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAC

M-Rev: AAAATCCTCTCCAACACGTCCG

U Fo: TAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG

U- Re: CAAAATCCTCTCCAACACATCCAC (M: metilado, U: não metilado).

O CpGenome Universal metilado DNA (Chemicon, Millipore Billerica, MA, EUA) foi utilizado como 100% metilado (positivo ) de controlo, ao passo que o ADN extraído a partir de células mononucleares do sangue periférico de indivíduos normais foi utilizado como controlo não metilado (negativo)

A mistura de reacção PCR foi preparada em um volume final de 20 ul, que consiste nas seguintes concentrações:. 0,375 uM de iniciadores directos e inversos, 250 uM de cada dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), 1 × HotStart buffer (Qiagen), MgCl2 2,5 mM, 1,5 unidades HotStart polimerase (Qiagen), 2 uM SYTO 9 (Invitrogen, vida Technologies, Carlsbad, CA), e 1 × ROX corante de referência (Invitrogen), 3 ul de ADN modificado com bissulfito.

A amplificação por PCR foi realizada com precycling activação térmica da polimerase de ADN a 95 ° C durante 10 min , seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 64 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 30 seg. Um ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) foi utilizado.

O produto de PCR foi passado em gel de agarose a 2% para confirmar o tamanho do produto e a especificidade da PCR, e, em seguida, visualizado sob Luz UV. Uma banda de 110 pb foi considerada como diagnóstico de estado de metilação, enquanto que uma banda de 114 pb foi considerada como diagnóstico de estado unmethylation.

análise de mutação KRAS

ADN extraído de amostras de tecido e de plasma foi submetidos a um sistema de mutação refractária alelo qPCR (ARMS-qPCR) para a detecção de seis das mutações mais comuns nos códons 12 e 13 do

KRAS

gene (G12a, G12D, G12V, G12S, G12C e G13a ). O DNA foi amplificado numa mistura reaccional de 25 ul contendo 0,25 uM de cada iniciador de amplificação, 200 uM de cada dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), 1 × HotStart Buffer (Qiagen, Hilden, Alemanha), 2 mM MgCl

2, 2 unidades de polimerase HotStart (Qiagen, Hilden, Alemanha), 2 | iM SYTO 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), um corante de referência × ROX (Invitrogen) e 25 ng de ADN. As sequências iniciadoras foram previamente descrita [10], com a excepção de o iniciador inverso comum que tem sido re-concebida de forma a encurtar os amplicões de ambos codão 12 (90 pb) e o codão 13 (85 pb) (originalmente de 149 e 144 bp de comprimento). A sequência resultante foi a seguinte:. TGTTGGATCATATTCGTCCACA

A amplificação por PCR foi realizada com precycling activação térmica da polimerase de ADN a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 64 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 30 seg, em um sistema de detecção ABI Prism 7500 Sequence (Applied Biosystems-Foster City, CA, EUA). O produto da PCR de amostras mutantes foi executado em gel de agarose 2% para confirmar a presença das bandas específicas.

Análise quantitativa e desempenho analítico

ciclos limiar (Ct) foram utilizados para calcular a taxa de metilação e carga de mutação em cada amostra, de acordo com a seguinte fórmula:% = 100 /[1 + 2 {Ct

met /Mut-Ct

não satisfeitas /WT}] [2,11]. Ctmet e Ctunmet denotar ciclos limite específico para os estados metilados e não metilados, enquanto Mut e WT referem-se a alelos mutantes e de tipo selvagem, respectivamente. As proporções (%) da taxa de metilação ou de carga mutação detectada no plasma em comparação com os detectados em tecidos foram expressos como plasma /tecido proporção (p /rácio T).

A mediana de, pelo menos, duas medições repetidas foi calculada para cada amostra, e então usado para análise estatística. critérios de qualidade predefinidos foram fixados, de tal modo que as medições com Ct valores superiores a 38 ciclos foram excluídos.

Uma vez que foi observado que a sensibilidade dos ensaios cfDNA pode ser aumentada pela redução do tamanho de fragmentos amplificados [5,6] , iniciadores para ambas as análises foram concebidos para permitir a amplificação de produtos mais pequenos do que 120 pb. A imprecisão intra-ensaio para o teste de metilação foi de 9%. O limite inferior de detecção de DNA metilado para os ensaios MSP (avaliada utilizando diluições em série do Universal metilado de DNA) foi de 1,5%.

A imprecisão intra-ensaio para a

KRAS

análises variou entre 2% e 8%, consoante o tipo de mutação. misturas linha celular de ADN contendo a mutação de interesse em uma base normal de ADN foram utilizados para avaliar o limite de detecção e amplificado no mesmo instrumento corre para actuar como controlos positivos. A sensibilidade analítica de braço-qPCR era inferior a 2%, conforme relatado anteriormente [12].

A análise estatística

distribuição de normalidade foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk e as variáveis ​​contínuas foram relatadas como mediana (gama) ou média ± SD, quando apropriado. As análises estatísticas e plotagem dos dados foram realizados utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). O desempenho diagnóstico da análise cfDNA foi comparada com a análise de tumor de tecido (o padrão ouro atual) por sua sensibilidade e especificidade na distinção entre indivíduos metilados mutantes /hypermethylated e nonmutated /não. Os valores preditivos positivos e negativos preditivos também foram calculados com o teste exato de Fisher. A taxa de concordância entre os perfis de tecidos e plasma foi determinada com o teste de acordo (e os valores apresentados como ponderadas kappa (k) ± erro padrão). As diferenças entre variáveis ​​contínuas foram analisadas usando o teste de Mann-Whitney. As correlações foram testados com a correlação de Spearman. Os valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Cinquenta e seis dos 85 pacientes inicialmente avaliados para sua inclusão potencial no estudo eram homens, as mulheres restantes (com idade média de 69 ± 14 anos. ). A distribuição estágio do tumor era a seguinte: 15 pacientes estavam em estágio I (17,6%), 35 na fase II (41%), 24 na fase III (28,2%) e os restantes 11 no estágio IV (12,9%). Vinte e nove de 85 amostras de tecido de tumor (34%) foram positivas para uma das seis

KRAS

mutações que nós testamos. Destes, 22 tecidos tumorais apresentaram mutações em amostras de plasma combinado. Em geral, a análise mostrou cfDNA 89,4% (76/85) de concordância para

KRAS

detecção com análise tumor-tecido (k = 0,753 ± 0,077, p 0,0001). Havia nove resultados discordantes entre os 85 amostras examinadas. Cinco resultados mostraram um genótipo WT para

KRAS

mutações -tested por análise cfDNA, enquanto que a análise do tumor do tecido mostrou uma

KRAS

mutação G13D (n = 2), um

KRAS

mutação G12D (n = 2) ou um

KRAS

mutação G12V (n = 1). Dois pacientes (tanto na fase II) exibido um

KRAS

G12S e uma mutação G12a por análise de plasma, mas foram determinados como WT por testes tumor de tecido. Finalmente, dois pacientes (ambos com avançado câncer colorretal metastático) apresentaram mutações descasamento entre tecidos e plasma.

O

SEPT9

metilação do promotor estava presente em 82,3% (70/85) de amostras de tecido de tumor primário . A análise exibiu 86% (73/85) de concordância com a análise cfDNA (k = 0,630 ± 0,092, p 0,0001). Os resultados discordantes apenas os pacientes preocupados com a metilação aberrante de

SEPT9

em amostras de tecidos e amostras de plasma não metilados (n = 12).

A distribuição de amostras positivas e negativas no tecido e plasma é mostrada na Tabela 1, juntamente com o desempenho analítico de cfDNA analisa.

Após a exclusão de dois pacientes com diferentes

KRAS

genótipo no tecido e plasma, os 27 pacientes (81,5% do sexo masculino), exibindo tanto alterações genéticas e epigenéticas em amostras de tecido (31,8%, 27/85) foram considerados para as análises quantitativas. Nestes doentes, a taxa de concordância entre o tecido e plasma foi de 93% (25/27) para a alteração epigenética e 81% (22/27) para o

KRAS

análise de mutação (ou seja, duas amostras foram negativas cfDNA para a metilação do

SEPT9 Comprar e cinco foram negativos para a presença de

mutações KRAS

). Entre as diferentes mutações KRAS que nós testamos, a substituição G12V era a mais representada (n = 11), seguido por G12D (n = 7) e G13D (n = 7). Finalmente, uma amostra apresentou a mutação G12a, ao passo que a G12S foi encontrado noutro. No geral, 74% e 26% dos locais de mutação foram localizados em códons 12 e 13, respectivamente.

A mediana

SEPT9

taxas de metilação em tecidos tumorais e amostras de plasma foram 64,5% (12,2-99,9 %) e 14,5% (0-45,5%), respectivamente. A mediana

KRAS

carga mutação foi de 33,6% (1,8-86,3%) em tecidos e 2,9% (0-17,3%) em amostras de plasma. Os dados quantitativos para ambas as alterações genéticas e epigenéticas de acordo com diferentes características patológicas clínicas está resumida na Tabela 2. Não foram encontradas associações significativas com o sexo, local do tumor primário e estado de diferenciação em ambos os tecidos tumorais e amostras de plasma. Em termos de classificação estágio patológico, a taxa de metilação média de

SEPT9

foi significativamente maior em tecidos de câncer em estágio avançado do que nos tecidos em fase inicial. A correlação estatisticamente significativa foi encontrada entre o tecido e plasma

SEPT9

taxa de metilação (r = 0,407, p = 0,035), enquanto não foi encontrada associação entre o tecido e plasma

KRAS

carga mutação (r = 0,092, p = 0,651).

análises adicionais foram realizados em p rácio /t de

KRAS

carga mutação e

SEPT9

taxa de metilação, para identificar o potencial as diferenças entre o grau genética e epigenética de transição a partir de tecido para plasma. A proporção p /t de

SEPT9

taxa de metilação foi significativamente maior do que a proporção p /t de

KRAS

carga mutação (24,2% vs 7,9%, p = 0,0228), ambos os parâmetros que mostram uma amplo espectro de valores (intervalo 0-72,9% para

SEPT9

p /relação t e 0-62,6% para

KRAS

proporção p /t). Esta descoberta foi quase inteiramente atribuível à grande discrepância entre as relações genéticas e epigenéticas p /t detectáveis ​​em cânceres em estágio inicial (p = 0,0108), uma vez que a diferença de câncer em estágio avançado não foi mais significativa (p = 0,6806) (Figura 1). A concentração de cfDNA pacientes nas fases iniciais de CRC (mediana de 30,6 ng /mL, 4,6-66,8) foi menor do que em doentes em estágios avançados (80,2 ng /mL, 31,0-195,0; p = 0,0001). O cfDNA também foi encontrada para ser mais fragmentados (índice de integridade: 0,36, 0.0.7-0.85 vs 0,63, 0,33-0,95; p = 0,0163). Não foram encontradas associações significativas entre os parâmetros cfDNA e alterações genéticas ou epigenéticas, exceto por uma fraca correlação entre cfDNA índice de integridade e

KRAS

carga mutação em cancros avançados (r = 0,572, p = 0,040).

Discussão

Embora o uso de cfDNA como potencial substituto do genoma do câncer foi inicialmente sugerido mais de 30 anos [13], bem como o papel da biópsia líquida foi avaliado pela sua preditivo e prognóstico valor em um número de configurações com resultados promissores, testes de câncer de base cfDNA não foram desenvolvidos para uso clínico até agora.

o alto grau de fragmentação, juntamente com a concentração arterial baixa fazer cfDNA uma substância desafiadora sob uma técnica perspectiva. Além disso, a cinética ainda incertos de liberação cfDNA relacionados com o tumor na corrente sanguínea e as mudanças composição genética durante a progressão ambos contribuem para tornar cfDNA um “difícil de ler” analito, mesmo sob uma perspectiva biológica.

Os resultados da o nosso estudo, com excepção confirmando que a biópsia líquido prevê alterações de tecidos tumorais, são consistentes com a hipótese de que possam existir algumas diferenças entre a velocidade a que as alterações genéticas e epigenética mover a partir de tecido para plasma.

a fim de tornar resultados menos vulneráveis ​​à interferência técnica e tornam os dados genéticos e epigenéticos confiável e directamente comparáveis, adotamos uma série de expedientes metodológicos adaptados de publicações recentes. Em primeiro lugar, a análise foi realizada no plasma uma vez que esta matriz biológica representa uma melhor fonte de cfDNA do soro [1, 6]. Em seguida, utilizou-se produtos de amplificação relativamente curto para ambas as determinações, e este foi devido ao facto de que o comprimento do fragmento pode influenciar a sensibilidade da detecção de mutação e a metilação do [5, 14, 15]. Temos também assegurado um elevado nível de sensibilidade do ensaio epigenética por segmentação uma ilha CpG específica, que foi encontrado recentemente para exibir a maior susceptibilidade a alterações na sequência de metilação adenoma-carcinoma [9]. Finalmente, de acordo com a Sociedade Americana de Oncologia Clínica e da National Comprehensive Cancer Network (NCCN), um alto nível de taxa de detecção foi obtido para

KRAS

análise de mutação visando hotspots no códon 12 e 13, que são conhecidos para responsáveis ​​por aproximadamente 95% de todas as mutações [16].

no presente estudo, a qPCR específica metilação e um métodos baseados ARMS-qPCR foram utilizados para

SEPT9

metilação e

analisa KRAS

mutação, respectivamente. Devido a importantes avanços tecnológicos, novos métodos, como PCR digitais [17], Inteplex qPCR [14] tecnologia de transmissão [18], MethyLight quantitativa ou digital PCR MethyLight [19] e novas sequências profundas abordagens [20] estão agora disponíveis, permitindo assim quantificação absoluta dos alelos mutantes ou metilados em frequências muito baixas e com imprecisão inferiores aos relatados aqui. No entanto, os ensaios que foram utilizados neste estudo são mais amplamente disponíveis em laboratórios clínicos, e são também caracterizados por sensibilidade óptima, ser capaz de detectar, pelo menos, 2% de alteração em um fundo normais [21]. Ainda mais importante, o desempenho analítico de ensaios genéticos e epigenéticos foram muito semelhantes em termos de sensibilidade e precisão, permitindo comparação direta dos dados de alterações diferentes.

A primeira parte do estudo, realizado em toda a coorte de 85 pacientes com CCR, confirmou substancialmente evidências anteriores de que a análise do

KRAS Comprar e

SEPT9

no plasma pode ser visto como uma alternativa confiável para o tecido. O estado de

KRAS

é geralmente utilizado como marcador preditivo de resposta ao receptor do factor de crescimento epidérmico estabelecida (EGFR) inibidores devido ao fato de que o mutante

KRAS

está associado com resistência a anticorpos monoclonais anti-EGFR imunoterapia anticorpo com agentes tais como centuximab ou panitumumab [22,23]. Por outro lado, a metilação aberrante na região promotora do

gene SEPT9

foi convincentemente proposto como biomarcador sensível e específico para o diagnóstico não-invasivo precoce do CRC [24].

Seguindo as sugestões recentemente proposto por Wasserkort e co-autores [9], e, portanto, dirigidas uma ilha CpG específica sobre o promotor da

gene SEPT9

, foi encontrado um número elevado de amostras de tecidos hypermetylated (82%), a uma extensão maior do que previamente relatado na literatura (geralmente variando entre 78 e 81%) [25]. Os resultados obtidos nas amostras de plasma correspondentes revelou elevada concordância global (86%) e especificidade (100%) em comparação com a análise de tumores em tecidos. Na mesma amostra, um

KRAS

mutação foi detectada em 34% dos pacientes, de acordo com os dados obtidos em outras coortes de pacientes não selecionados CRC [10,26]. A análise de amostras de plasma correspondente também revelou um elevado grau de concordância (89,4%) e especificidade (93%) em comparação com o tecido. A maioria dos estudos que comparam os resultados de um ensaio de análise cfDNA com tumor do tecido relatou um desempenho de diagnóstico muito mais baixos, com valores de especificidade constante inferior a 80% [27-29]. Como exceção, apenas dois estudos recentes relatam valores de especificidade compreendido entre 95,3% [30] e 98% [14].

Na segunda parte do estudo, analisou-se a taxa de concordância entre o tecido e plasma carga e taxa de mutação de metilação, e os resultados obtidos com os dois ensaios foram então comparados. No subgrupo de 27 pacientes portadores de alterações genéticas e epigenéticas tecido, o

KRAS

carga mutação variou de 1,8% a 86,3% (quase 48 vezes), o que revela uma heterogeneidade interindividual superior ao

SEPT9

taxa de metilação, que variou de 12.2% a 99,9% (isto é, aproximadamente 8 vezes). Na transição do tecido para plasma, tornou-se cinco amostras de WT para o estado de mutação e dois já não eram hipermetilado. O grau de metilação em movimento a partir de tecido para plasma foi quase 3 vezes maior do que a taxa de carga de mutação como resultante da comparação das razões de duas p /t (24,2% versus 7,9% para a relação P /T de

SEPT9

taxa de metilação e

KRAS

carga mutação, respectivamente). De acordo com relatórios recentes, este resultado pode ser explicado pela heterogeneidade intratumoral do tumor primário, que preferencialmente prejudica genética em vez de análise epigenética [7, 31]. No entanto, uma vez que a discrepância encontrada entre as relações dois P /T é exclusivamente atribuível aos dados obtidos em cânceres em estágio inicial enquanto a evolução clonal geralmente ocorre quando a metástase está desenvolvendo, a clonalidade tumor seria apenas parcialmente explicar os nossos achados [32].

Para o

KRAS

análise, os valores comparáveis ​​de carga foram obtidas entre mutação cancros precoces e avançados em ambos os tecidos (26,9% vs 34,7%) e as amostras de plasma (1,9% versus 4%), de modo que a p análise /t não revelou diferenças significativas de acordo com as fases de tumor (8,6% vs 7,3%). Por outro lado, uma diferença estatisticamente significativa foi encontrada para o

SEPT9

análise de metilação entre p rácio /t em cânceres precoces e avançados (33,8% vs 19,0%, p = 0,0108). Esta variação foi inteiramente atribuível a uma discrepância na taxa de metilação detectada em tecidos (57,2% vs 80,8%, p = 0,0009), uma vez que não foram encontradas diferenças nas amostras de plasma (15,8% vs 12,9% para o início vs estágios avançados). Assim, a transição de DNA abrigar a alteração epigenética para a circulação em cânceres em estágio inicial é aparentemente mais consistente do que a transição de DNA abrigando um

KRAS

mutação. De acordo com os dados mais recentes da literatura, essa evidência poderia ser interpretado como resultante de diferenças no tecido envolvimento tipos previamente observados para CRC genéticas e epigenéticas assinaturas [33]. Em particular, enquanto o

SEPT9

metilação aberrante se origina nas células epiteliais e é então transferido rapidamente para células estromais [9], o

KRAS

mutações hospedadas pelos compartimento epitelial não são compartilhados pelas células estromais [ ,,,0],34]. Por conseguinte, o cross-talk molecular entre o epitélio e estroma tumor ocorrendo para o

SEPT9

alteração epigenética pode facilitar a transição de DNA aberrante do tumor primário para a circulação.

Além disso, o total mais baixo grau de carga de mutação no que diz respeito à taxa de metilação detectada em tecidos CRC (26,9% vs 57,2% em cânceres em estágio inicial) pode ter contribuído para aumentar o efeito de diluição de selvagem de tipo

DNA KRAS

na circulação .

Em conclusão, os resultados do presente estudo confirmam que a análise cfDNA representa uma estratégia adequada para análise abrangente do tumor perfis genéticos e epigenéticos, mesmo usando métodos de rotina. Mais importante ainda, que fornecida primeira evidência de que a taxa à qual tumor derivado cfDNA pode ser detectado na circulação não só depende da sensibilidade dos métodos utilizados e a complexidade da cinética de libertação, mas também na natureza da alteração única. Em uma época caracterizada pelo aumento da utilização de estudos de expressão gênica abrangentes de tumores sólidos para elucidar a complexidade dos tecidos tumorais e heterogeneidade de fenótipos celulares, nosso estudo enfatiza a necessidade de melhor caracterizar as assinaturas genéticas e epigenéticas específicas do cancro de acordo com diferentes compartimentos de tumor, de modo que o valor de significância e clínico de avaliação cfDNA pode ser, em última análise melhorada.

estudos confirmatórios adicionais podem apoiar a hipótese já foi sugerido por alguns autores, segundo a qual a análise de cfDNA representa uma valiosa alternativa à análise de tecidos, mas também pode tornar-se a primeira escolha tanto para caracterização do tumor genéticas e epigenéticas, proporcionando uma melhor retrato global de doenças malignas [5, 14, 29, 30].