Sumário

pró-angiogénico enzima timidina fosforilase (TP) é um alvo promissor para a terapia anti-cancro, mas a sua acção no carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC) não é completamente compreendido. A fim de elucidar o seu papel no crescimento do tumor de NSCLC, NCI-H292 de carcinoma do pulmão de células mucoepidermoide e células endoteliais foram engenharia para sobre-expressar TP de transdução por vector virai. células NSCLC com expressão alterada do factor de transcrio Nrf2 ou do seu gene alvo heme oxigenase-1 (HO-1) foram usadas para estudar a regulação da TP e os resultados de modelos pré-clínicos foram relacionados com os dados de expressão genética a partir de espécimes clínicos NSCLC. A sobre-expressão de Nrf2 ou HO-1 resultou na supra-regulação da TP em células NCI-H292, um efeito mimetizado por tratamento com um antioxidante N-acetilcisteína e parcialmente revertida por HO-1 knockdown. Superexpressão de TP atenuada proliferação e migração celular

in vitro

, mas ao mesmo tempo reforçada potencial angiogênico de células cancerosas suplementado com timidina. Este último também foi observado para SK-MES-1 carcinoma de células escamosas e células grande carcinoma de células NCI-H460. tumores NCI-H292-superexpressão TP

in vivo

exibiu uma melhor oxigenação e maior expressão de IL-8, IL-1β e IL-6. TP superexpressão nas células endoteliais aumentadas as suas propriedades angiogénicos que foi associado com a geração melhorada de HO-1 e VEGF. Correlação de TP, com a expressão de HO-1 e citoquinas inflamatórias foi confirmada em amostras clínicas de NSCLC. . No total, o aumento da expressão de IL-1β e IL-6 em conjunto com os efeitos pró-angiogénico de TP-expressando NSCLC no endotélio pode contribuir para o crescimento do tumor, o que implica TP como um alvo para antiangiogenesis em NSCLC

citação: M Tertil , Skrzypek K, Florczyk U, Weglarczyk K, era H, Collet G, et al. (2014) regulamento e Novel Ação da timidina fosforilase em Non-Small Cell Lung Cancer: Crosstalk com Nrf2 e HO-1. PLoS ONE 9 (5): e97070. doi: 10.1371 /journal.pone.0097070

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de outubro de 2013; Aceito: 14 de abril de 2014; Publicado: 12 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tertil et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por as subvenções no 311 /N-COST /2008/0, 347 /N-INCA /2008/0 e N N301 314837 do Centro Nacional de Ciência (NCN). Alicja Jozkowicz foi um Research Senior Fellow Internacional da Wellcome Trust. M. Tertil e K. Skrzypek foram apoiados pelo Conseil Regional du Centre, bolsa para co-tutorial tese de doutoramento. A Faculdade de Bioquímica, Biofísica e Biotecnologia da Universidade Jagiellonian é um beneficiário dos fundos estruturais da União Europeia e do Ministério polonês da Ciência e do Ensino Superior (concede No: POIG.02.01.00-12-064 /08, 02.02. 00-00-014 /08, 01.01.02-00-109 /09 e 01.01.02-00-069 /09). A pesquisa conduzida no âmbito do Laboratório Associado Internacional Mir-Tango (LIA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução tumores

Lung classificar como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), sendo o mais prevalente. pacientes com NSCLC são frequentemente diagnosticados com doença avançada, quando a quimioterapia sistémica é a principal opção terapêutica. Como o crescimento de tumores e metástases são dependentes de angiogénese, mecanismos que regem a formação de novos vasos sanguíneos foram alvo de intervenção no cancro do pulmão [1]. No entanto, a adição de agentes anti-VEGF a quimioterapia convencional resultou apenas em ligeira melhoria da sobrevida média [1], [2] com pacientes que sofreram recidiva do tumor devido ao surgimento de resistência aos medicamentos aos agentes anti-angiogénicos, sublinhando a necessidade urgente de novos alvos para combinatória tratamentos.

timidina fosforilase (TP, EC2.4.2.4) é uma enzima via de síntese de pirimidina de salvamento, que também é conhecido por suas propriedades pró-angiogénico. TP catalisa fosforólise reversível de timidina em timina e 2-desoxi-D-ribose-1-fosfato (DRP), que é posteriormente desfosforilado a 2-desoxi-D-ribose (dR). A enzima e os seus produtos de açúcar estimular a migração de células endoteliais e formação do tubo

in vitro

e aumentar a angiogénese em vários modelos

in vivo

[3]. TP é frequentemente sobre-expressa em tumores humanos, incluindo NSCLC [3], [4], e tem sido demonstrado que se correlacionam com maior densidade de microvasos, tumor estádio mais avançado, metástases e mau prognóstico [3]. acção pró-angiogénico de TP em tumores, para além da acção directa dos seus produtos em células endoteliais, pode também envolver a estimulação da expressão de outros factores angiogénicos, tais como VEGF, interleucina-8 (IL-8) ou de heme oxigenase-1 (HO- 1) [5], [6]. Por conseguinte, a segmentação TP com inibidores de moléculas pequenas é actualmente investigada como uma estratégia anti-angiogénico romance [7]. No entanto, para o desenvolvimento de agentes quimioterapêuticos eficazes combinatórias, retendo a actividade enzimática de TP pode ser necessária, uma vez que catalisa um passo importante para a activação de agentes de fluoropirimidinas, tais como a capecitabina, que tem sido proposto como um tratamento alternativo para NSCLC avançado [8]. Esta dupla função de TP no crescimento do tumor e a terapia implica que a inibição de efeitos protumoral da enzima pode requerer segmentação seus mediadores a jusante. Elucidar os mecanismos de ação de promoção de tumor de TP regulação e é, portanto, de importância crucial.

Nrf2 (2 fator nuclear (derivado eritróide-) -como 2) é um fator de transcrição que regula respostas antioxidantes celulares [9]. É frequentemente constitutivamente activa em tumores, incluindo cancro do pulmão, e pode ser ainda induzida por tratamentos anticancro. Ele conduz a expressão de genes citoprotectores que conduzem ao desenvolvimento de resistência aos agentes citotóxicos [10]. Um dos objectivos é Nrf2 HO-1, heme, que se converte em CO, biliverdina e ferro ferroso, e que tem sido demonstrada mediar a resistência Nrf2-driven de células NSCLC à quimioterapia [11], [12]. Curiosamente, ambas as proteínas desempenham um papel na promoção da angiogênese: a ação de HO-1 a montante ea jusante VEGF angiogênico e SDF1α está bem estabelecida [13], eo envolvimento de Nrf2 na regulação da angiogênico IL-8 foi demonstrado [14] – [16].

Aqui nós investigamos o papel biológico de TP com foco na angiogênese e a interação com Nrf2 e HO-1 no cancro do pulmão de não pequenas células e células endoteliais. Nossos resultados mostram os efeitos da superexpressão TP em células NSCLC

in vitro

e

in vivo

e destacar a importância da ação pró-angiogénico da enzima.

Materiais e Métodos

Os plasmídeos e vectores virais

O plasmídeo pBK-RSV-TP abrigar cDNA TP humano foi gentilmente cedido pelo Dr. S. Liekens (Instituto Rega para a Investigação médica, KU Leuven, Bélgica). Plasmídeo pEF (azul) -Nrf2 contendo cDNA Nrf2 humana foi gentilmente oferecida por Dr. J.A. Johnson (Divisão de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Wisconsin-Madison, EUA) [17]. A construção de vectores retrovirais (RVs) RV-TP e RV-Nrf2 foi realizado conforme descrito em Métodos Suplementares (S1 Arquivo). Retroviral plasmídeo pMSCV-Luc contendo a cassete de expressão de luciferase para a produção de RV-Luc foi obtido a partir de Addgene. Todos RVs incluindo um controlo de RV-vector vazio (LNCX2) foram produzidos como descrito em [18].

vectores adenovirais (AdVs) abrigando TP ADNc (ADTP) foram desenvolvidas tal como descrito em Métodos complementares (S1 Ficheiro) e vetores de controle com GFP (AdGFP) conforme relatado anteriormente [16]

As linhas celulares e condições de cultura

linhas de NSCLC de células humanas:. NCI-H292 (carcinoma mucoepidermóide, comprado de ATCC), A549 ( adenocarcinoma, obtido a partir Prof. Jakub Golab, Warsaw University Medical, Varsóvia, Polónia) e NCI-H460 (carcinoma de células grandes, comprado de ATCC) foram cultivadas em RPMI 1640 (PAA) e SK-MES-1 (carcinoma de células escamosas, comprados a partir de ATCC) foram cultivadas em meio MEM (Gibco), cada um complementado com soro bovino fetal a 10% (PAA) e penicilina (100 U /mL) /estreptomicina (10 ug /mL) (Sigma) (pen /strep). células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1, obtido de Dr. Francis Candal, Centro de Controle e Prevenção de Doenças, Atlanta, EUA) foram cultivados em MCDB 131 suplementado com 10% FBS, L-glutamina 2 mM, pen /strep, EGF 10 ng /mL e hidrocortisona a 1 mg /mL. células humanas primárias endoteliais da veia umbilical (HUVEC) foram isoladas como descrito anteriormente [19] e cultivadas em M199 (PAA) suplementado com FBS a 20%, Pen /Strep e suplemento de crescimento de células endoteliais ECGS 30 mg /L (Millipore).

Todas as células foram mantidas em condições padrão de cultura: 37 ° C, 5% de CO

2, 95% de humidade. Para a investigação dos efeitos das células de hipóxia foram colocados durante 24 ou 48 horas em uma câmara (Biospherix EUA) sob atmosfera controlada de gás de 1% O

2, 5% de CO

2 e 94% N

2 colocada a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.

para o estabelecimento de linhas celulares NCI-H292-Luc-TP (NCI-TP) e NCI-H292-Luc-Nrf2 (NCI-Nrf2) que sobre-expressam estavelmente luciferase e respectivos transgenes e controle NCI-H292-Luc-EV (NCI-EV) modificado com vector vazio, as células foram transduzidas com vetores retrovirais. Em primeiro lugar, uma infecção com RV-transgene ou RV-vector vazio (RV-EV) foi realizada e as células transformadas de forma estável foram seleccionadas por geneticina (1 mg /mL), que foi seguido por transdução com RV-Luc e de selecção por higromicina (0,3 mg /mL). linha celular NCI-H292-Luc-HO-1 (NCI-HO1) foi desenvolvida e validada anteriormente em nosso laboratório [20]. Para a manutenção da expressão do transgene células foram rotineiramente mantidas em meio padrão, adicionalmente suplementado com geneticina (0,5 mg /ml) e higromicina (0,1 mg /mL). Para as células experiências foram semeadas em meio sem antibióticos.

sobreexpressão transiente TP e estimulação das células com NAC ou TP substrato

Timidina (THD) e N-acetilcisteína (NAC) foram adquiridos a Sigma Aldrich . Para a sobre-expressão transitória em células endoteliais TP, HMEC-1 e células HUVEC foram transduzidas com vectores adenovirais ADTP ou AdGFP controlo a MOI = 10 durante 24 h e em seguida estimuladas com Thd durante mais 24 h em meio completo. Para a sobre-expressão TP transiente em células NSCLC, SK-MES-1 e NCI-H460 foram transduzidas a MOI = 20 e MOI = 40, respectivamente, e estimuladas com Thd 1 mM em meio suplementado com 2% de FBS a 48 h após a transdução.

níveis de RT-PCR em tempo real de

de ARNm de genes foram determinadas por PCR quantitativa RT. O ARN foi isolado com qualquer Qiazol (Qiagen) ou utilizando RNeasy Além disso Micro Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 1 ug de ARN foi transcrito reverso em ADNc utilizando iniciadores oligo-dT com o kit de RevertAid premium First Strand cDNA Synthesis (Fermentas). PCR em tempo real foi realizada utilizando 30 ng de amostra com QuantiTect SYBR Green (Qiagen, análise do

in vitro

experimentos) ou SYBR Premix Ex Taq II (Takara, a análise do

in vivo

experimentos ) de acordo com as instruções do fabricante no sistema LightCycler 480 II (Roche). A expressão de genes foi calculado de acordo com métodos ΔCt ou ΔΔCt com EF2 como um gene de referência, com barras de erro calculados como desvios padrão das médias, divididos por √ (N-1), em que N era o número de experiências independentes. propagação de erro não foi levado em conta, o que é alguma limitação de nosso estudo.

análise de Western blot e ELISA

Western blot para HO-1 foi realizada como em [19]. Para a detecção de rato TP humana mAb P-GF.44C (Calbiochem) foi usado. Produção de VEGF humano e IL-8 em meios de cultura e IL-8, IL-1β e IL-6 em lisados ​​de tumor foi quantificada utilizando kits de ELISA DuoSet (R D) de acordo com os protocolos do fabricante. A concentração total de proteína nas amostras foi medida pelo método BCA. Os dados foram normalizados por meio de diluições de pré-ensaio de lisados ​​de tumor a uma concentração igual a 1 mg /mL.

ensaio do gene repórter para a medição da actividade de transcrição Nrf2

ensaio foi realizado como já descrito em [ ,,,0],15].

silenciamento de genes experiência

As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi (discrição ARNi HO-1 siRNA e controlam discrição ARNi siRNA controlo negativo, Invitrogen) utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

proliferação celular e migração

a proliferação celular foi medida por ensaio colorimétrico de incorporação de BrdU (proliferação celular ELISA, Roche) segundo as instruções do fornecedor. A fim de investigar a migração de células, as células foram cultivadas até à confluência completa e durante 24 h para bloquear a proliferação privadas de soro. Zero foi feita sobre a monocamada com uma ponta de pipeta. Migração foi seguido por microscopia de lapso de tempo (Zeiss Axiovert 200 M) para 6-8 campos diferentes para cada condição. área coberta média foi calculada em momentos diferentes e expressa como a percentagem de área de rascunho no tempo zero usando software ImageJ.

ensaios de angiogênese

in vitro

ensaio

formação do tubo em Matrigel foi realizado como já descrito [21]. células NSCLC foram incubadas em meio contendo 2% de FBS em normoxia e hipoxia durante 48 h, o meio condicionado foi recolhido e misturado a 1:01 vol /vol com MCDB 131 suplementado com 2% de FBS e antibióticos sem outros aditivos para a estimulação de HMEC-1 ou HUVEC. Ensaio esferóide em células HUVEC foi realizada como anteriormente

Experiências com animais

declaração [19].

Ética.

Todos os animais foram manipulados em estrita conformidade com as boas práticas de animais e todos os animais trabalho foi aprovado pela Comissão de CNREEA 03 (Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale) Campus CNRS d’Orléans Ética na França.

6 semanas ratos atímicos fêmeas mais velhas suíços nus foram adquiridos de Charles River ( França). Para o estabelecimento de controlo NCI-EV xenoenxertos tumorais NCI-TP e, as células em crescimento exponencial foram recolhidas utilizando dissociação celular Solução (Sigma) e novamente suspensas em PBS. 5 × 10

6 células em 100 ul foram injectados subcutaneamente na perna direita de cada ratinho (linha 10 animais /célula). O crescimento do tumor foi monitorizado durante 5 semanas por medições de calibre, o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula

V

=

D

×

d

2 × 0,5 (

V

é o volume do tumor,

d

é a maior dimensão;.

d

é a menor dimensão)

a medição da oxigenação do tumor

a oxigenação do tecido tumoral foi medida pelo sistema de sensor OxyLite baseado em têmpera de rutênio de fluorescência por O

2 (Oxford Optronix).

h3> Análise do material clínico

h4> declaração Ética

estudos em humanos foram aprovados pelo Comitê local de Ética da Collegium Medicum da Universidade Jagiellonian em Cracóvia, Polônia. Os pacientes expressaram o seu consentimento por escrito para participação no estudo.

As biópsias de tumores primários e metástases tumorais para linfonodos (se houver) foram coletados durante a cirurgia de 24 pacientes que sofrem de NSCLC adenocarcinoma. Os pacientes foram tratados na Clínica de Cirurgia Torácica, Jagiellonian University Medical College, 31-202 Cracóvia, Polónia.

A análise estatística

Salvo disposição em contrário, os resultados mostram média ± SEM de pelo menos 3 independente experiências realizadas em duplicado. testes t de Student não pareado foram usadas para avaliar se as médias de dois grupos diferiram significativamente. Para a comparação dos vários grupos foi empregado one-way análise de variância com Tukey pós-teste. Diferenças com um valor de p 0,05. Foram considerados estatisticamente significantes

Resultados

TP é diferencialmente expressos em células NSCLC com diferentes níveis de Nrf2 e heme oxigenase-1