Sumário

BORIS /CTCFL é membro de testículo cancro da família antígeno normalmente expressa em células germinativas. Em tumores, é expresso de forma aberrante, embora as suas funções ainda não estão completamente bem definida. Para entender melhor as funções de BORIS em câncer, foram selecionadas as células cancerosas embrionárias como modelo. Usando um farol molecular, a qual tem como alvo especificamente

BORIS

ARNm, demonstramos que as células positivas são BORIS uma pequena subpopulação de células tumorais (3-5% do total). As células BORIS-positivos isolados usando beacon BORIS-molecular, expressa maior telomerase

hTERT

, células-tronco (

NANOG, OCT4, SOX2

) e genes marcadores de células-tronco do câncer (

CD44

e

ALDH1

) em comparação com as células tumorais BORIS-negativas. A fim de definir o papel funcional de BORIS, células cancerosas embrionárias BORIS-empobrecido estáveis ​​foram gerados.

BORIS

silenciar fortemente regulada a expressão de

hTERT

, caule genes marcadores célula e tronco cancerosas. Além disso, o knockdown BORIS aumentou a senescência celular em células cancerosas embrionárias, revelando um papel putativo de BORIS no programa biológica senescência. Nossos dados indicam uma associação de BORIS expressando células subpopulação com a expressão de genes stemness, destacando o papel fundamental desempenhado pelo BORIS em doenças neoplásicas embrionária

Citation:. Alberti L, Renaud S, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2014) elevada expressão de

hTERT Comprar e Genes stemness em BORIS /células CTCFL positivos isolados de células de câncer embrionárias. PLoS ONE 9 (10): e109921. doi: 10.1371 /journal.pone.0109921

editor: Gabriele Saretzki, da Universidade de Newcastle, Reino Unido

Recebido: 20 de junho de 2014; Aceito: 12 de setembro de 2014; Publicação: 03 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Alberti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation suíço (número de concessão: 31003A-113.505; www.snf.ch.); e Emma Muschamp Foundation (www.s-a-v.org/-Fondations-associees-.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Um dos autores (JB) é empregado por um laboratório de patologia molecular (Lab Biopath ). Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Brother do regulador de locais de imprinting (BORIS) também concebido como CTCFL, fator CCCTC de ligação -like, é uma proteína de ligação de ADN com funções de cancro não totalmente compreendidas. CTCF é expressa ubiquamente, factor de cromatina altamente conservada, multifuncional que desempenha um papel como um gene supressor de tumor [1] – [3]. Boris é um par�ogo mamíferos de CTCF, eles compartilham o mesmo 11 domínios zinc-finger, mas diferem em N- e C- terminais. Neste domínio zinc-finger, Boris e CTCF apresentam 70% de homologia [4]. Em tecidos normais,

BORIS

expressão está restringida às células germinativas, em que está envolvida na reprogramação epigenética [4], [5].

BORIS

é expressa em espermatócitos durante o desenvolvimento da linha germinal masculina, aparentemente em ausência de CTCF [4]. Em tumores, Boris é expresso de forma aberrante e a sua transcrição foi detectada em diferentes níveis em várias linhas celulares de cancro e em tumores primários [6]. Devido à sua expressão restrita em tecidos normais germinais e a sua re-expressão em uma ampla variedade de tumores, BORIS pertence ao antigénio do cancro testicular família (CTA). Tem sido demonstrado que BORIS induzida a expressão de outros genes de CTA, MAGE-A1, como, NY-ESO-1 [7], [8] e SPANX [9], mas não em todos os tumores [10], [11]. Além disso, nós anteriormente mostraram que BORIS activada

hTERT

expressão por ligação ao primeiro exão do

hTERT

gene da telomerase em células de tumor de ovário e embrionárias [12]. Além disso, em estudos de expressão BORIS exógeno em células normais BORIS-negativa, foi demonstrado que estas células transfectadas exibiram elevados níveis de

hTERT

ARNm [12]. Todos estes resultados revelaram um papel importante de BORIS no processo de imortalização durante tumorigênese. Curiosamente, relatórios atuais mostram uma correlação entre

hTERT

expressão e resultam propriedades da célula-like [13] – [17]. Outras investigações sobre a correlação entre as funções de Boris e os principais papéis de hTERT na imortalização e propriedades stemness tem que ser realizada. Outra questão ainda não claramente respondida é como muitas células, dentro de uma linha de células de tumor, expressar

BORIS

. Neste artigo, vamos abordar estas questões. Para este efeito, foram selecionados para utilizar a tecnologia de imagem de farol molecular (MB), uma vez que é um método aprovado para detectar e também para visualizar a expressão de ARNm [18]. MBs são oligonucleótidos estruturados como hairpin haste-laçada com um inibidor de fluorescência numa extremidade e, na extremidade oposta, um corante fluorescente, também chamado fluoróforo. Devido à sua estrutura específica, MBs emitem sinais de fluoresccia apenas quando ligação aos seus alvos. Para explorar a frequência de células BORIS-positivos dentro de linhas de células de tumor, foi elaborado um primeiro MB

BORIS

mRNA alvo, e depois analisamos

expressão BORIS

em linhas celulares de tumores embrionários e ovário humano, respectivamente NCCIT e OVCAR3. Depois de verificar que BORIS-MB permitir FACS triagem de células BORIS-positivos, que mostraram que as células BORIS-positivos isolados expressaram maior nível mRNA de

hTERT Comprar e genes stemness comparação com células NCCIT não-ordenados BORIS-negativo e . Nós confirmamos ainda mais este resultado pelo

BORIS

silenciar estudos. Além disso, mostramos que BORIS protege do processo de senescência. Ao todo, nossos dados confirmam um papel direto da BORIS em doenças neoplásicas embrionária

Materiais e Métodos

Células

As linhas de células humanas (BJ, prepúcio fibroblastos;. HeLa, cervical adenocarcinoma; NCCIT, carcinoma embrionário; OVCAR3, carcinoma do ovário) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2, quer em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, Invitrogen) para células HeLa e BJ, ou em meio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) para NCCIT e OVCAR3 , suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor (Invitrogen) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen).

Molecular Beacon (MB) Design by

Sequências de BORIS-MB1 e BORIS-MB2 foram projetados usando Beacon Designer (Premier Biosoft).

BORIS

estruturas secundárias de mRNA foram preditos usando software MFOLD (MFOLD, https://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) e especificidade foi determinada através de pesquisa BLAST (NCBI). A sequência alvo de BORIS-MB1 está localizada no exão 2 e o de BORIS-MB2 está localizada no exão 11 do

BORIS

mRNA. Estes locais foram escolhidos por serem fora do domínio zinc-finger e não cross-hibridizam com as regiões de homologia CTCF. Além disso, estudos anteriores mostraram que a das regiões de ARNm que terminam de partida e são o mais acessível para hibridação MBs [19]. A Random-MB que foi usado como controle negativo não coincide com quaisquer sequências de mamíferos [19]. Sequências foram as seguintes: BORIS-MB1 5′-CGCTGTCTCTGCACACTCCGTCTTCAGCG-3 ‘; BORIS-MB2 5’-CAGCCATTCCTCTTTGACTCTGGCTG-3 ‘e RANDOM-MB 5′-CGACGCGACAAGCGCACCGATACGTCG-3′ (bases sublinhadas indicando aqueles complementares às sequências alvo). Um fluoróforo (Cy3 ou ATTO647) era 5’-conjugado e um buraco negro Refrescante (BHQ-2) foi ligado à extremidade 3 ‘. A MBS foram adquiridos à Sigma e foram purificados por cromatografia líquida de alta pressão.

Em

determinação in vitro da especificidade MB

Os oligos foram concebidos para ser específico dos MBs alvos (MB1 BORIS-alvo específico: 5′-AAGACGGAGTGTGCAGAGAGA-3 ‘;-alvo específico BORIS-MB2: 5′-CAGCCAGAGTCAAAGAGGAA-3′ e MB-RANDOM alvo específico: 5’-TATCGGTGCGCTTGTCG-3 ‘). Um oligo não-específica foi usado para a

In vitro

teste dos diferentes MBs. Este oligo não-específica, 5′-CGATGCCGAACCAATTCTCCAC-3 ‘, corresponde a uma variante de transcrito CTCF. Para testar a especificidade em solução, 200 nM de MB foi misturada ou não com 1 ^ M de oligo em 10 ul de meio Opti-MEM (Invitrogen).

A emissão de fluorescência perfis foram obtidos depois de aquecer o MB-alvo mistura de oligo para uma elevação progressiva da temperatura variando de 15 a 80 ° C, utilizando passos de 1 ° C. sinal de fluorescência foi adquirida no final de cada grau crescente e detectado no canal Cy3 usando um 6000 Real-Time sistema de Gene Rotor PCR (Corbett Life Science).

entrega MB e fluorescência de células de imagem

as células foram descoladas utilizando 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) e foram ressuspensas em meio DMEM isento de soro na concentração de 10

6 células /ml. Em primeiro lugar, Cy3 BORIS-MB ou Cy3-aleatória-MB (200 nM) foi incubada à temperatura ambiente na presença de 1 ul /ml de reagente de transfecção Lipofectamine RNAiMAX siRNA (Invitrogen) utilizando meio Opti-MEM. O reagente Lipofectamine RNAiMAX foi utilizado como veículo de entrega, uma vez que nas nossas condições deu menos fundo em comparação com outros reagentes, tais como estreptolisina (dados não mostrados). Após 10 min, a mistura de transfecção foi adicionado às células em suspensão e em conjunto incubadas durante 1 hora a 37 ° C. Hoechst 33342 (Invitrogen) foi adicionado a uma concentração de 5 ug /mL durante os últimos 10 minutos de incubação. Em seguida, as células foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS, Invitrogen) e ressuspensas em PBS com EDTA 5 mM. As células transfectadas foram cytocentrifugated em lâmina de vidro usando uma centrífuga Cytospin e examinado sob microscópio de fluorescência (Axioplan2 Imaging, Zeiss). O sinal de fluorescência de Cy3-coniugated MB foi analisada utilizando o canal vermelho e Hoechst 33342 emissão de fluorescência foi observado sob canal de azul.

análise FACS e classificação usando MB

Para a análise FACS e separação de células, utilizou-MBs conjugados com ATTO 647, um corante caracterizada pela sua alta fotoestabilidade [20]. As células foram preparadas e incubadas com MBs como descrito acima (excepto que a Hoechst 33342 não foi adicionado) e foram directamente analisados ​​utilizando Gallios citómetro de fluxo (Beckman Coulter). Pelo menos 10.000 eventos foram recolhidas e analisadas por software Kaluza. As populações BORIS-positivos e BORIS-negativos foram classificadas após a exclusão de células mortas por iodeto de propídio (PI) coloração utilizando FACSAria I (Becton Dickinson) instrumento no Centro de Citometria de Fluxo de UNIL (Universidade de Lausanne, Suíça). Intervalos de 2 × 10

4-9 × 10

4 células BORIS-positivas e 2 × 10

5-9 × 10

5 células BORIS-negativos foram classificadas.

BORIS knockdown pelo sistema lentiviral inducible shRNA

linhas de células estáveis ​​com shRNAs expressando induzíveis segmentação humana

BORIS

mRNA foram gerados usando o sistema de doxiciclina-inducible shRNA lentiviral, pINDUCER [21]. Os pINDUCER11 lentiviral vector expressa constitutivamente a proteína repórter fluorescente eGFP, que permite rastrear as células transduzidas pelo vírus. Este vector também contém uma cassete com um promotor indutível doxiciclina que controla a transcrição de um gene repórter tRFP em conjunto com o shRNA, que permite a detecção de células activado com doxiciclina shRNA transcrição [21]. Quatro shRNAmiR diferente (shRNA) visando especificamente

BORIS

, e não a sua parolog

CTCF

(BORIS-sh1: 5′-ATTCACCAAGATCAAAGAACTC-3 ‘, BORIS-SH2: 5’-GTTCTCACAGTTTCAAATTCAA-3 ‘, BORIS-SH3: 5′-TTCATCCCGACTGTTTACAAAT-3’, BORIS-SH4: 5’TCCGACAGAAGCAACTTCTAAA-3 ‘) e um shRNA controlo scrambled com sequência (CTR SH: 5’CAGAGCTAACTCAGATAGTACT3’) foram sintetizados (Sigma). Eles foram amplificados por PCR e clonado no esqueleto pINDUCER11 usando

EcoRI e XhoI>

enzimas de restrição. As sequências de todas as construções foram verificadas através de sequenciação. Lentivírus foram gerados por co-transfecção do shRNA constrói apropriado, juntamente com os vectores de embalagem (pMD2G-VSVG, pCMV-dR8.74) em células HEK-293T utilizando FuGENE 6 de reagente (Roche Diagnostics), de acordo com o protocolo do fabricante. Os sobrenadantes virais foram colhidos 48 horas após a transfecção, filtradas através de um filtro de 0,45 um, poros ultracentrifugated durante 1,5 horas a 19500 rpm num rotor Beckman SW28 e ressuspensas em meio RPMI. A suspensão virai combinado com 8 ug /ml de polibreno (Sigma) foi utilizado para infectar as células-alvo (NCCIT). Vinte e quatro horas após a infecção, o meio foi substituído e as células foram infectadas de forma estável eGFP-classificados usando FACSAria instrumento I (Becton Dickinson) nas instalações de Citometria de Fluxo de UNIL. A indução da expressão de shRNA foi obtido por adição ao meio de 2 ug /ml de doxiciclina (Sigma). Para manter o knockdown, meio contendo doxiciclina foi actualizada a cada 3 dias.

A expressão ectópica BORIS em células HeLa

A transfecção prévia dias, as células HeLa foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

5 células /cavidade em 12 cavidades /placas. As células foram transfectadas com 3 ug do vector pCMV-BORIS anteriormente descrito [12] utilizando o reagente de transfeco Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. As células foram recolhidas 2 dias após a transfecção para imagens de fluorescência celular.

RT-PCR quantitativo

O ARN total foi isolado utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen), incluindo o tratamento com DNAse na coluna de acordo com o as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi determinada utilizando Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) e Qubit Tecnologia fluorescente (Invitrogen).

Um grande passo limitante foi a baixa quantidade de RNA total isolado de separação de células. Para resolver esta limitação técnica, aplicou-se um método já descrito e validado [22], [23]. Em primeiro lugar, 200 ng de ARN total foram retrotranscrito, usando hexâmeros aleatórios e Superscript III transcriptase reversa (Invitrogen) num volume final de 20 ul. Em seguida, foram utilizados 2 uL de ADNc por uma reacção de pré-amplificação que consiste em uma PCR multiplex feita com uma mistura de iniciadores (Tabela S1) a 0,1 uM de concentração final, 0,5 unidades de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen), 1x tampão de PCR, e 2 mM de MgCl

2 em um volume total de 25 ul

para a pré-amplificação, as condições dos ciclos de PCR foram:. um passo de desnaturação a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 15 ciclos de amplificação (45 seg a 95 ° C , 30 seg a 60 ° C, 1 min a 72 ° C). Finalmente, para a PCR quantitativa, a pré-amplificação de reacção foi diluída 20 vezes e 2 ul desta diluição foram utilizados como molde. A reacção foi completada com 0,5 unidades de Platinum Taq ADN polimerase (Invitrogen), tampão de PCR 1X, MgCl 2,5 mM

2, 2,5 uM SYTO9 verde (Invitrogen) e 0,1 uM de cada iniciador específico do gene (Sigma) em um volume final de 20 ul. As condições de PCR foram: 95 ° C durante 5 minutos, seguido de ciclos (5 seg a 95 ° C, 30 seg a 60 ° C, 45 seg a 72 ° C). Melting curva análises foram realizadas no final da amplificação para verificar a pureza dos produtos de amplificação. Os produtos de PCR foram também carregados num gel de agarose para confirmar o tamanho correcto de produtos amplificados. Andar de bicicleta e fluorescência aquisição foram feitas em Rotor-Gene 6000 sistema de PCR em Tempo Real (Corbett Life Science). A análise dos dados foi realizada utilizando Rotor-Gene 6000 software. níveis de expressão relativa foram determinadas pelo método ΔΔCt com níveis de expressão normalizados para

GAPDH

nível. A eficiência da PCR variou de 94 a 101%, com um coeficiente de correlação (r

2) no intervalo 0,96-1,0, para todos os genes alvo amplificados. Os valores do Ct de

GAPDH eram aproximadamente os mesmos (Ct = 10,07 ± 0,25) para todas as células utilizadas nas experiências quantitativos de RT-PCR.

Os iniciadores específicos humanos (Tabela S1) foram projetados usando Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) e software OLIGO Análise Primer. Especificidade foi verificada através de pesquisa BLAST (NCBI). Os pares de primers projetados atravessar as fronteiras intrão-exão para evitar a contaminação de ADN genómico. primers BORIS foram escolhidos (entre o exão 8 e 9) com base nos resultados obtidos anteriormente [24], a fim de amplificar o mais abundante

BORIS

isoformas.

metilação do DNA análise

O ADN foi extraído utilizando o kit DNeasy (Qiagen). Uma gama de 200 ng (a partir de células separadas) e 500 ng de DNA foi usada para bissulfito utilizando o kit de reacção EpiTect bissulfito (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN modificado foi usada para amplificar um fragmento de 123 pb do promotor BORIS.

O ensaio de metilação foi concebido usando a PyroMark Assay Design de Software 1.0 (Qiagen). Este ensaio permitiu a sequenciação de 50 bp (a partir da posição -968 a -918) dentro do promotor B do

BORIS

[25] e incluiu 10 CpG. Para realizar a sequenciação, o ADN de 3 ul de bissulfito tratado foram primeiramente amplificadas por PCR. Sequências dos iniciadores de PCR foram: BORIS-piro Atacante 5 ‘TGGTTTGTGGGTTTTGT 3’ e BORIS-piro ‘CCCTTCACCCCCCCTCTTT 3’ BIO 5 reverso. As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 5 min; 45 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 15 s e 72 ° C durante 1 min; e um passo de extensão final a 72 ° C durante 10 min. Então, a purificação e o processamento subsequente do fragmento de PCR de cadeia simples biotinilado foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante. Pirossequenciao deste fragmento de PCR foi realizada num instrumento PyroMark Q24 Q24 utilizando Pyro ouro Reagentes (Qiagen). O iniciador pyrosequencing (5 ‘GTGTTGTAGTTTATAGT 3’) foi utilizado a uma concentração final de 0,3 uM. Os dados resultantes foram analisados ​​e quantificados com o software PyroMark Q24 (Qiagen), que calcula a percentagem de metilação de CpG em cada local, permitindo comparações quantitativas.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTT . MTT (brometo de 3- (4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difeniltetrazólio, Sigma) de reagente foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células infectadas de modo estável foram semeadas a uma densidade de 25 × 10

3 células /cavidade em 24 cavidades /placas com meio contendo doxiciclina. Após 3 dias, as células foram incubadas com o reagente MTT (200 ug /ml de concentração final) durante 3 horas a 37 ° C. Em seguida, as células foram lisadas adicionando isopropanol /HCl durante 10 min e as placas foram suavemente agitadas durante 5 min. Os valores de absorvância foram determinados utilizando um leitor de microplacas (Synergy Mx, BioTek) a 570 nm. Cada experiência foi efectuada em triplicado e 3 experiências independentes foram realizados.

Análise de Apoptose

A apoptose foi medida em triplicado utilizando Anexina V Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) de acordo com os protocolos do fabricante. Resumidamente, 5 x 10

4 células /poço foram semeadas em placas de 12 poços e /placas foram cultivadas em presença de doxiciclina até confluência (5-7 dias). As células flutuantes, bem como as células tripsinizadas foram coletadas, lavadas com PBS e ressuspensas em 100 ul de tampão de ligação. Em seguida, foram adicionados 5 ul de Anexina V-V500 e 5 ul de 7AAD e incubados com as células durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a adição de 400 ul de tampão de ligação, as amostras foram imediatamente analisadas por Gallios citômetro de fluxo (Beckman Coulter). Pelo menos 5 × 10

4 eventos foram contadas para todas as amostras. A percentagem de células apoptóticas foi estimada após gating em eGFP e tRFP (transduzidas e doxiciclina-induzido, respectivamente) de células positivas.

análise Western blot

lisados ​​celulares totais foram obtidos usando tampão RIPA (Sigma ) na presença de cocktail inibidor de protease (Sigma) e quantificado usando o ensaio BCA (Thermo Scientific). Trinta microgramas de proteína foram carregadas num gel de SDS-poliacrilamida a 10%, seguido de blotting sobre uma membrana de nitrocelulose utilizando um aparelho de transferência semi-seco (Bio Rad). A ligação não específica foi bloqueada por incubação durante a noite em não gordo a 5% de leite em pó em tampão TBS-T (Tween 20 a 0,1% em solução salina tamponada com Tris, TBS) a 4 ° C. As membranas foram então sondadas com anticorpo anti-humano BORIS /CTCFL monoclonal de ratinho (produzido e gentilmente cedido pelo Dr. Dmitri Loukinov, NIH /NIAD) utilizado na diluição 1: 1000 em 1% de tampão de bloqueio (1% de baixo teor de gordura seca de leite em TBS -T tampão) e incubadas à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Como controlo de carga, anticorpo de ratinho anti-humano β-actina (Sigma) a 1: 5000 de diluição em tampão de bloqueio a 1% foi usada e incubadas à temperatura ambiente durante 45 min. As membranas foram lavadas 3 × com TBS-T e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora com peroxidase de rábano (HRP) de coelho marcado com IgG anti-ratinho (Sigma) diluída a 1: 5000 em tampão de bloqueio 5%. Após 3 × lavagem com TBS-T, as membranas foram desenvolvidos usando WesternBright Quantum (Advansta) e visualizadas com o Fusion FX Sistema de Quimioluminescência (Vilber Lourmat).

associada à senescência β-galactosidase coloração

associada com a senescência β-galactosidase (SA-β-gal) a coloração foi realizada utilizando o kit de coloração β-galactosidase (BioVision), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 5 x 10

4 células /poço foram semeadas em placas de 12 poços /placas em presença de doxiciclina e foram cultivadas até confluência (5-7 dias). Em seguida, as células foram lavadas com PBS, fixadas durante 15 min e incubadas com solução de coloração SA-β-Gal recentemente preparada a 37 ° C durante 24 horas. Após lavagem com PBS, a actividade SA-β-gal foi observada usando microscópio invertido (Nikon) por detecção de células coradas de azul. foram selecionados pelo menos 10 campos separados. Para cada campo do número de células coradas de azul e o número de células totais foram contados. Os resultados são expressos como percentagem de células-SA-β-gal positivos calculado como: (número de células azuis /número de células totais) x 100.

A atividade da telomerase

a actividade de telomerase foi medida usando kit de detecção de telomerase TRAPEZE RT (Millipore). Este ensaio quantifica a actividade de telomerase por SYBR Green PCR em tempo real quantitativo [26]. Resumidamente, as células foram lisadas em 200 ul de tampão CHAPS e as concentrações da proteína foram determinadas com NanoDrop 2000. Alíquotas de lisado celular (1,5 ^ g de proteína /amostra) foram usadas. amostras inativadas, as reações não-modelo e controlo positivo também foram testados pelo controle de qualidade. Uma curva padrão foi preparada por diluição em série do modelo de controle TSR8 seguindo as instruções do fabricante. amplificações em tempo real foram realizados utilizando Platinum Taq DNA Polymerase (2 unidades /amostra, Invitrogen). Andar de bicicleta e fluorescência aquisição foram feitas em Rotor Gene 6000 em tempo real sistema de PCR (Corbett Life Science). A atividade da telomerase foi calculada comparando os valores médios de Ct de cada amostra contra a curva padrão gerada pelo modelo de controle TSR8.

A análise estatística

A significância estatística foi avaliada utilizando estudante bicaudal teste t análise. P-value 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

In vitro

validação dos modelos moleculares (MBs)

Dois MBs diferentes específico.

BORIS

mRNA (BORIS-MB1 e BORIS-MB2) e um random-MB foram utilizados neste experimento. As temperaturas de hibridação e especificidade dos MBs foram testados em solução. A emissão de fluorescência destas MBs foi monitorizada a temperaturas variando de 25 a 80 ° C, em condições diferentes: MB sozinho, MB na presença do alvo específico, na presença de um alvo ou não específica na presença de um plasmídeo contendo ADNc de BORIS (pCMV-BORIS). Como mostrado na Figura S1, foi detectado sinal de fluorescência visível apenas quando os MBs foram misturados com os seus objectivos específicos. emissão de fluorescência com óptima relação aceitável de sinal-para-fundo ( 4) foi observada abaixo de 40 ° C. O ensaio também mostrou que BORIS-MBS discriminar estruturas de cadeia simples e dupla, uma vez que eles não emitem fluorescência quando incubadas com o plasmídeo pCMV-BORIS. Estes resultados demonstraram que MBs hibridar especificamente com as suas sequências alvo e fortemente sugerido que estas MBs seria capaz de se ligar especificamente ADN genómico e o ARNm não.

Detecção de

BORIS

ARNm utilizando BORIS-MB

em primeiro lugar, verificar se BORIS-MBs poderia ser capaz de distinguir as células positivas e negativas BORIS expressar em células vivas. RT-PCR quantitativa detectadas fortes níveis de

BORIS

ARNm em linhas de células NCCIT e OVCAR3, que este nível foi muito baixa em células de HeLa e não é detectável em células BJ (Figura 1A), em conformidade com estudos anteriores [12 ]. Portanto, para estudar a especificidade de MBs, NCCIT foi utilizado como um controlo positivo e células BJ como um controlo negativo. NCCIT células foram transfectadas com BORIS-MB1 ou BORIS-MB2 e emissões de fluorescência foram medidos por citometria de fluxo. Os sinais de fluorescência média de células transfectadas com BORIS-MBS foram maiores em comparação com o sinal de fluorescência média das células transfectadas com random-MB. Um aumento de 23,2 e 4,7 foi observada para Boris-MB1 e Boris-MB2, respectivamente (Figura 1B-C). No entanto, desde BORIS-MB1 proporcionou maior (5 vezes) significa sinal de fluorescência em comparação com BORIS-MB2, BORIS-MB1 foi selecionado para a análise subsequente. A partir daqui em diante BORIS-MB1 é referido como BORIS-MB. Como esperado, quando as células BJ BORIS negativos foram transfectadas com BORIS-MB, eles não mostram qualquer sinal de fluorescência (Figura 1D).

(A)

expressão BORIS

em linhas de células humanas. O ARN total foram isolados a partir de linhas celulares tumorais humanas: NCCIT (embrionárias), OVCAR3 (ovário), HeLa (cervical) e as células normais de fibroblasto (BJ). níveis de mRNA de

BORIS

foram analisados ​​por qRT-PCR. Os resultados foram normalizados para

GAPDH

e relacionados com células NCCIT. BJ e NCCIT foram considerados como controlos negativos e positivos, respectivamente. As barras de erro representam a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes. (B) Os sinais fluorescentes medidos por citometria de fluxo de células NCCIT transfectadas com ATTO647-BORIS-MB1 (pico cinza escuro) e com (pico branco) ATTO647-RANDOM-MB. (C) Os sinais fluorescentes medidos por citometria de fluxo de células transfectadas com NCCIT ATTO647-BORIS-MB2 (fraco pico cinzento) e com (pico branco) ATTO647-aleatória-MB. (D) Os sinais fluorescentes medidos por citometria de fluxo de células BJ tratados com ATTO647-BORIS-MB1 (daqui em diante referido BORIS-MB, pico cinzento) e com ATTO647-aleatória-MB (pico de branco). (E)

expressão BORIS

em células HeLa usando BORIS-MB. Imagens representativas de células HeLa transitoriamente transfectadas com o vector de expressão BORIS, pCMV-BORIS (inferior) e as células de controlo não transfectadas (topo), 20 x de ampliação. (F)

expressão BORIS

em linhas de células humanas como detectado usando BORIS-MB. Imagens representativas de BJ, NCCIT e células OVCAR3, 20 × ampliação. Para imagens de fluorescência, 1 × 10

6 células foram incubadas a 37 ° C durante 1 hora em meio DMEM isento de soro com Cy3 BORIS-MB (200 nM). Hoechst 33342 5 ug /ml foi adicionada durante os últimos 10 minutos de incubação. As lâminas foram analisadas por microscopia de fluorescência.

Para desafiar ainda mais a especificidade do BORIS-MB, as células HeLa que expressam

BORIS

ARNm em nível baixo, foram transientemente transfectadas com o pCMV- BORIS plasmídeo de expressão, que contém o ADNc humano fundido com BORIS verde gene de proteína fluorescente (GFP). Como esperado, as células transfectadas apresentaram sinais de fluorescência elevados tanto de GFP e Boris (Figura 1E). Todos juntos, estes resultados confirmaram a capacidade de o BORIS-MB com fiabilidade para detectar especificamente e

BORIS

ARNm em células vivas.

Assim, as linhas de células foram transfectadas com o BORIS-MB para visualizar

BORIS

expressão de mRNA por imagem de fluorescência. Como pode ser visto a partir da Figura 1F, o sinal de fluorescência do Boris-MB era claramente visível nas células NCCIT e OVCAR3, em que apenas um subconjunto das células estavam fluorescentes. A percentagem de células positivas BORIS nestas linhas celulares foi encontrado a estar entre 3 e 5%. Como esperado, na linha celular normal BJ não foram observadas células fluorescentes. Em células HeLa, o número de células positivas BORIS foi extremamente baixa, inferior a 0,1% (Figura 1E). Em geral estas experiências demonstraram que dentro de linhas de células tumorais,

BORIS

ARNm não está presente em todas as células, mas antes ocorre apenas num subconjunto de células.

Isolamento de população de células que expressam

BORIS

ARNm utilizando BORIS-MB

NCCIT foi utilizado para o isolamento de células BORIS-positivos. FACS triagem foi realizada após transfecção de células com BORIS-MB. As células BORIS-positivos e BORIS-negativos (8,4 ± 1,5 e 41,5 ± 7,2% do total, respectivamente, média ± SD) foram classificadas (Figura 2A)

células NCCIT (A) foram transfectadas com ATTO647-. Random-MB (pico de branco) e ATTO647-BORIS-MB (pico de cinza). As células duas subpopulações, BORIS-negativas e Boris-positivas foram seleccionados por comparação do sinal fluorescente de random-MB para que de BORIS-MB. Após a exclusão de células mortas por coloração com PI, as duas fracções foram classificadas. (B)

expressão das fracções BORIS-negativas e Boris-positivos isolados BORIS

foi analisada por qRT-PCR. Os resultados foram normalizados para a

GAPDH

e relacionadas com células não classificados NCCIT. As barras de erro representam a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes. Asterisco indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). Entre BORIS-positivas e células não-classificadas

BORIS

análise de expressão mostraram que

BORIS

mRNA nível de classificados células BORIS-positivos foi de 20 vezes mais elevada em comparação com as células não classificadas (Figura 2B). Este resultado demonstrou a eficiência do método de triagem e o enriquecimento bem-sucedida de uma população de células que expressa

BORIS

mRNA.

As células BORIS-positivos e BORIS-negativas isoladas têm padrão de metilação semelhante de BORIS promotor B

Em um estudo anterior, mostramos que

BORIS

expressão é controlada por três promotores alternativos, correspondendo aos locais de início da transcrição em -1447, -899 e -658 pb a montante do primeiro ATG e promotores designados como A, B e C, respectivamente [25]. Curiosamente, tem sido observado que, nos tumores, desmetilação de BORIS promotor B, está geralmente correlacionada com a expressão de

BORIS, o que não é o caso para os promotores C e A [25]. Consequentemente, nós interrogado a possível correlação entre a metilação do promotor B e expressão

BORIS

nas células classificadas. BORIS nível de metilação deste promotor foi medida por pyrosequencing, após a modificação com bissulfito de DNA extraído a partir de células BORIS-positivos e Boris-negativas. resultados pyrosequencing indicou que em ambas as frações, os CpGs foram fortemente metilado (85-100% metilação) e não foram detectadas diferenças (Figura 3A). Isto confirmou que, em células NCCIT,

BORIS

expressão foi não regulado pelo promotor B e sugeriu que a diferente expressão de

BORIS

entre as frações ordenados não foi guiado por estado de metilação do DNA do promotor de B, mas em vez envolvidos outros níveis de controle. análise

(a) metilação de 10 ilhas CpG dentro do

BORIS

região promotora (promotor B). O gráfico representativo mostra a porcentagem de metilação de cada ilha CpG para o isolado BORIS-positivo (branco), -negative (cinza) e células não-classificadas (preto) NCCIT. Análise (B) Expressão do isolado BORIS-positivas (branco) e as fracções BORIS-negativas (cinzento). Os genes indicados foram analisados ​​por qRT-PCR.