Abstract

Fundo

células endoteliais circulantes e micropartículas têm valor prognóstico em câncer, e pode ser preditores de resposta à quimioterapia e tratamentos anti-angiogénicos. Nós investigamos o valor prognóstico de células endoteliais circulantes e micropartículas em pacientes tratados por câncer de pulmão não-pequenas células avançado.

Metodologia /principais conclusões

Amostras de sangue periférico foram obtidas de 60 pacientes antes da primeira a linha, à base de platina quimioterapia +/- bevacizumab, e após o terceiro ciclo de tratamento. Amostras de sangue de 60 voluntários saudáveis, também foram obtidos como controlos. células endoteliais circulantes foram medidos por um microscopia técnica e imunofluorescência imunomagn�ica. micropartículas fosfatidilserina-positivas foram avaliadas por citometria de fluxo. actividade procoagulante mediada por micropartículas foi medida pelo ensaio de geração de trombina endógena. Resultados: os níveis pré e pós-tratamento dos marcadores foram maiores nos pacientes do que nos controles (p 0,0001). Níveis elevados de micropartículas foram associados com maior sobrevida. níveis pré-tratamento elevados de células endoteliais circulantes foram associados com menor sobrevida.

Conclusões /Significado

Os níveis circulantes de micropartículas e células endoteliais circulantes correlacionaram com o prognóstico, e poderia ser útil como marcadores de prognóstico em pacientes com cancro do pulmão de não pequenas células avançado

Citation:. Fleitas T, Martínez-Sales V, Vila V, Reganon E, Mesado D, Martín M, et al. (2012) células endoteliais circulantes e micropartículas como prognósticos Marcadores em Avançada Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (10): e47365. doi: 10.1371 /journal.pone.0047365

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 20 Abril de 2012; Aceito: 11 de setembro de 2012; Publicado: October 15, 2012 |

Direitos de autor: © Fleitas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por uma bolsa da Fundação para la Investigación, Hospital Universitário La Fe – Bancaja. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os seguintes indústrias: Roche Pharma, Amgen, Lilly, MSD, e Bayer contribuíram financeiramente a aquisição de reagentes e para a contratação de um técnico de laboratório, de acordo com o procedimento legal de fundação do Hospital La Fe de doações, sem qualquer tipo de interesse nos resultados do estudo, e que não participou em qualquer outro aspecto na o study.This não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o câncer de pulmão é um dos tumores malignos com maior incidência em todo o mundo. cancro do pulmão de não pequenas células (NSCLC) representa mais de 80% dos casos de câncer de pulmão, e a maioria deles tem doença avançada ou metastática no momento do diagnóstico [1].

quimioterapia à base de platina é o tratamento padrão para câncer de pulmão avançado. Vários dobletes platina são actualmente utilizados com eficácia semelhante, embora diferentes perfis de toxicidade [2]. Os progressos na compreensão da biologia do cancro tem conduzido ao desenvolvimento de medicamentos contra alvos moleculares específicos, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e os seus receptores (VEGFR). Alguns agentes citotóxicos e medicamentos direcionados são mais seguros ou mais eficaz em subtipos histológicos específicos, permitindo assim que os tratamentos mais personalizados [3]. Bevacizumab, um anticorpo humanizado contra VEGF, demonstrou um aumento modesto na sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (OS) em NSCLC quando combinado com quimioterapia. No entanto, seu uso é restrito a pacientes com histologia de células não-escamosas [4]. Apesar destes avanços, apenas uma fração dos pacientes beneficiam de tratamento e a maioria deles morrem dentro de 2 anos após o diagnóstico. Por isso, há uma necessidade de biomarcadores que permitem identificar pacientes que são mais propensos a responder ao tratamento.

circulantes células endoteliais (PEC) são marcadores de lesão vascular [5] que podem ter relevância clínica em câncer [6 ] – [7]. contagem de CEC é aumentada em pacientes de cancro [8] – [9], e se correlaciona com a progressão tumoral [10]. Sugeriu-se que a quantificação dos CECs é útil para identificar pacientes que podem se beneficiar de inibidores da angiogénese e para monitorar a resposta ao tratamento [11]. Em pacientes com cancro colo-rectal avançado, uma elevada contagem de CEC de linha de base está associada com um menor PFS mediana [12] – [13]. No entanto, em doentes com cancro da mama e com NSCLC, uma contagem de CEC alta da linha de base está associada com um PFS prolongado [11], [14].

Micropartículas (MPs) são pequenas vesículas (100 nm-1 uM) que bud directamente a partir da membrana do plasma [15] – [16]. Eles são libertados por células diferentes, incluindo sangue, células endoteliais e tumorais [16] – [17]. A exposição de fosfatidilserina sobre a superfície externa da membrana é uma característica específica de MPs [18]; a sua presença aumenta significativamente a actividade pró-coagulante de MPs, promovendo a montagem de componentes da cascata de coagulação. Além disso, as células tumorais gerar uma elevação de PM que expressam o factor tecidular [19] – [21], o que lhes confere um potencial pró-coagulante [22]. A este respeito, tem sido relatado que os níveis circulantes de MPs estão correlacionados com a produção endógena de trombina (GTE) [23]. MPs são aumentados em pacientes com câncer e que desempenham um papel no câncer relacionado hipercoagulabilidade [20] – [21], [24] – [26]. Além disso, a emissão de microvesículas, tais como exossomas e MPs, tem papéis patológicos importantes na progressão tumoral, facilitando a libertação e dispersão de células cancerosas para gerar metástases [27]. MPs obtidos a partir do sangue periférico de pacientes com câncer podem fornecer informações relevantes sobre o prognóstico e resposta ao tratamento.

O objetivo deste estudo foi avaliar a PEC, deputados e actividade pró-coagulante MP-mediada em pacientes com NSCLC avançado, antes e após a quimioterapia padrão, para analisar o seu valor prognóstico e procurando estabelecer a sua possível associação com a resposta do tumor.

Materiais e Métodos

desenho do estudo e pacientes

Este estudo prospectivo incluiu pacientes consecutivos com NSCLC tratados no Oncologia médica do Departamento de La Hospital Universitário Fe com quimioterapia de primeira linha de dobletes à base de platina. Bevacizumab foi adicionado ao tratamento quando indicado. Para ser incluído no estudo, os pacientes eram obrigados a seguir os seguintes critérios: idade 18 anos; estágio IIIB ou estágio IV confirmado histologicamente NSCLC; a expectativa de vida ≥12 semanas; ECOG Performance Status (PS) ≤2 e renal adequada, hepática e função da medula óssea.

O estadiamento foi determinada pelo tórax e tomografia computadorizada (TC) abdominal e tomografia de emissão de prótons corpo (PET). Três semanas após o terceiro ciclo de tratamento, a avaliação clínica baseada-CT foi levada a cabo utilizando os Critérios de Avaliação de Resposta para os tumores sólidos (RECIST) [28]. Após o tratamento, os pacientes foram avaliados a cada três meses. biomarcadores de sangue foram avaliadas na linha de base e três semanas após o terceiro ciclo de tratamento. O grupo controle foi composto por indivíduos saudáveis ​​pareados por sexo e idade com os pacientes. Pacientes e controles fornecidos consentimento informado por escrito. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional Biomedical Research.

Biomarcador Avaliação

As amostras de sangue foram obtidas por punção da veia cubital não traumática, e recolhidos em tubos de plástico Vacutainer ™ (BD) com diagnóstico dois anticoagulantes diferentes: K3 EDTA (4,3 mg) para PEC, e citrato de sódio (129 mM) a uma proporção de 1:09 (v /v, citrato de sódio /sangue) para MPs e ETG. As amostras foram mantidas a 4 ° C e processados ​​entre 2 e 4 horas após a colheita. amostras de sangue tratado com citrato foram centrifugados a 1500 xg durante 30 minutos a 4 ° C para se obter o plasma sem plaquetas, e, em seguida, armazenada a -80 ° C, para permitir posterior análise do lote.

A quantificação do Total de Micropartículas

As amostras de plasma contendo suspensões MP foram analisadas por citometria de fluxo. conjugados de anexina V-FITC foram utilizados para detectar a fosfatidilserina na membrana acessíveis MP. Dez ul de amostras de plasma congeladas foram diluídos em 500 ul de tampão HEPES contendo CaCl 2,5 mM

2 (pH 7,4). As amostras foram então incubadas durante 60 minutos a 4 ° C no escuro, com 1 mL de FITC-anexina V (TACS AnnexinV, Trevigen Inc). A aquisição de acontecimentos foi quantificado em um EPICS XL citómetro (Beckman Coulter) a um caudal elevado durante 2 minutos, durante o qual 325 ul desta suspensão foram analisados. grânulos fluorescente padrão de diâmetros diferentes foram utilizadas para a calibração de tamanho (0,5-3,0 microns, Megamix, BioCytex) e para definir o portão de detecção MP com um diâmetro 0,5-1 uM, seguindo uma orientação na medição consenso MP [29]. O tamanho das MPs correlacionada com a dispersão para a frente (FS) e sua granularidade com a dispersão lateral parâmetros (SS). O FS-canais ler, SS e fluorescência foram fixados em ganho logarítmica. Para limitar o ruído de fundo da poeira e cristais, todos os buffers de diluição foram filtradas usando filtros de 0,22 um (Millipore). Para diferenciar MPs de eventos devido ao ruído, PM foram identificados como partículas de 0,5 e 1,0 mm de diâmetro, e positivamente coradas para suspensão Anexina V. MP no plasma foi preparado sem cálcio como um controlo negativo. O número de MPs FITC-anexina V positivos foi calculada e expressa como eventos por mL de plasma.

Medidas trombina geração

ensaios ETG foram realizados para avaliar a capacidade de geração de trombina in vitro de plasma usando a plaquetograma automatizado calibrado (CAT, Thrombinoscope BV). Oitenta uL de amostras de plasma congeladas foram colocadas em placas de 96 poços de microtitulação de fundo redondo (Greiner Bio-One, ref650061, EUA). Cada amostra requer dois poços. Vinte mL de calibrador padrão de trombina (TS20.00 trombina calibrador, Thrombinoscope BV) foram adicionados a um poço, e 20 ul de substrato fluorogénico com trombina de cálcio (Fluka TS50.00 Kit Thrombinoscope BV) foram adicionados a ambos os poços de começar com a ETG contínua comparação com o reagente de trombina calibrador. A actividade de trombina foi medida como a fluorescência em um leitor Ascent Fluoroskan fluorímetro (Thermo Labsystems), equipado com um conjunto de filtro 390/460. foram adicionados nenhum fator tecidual exógeno ou fosfolipídios. curvas de geração de trombina foram calculados utilizando o software Thrombinoscope e os resultados foram expressos como pico de trombina (nM) (altura da curva).

Quantificação de células endoteliais circulantes

O isolamento e quantificação do PEC foram realizada em sangue total através de uma técnica imunomagnética, seguindo um protocolo de consenso [30]. PEC foram isolados a partir de sangue total a 4 ° C com PanMouse M450 Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) revestidas com sEndo1 (Biocytex, Marselha, França), um anticorpo monoclonal criado contra o antigénio endotelial CD146. Para evitar a ligação não específica de leucócitos a CD146 grânulos revestidos, as células foram incubadas após isolamento imunomagnética com FITC Ulex europaeus Lectina-1, (UEA1) (Sigma Aldrich, Inc.) durante 1 h no escuro, confirmando, assim, a natureza endotelial de as células isoladas. As amostras foram lavadas e suspensas em tampão, e as células contadas por microscopia de fluorescência usando uma câmara Nageotte. células nucleadas 10 um de comprimento, com mais do que cinco pérolas imunomagnéticas e coloração ligados UEA1 positivo foram consideradas como PEC. Conglomerados foram contados como uma célula. O número de PEC foi expresso como células por ml de sangue. A reprodutibilidade foi testada através da realização de seis repetições de dez amostras diferentes.

Análise Estatística

Os resultados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (SD) para as variáveis ​​contínuas, e como porcentagens para variáveis ​​categóricas. teste de Kolmogorov-Smirnov foram utilizados para avaliar se cada parâmetro seguido de uma distribuição normal. A análise de variância (ANOVA) com a análise post hoc de Bonferroni foi utilizado para avaliar diferenças de nível entre marcador tipos de amostras (controle, casos de pré-tratamento e casos pós-tratamento). correlação bivariada foi realizada utilizando o teste de correlação de Spearman. OS e PFS foram analisados ​​por meio do método de Kaplan-Meyer, e curvas de sobrevida dos subgrupos foram comparadas pelo teste de log-rank. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS, versão 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA). Probabilidade valores 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos

Resultados

características dos pacientes, tratamentos e Resultado

Entre Janeiro de 2009 e Setembro de 2010, sessenta pacientes e sessenta indivíduos saudáveis ​​eram. incluído. A tabela 1 resume as características clínicas do grupo de estudo. Os tratamentos recebidos pelos pacientes encontram-se descritos na Tabela 2. A toxicidade relacionada com o tratamento mais notável foi hematológica, com 15% de neutropenia febril de grau 3-4, e duas mortes por esta causa (ambos os pacientes receberam cisplatina + docetaxel). Apenas 2 pacientes apresentaram eventos trombóticos durante o tratamento: um paciente com tromboembolismo pulmonar e um paciente com trombose venosa profunda (ambos os pacientes receberam cisplatina + docetaxel). Dois pacientes apresentaram com hemorragia pulmonar grave, um deles relacionado com bevacizumab. Relativamente à eficácia, mais de metade dos pacientes apresentou uma resposta objectiva (58,3%). Median PSF foi de 10 meses (IC 95%, 7,9 a 12 meses) e OS mediana foi de 11 meses (IC 95%, 8,8 a 13,1 meses). Apenas 36 pacientes estavam vivos no momento previsto para o segundo extração de sangue.

Circulação marcador Níveis e Análise de Correlação

Os níveis de PEC, deputados e ETG em pacientes e controles são apresentados na Tabela 3. Os níveis médios de PEC e PM foram significativamente maiores (P 0,0001) em pacientes em comparação com os controlos. No entanto, não foram observadas diferenças significativas entre os níveis pré e pós-tratamento de PEC e MPs. Níveis de ETG foram significativamente aumentados em pacientes, apenas em amostras pré-tratamento (p 0,01)

As correlações entre os níveis de marcadores circulantes mostrou que os níveis de MP positivamente correlacionada com os níveis de ETG, tanto antes (Spearman, r. = 0,60, P 0,001) e após o tratamento (Spearman r = 0,68, P . 0.001)

circulação de marcadores e evolução clínica

A análise das associações entre circulam marcadores e resultados clínicos mostraram que os deputados níveis basais 3278 MP /mL (correspondente à 99

percentil nos controles) foram associadas com melhores PFS (15 vs 9 meses; p = 0,04) e oS (16 e 10 meses; p = 0,04) . Sem essa associação foi encontrada para PEC ou ETG (Tabela 4). Além disso, os níveis basais de PEC 152 células /ml (correspondendo à 75

percentil em pacientes) foram associadas com uma SO pior (16 meses versus 9 meses, respectivamente; log rank 4,3; p = 0,04) (Figura 1 )

o limite superior de referência foi calculado como valores de PEC 152 células /mL (correspondente aos

percentil do grupo de pacientes) PEC 75:.. células endoteliais circulantes

Discussão

os resultados do estudo mostram que a CEC, os níveis de MP, e ETG são elevados em pacientes com NSCLC em comparação com controles saudáveis. A quimioterapia não alterou os níveis destes marcadores. Nós também descobriram uma associação entre níveis elevados de MP, antes e após o tratamento, e sobrevivência. Além disso, observou-se uma associação entre os níveis de pré-tratamento de PEC e sobrevivência.

Nossos resultados mostram uma associação entre a alta pré e pós-tratamento níveis de MPs e maior sobrevida. Para nosso melhor conhecimento, este é o primeiro estudo que mostra tal associação em pacientes com NSCLC. Há um interesse crescente na caracterização de MPs e no seu papel potencial como biomarcadores em doenças diferentes [31]. Em pacientes com cancro da próstata resistente à castração, os níveis de MP elevados derivados das plaquetas foram associados a uma curta sobrevivência [32]. Um estudo realizado em pacientes com síndrome da angústia respiratória mostrou uma correlação positiva entre níveis elevados de MPs derivados de leucócitos e de sobrevivência [33]. Os resultados de um estudo experimental com um modelo de carcinoma de pulmão de murino Lewis, demonstraram que os PM derivada de linfócitos exerceu efeitos antiangiogénicos e pró-apoptóticos que conduziu à inibição do crescimento do tumor, reduzindo os níveis de VEGF [34]. Embora tenhamos MPs não caracterizados pela sua origem celular, estas descobertas podem fornecer e explicação para a associação positiva entre os níveis de MP e de sobrevivência que temos encontrado no presente estudo.

Foi observada uma forte correlação entre os níveis de MP e ETG. Esta descoberta está de acordo com os dados anteriores, indicando que a presença de deputados no plasma afeta significativamente ETG em ambos os normais [35] e condições patológicas [23], [36]. O aumento do número de MPs circulantes e sua correlação com níveis elevados ETG observados em nosso estudo corrobora o papel de ETG em hipercoagulabilidade câncer, conforme relatado anteriormente [29] – [33]. Além disso, como demonstrou recentemente, a medição da ETG podem identificar pacientes com câncer de alto risco de tromboembolismo venoso [37].

Foi observada uma associação entre níveis elevados de pré-tratamento de PEC e baixa sobrevida. Não há dados conclusivos sobre o valor prognóstico da PEC no câncer. A maioria dos estudos concorda que altos níveis de PEC estão associados a um mau prognóstico [10], [12] – [13]. No entanto, outros estudos são controversos [11], [14]. Beerepoot et ai. [10] estudaram os níveis de PEC viáveis ​​em pacientes com vários tipos de cancro; eles descobriram que a contagem CEC foram maiores nos pacientes do que em indivíduos saudáveis, e que a quimioterapia aumentou a contagem CEC. Estes autores definiram PEC como CD146 +, com coloração com CalceinAM adicional para quantificar as células viáveis; não há outros marcadores, tais como UEA1, foram utilizados para confirmar a natureza endotelial das células. O estudo de Kawaishi et al. [14] encontraram uma associação entre o aumento dos níveis de pré-tratamento de PEC e bom prognóstico em pacientes com NSCLC. Neste estudo, o CD146 endotelial marcador, o marcador de ADN DAPI, e os CD105 marcador de activação foram usadas para seleccionar PEC, juntamente com CD45 para descartar células hematopoiéticas. Em contraste, nos pacientes com carcinoma colorrectal tratados com quimioterapia e bevacizumab, Ronzoni et ai. [12] encontraram contagem CEC descanso a ser menor nos doentes que atingiram uma resposta radiológica em comparação com pacientes que não obtiveram resposta. O estudo de Matsusaka et al. [13], mostrou que os pacientes com níveis de pré-tratamento de CXCR4 positivo PEC 20% de células mononucleares teve pior PFS e OS. Estes resultados são consistentes com os obtidos no nosso estudo, onde os altos níveis de PEC foram associados com um mau SO. Dada a variedade de técnicas utilizadas para a quantificação de células endoteliais, são necessários esforços para identificar os fenótipos celulares mais adequadas para cada situação clínica e explicar controvérsias atuais.

Nossos resultados fornecem novos dados sobre o valor prognóstico de MPs e PEC em pacientes com NSCLC. O papel dos deputados e PEC como potenciais biomarcadores em pacientes com NSCLC, tratados com quimioterapia convencional ou terapias específicas, merecem um estudo mais aprofundado, uma vez que uma melhor compreensão do seu papel pode abrir novas perspectivas nas áreas de diagnóstico e tratamento.

Agradecimentos

os autores gostariam de agradecer a Rafael Rosell e Stefano Indraccolo para fornecer comentários úteis sobre o manuscrito. Eles também agradecer Josefa Llorens, Ursula Salinas e Adela Manez por sua assistência técnica.