Abstract

Muitos genes diferencialmente metilados foram identificados no câncer de próstata (PCA), recorrendo principalmente a ensaios baseados no gene candidato. Recentemente, vários perfis de metilação do DNA globais têm sido relatados em APC, no entanto, cada uma delas tem pontos fracos em termos de capacidade de observar alterações globais de metilação do DNA em CaP. Nossa hipótese é que há ainda não identificado metilação do DNA aberrante no APC, que podem ser identificados utilizando métodos de ensaio de maior resolução. Utilizou-se o recém-desenvolvido Illumina HumanMethylation450 BeadChip no PCA (

n

= 19) e adjacentes tecidos normais (

n

= 4) e combinou-os com os dados de expressão de genes para identificar nova metilação do DNA que pode ter consequências funcionais no desenvolvimento de CaP e progressão. Nós também confirmou nossos resultados de metilação em um conjunto de dados independente. Dois genes aberrantes de metilação do DNA foram validados entre um 56 amostras de CaP adicionais e 55 tecidos normais adjacentes. Um total de 28,735 locais CpG mostraram diferenças significativas na metilação do DNA (FDR ajustado

P Art 0,05), definida como uma diferença média de metilação de, pelo menos, 20% entre APC e amostras normais. Além disso, um total de 122 genes tinham mais do que um local de CpG metilado diferencialmente na sua região promotora e um padrão de expressão do gene que foi inversa à direcção da mudança na metilação do ADN (por exemplo, diminuição da expressão com aumento da metilação, e vice-versa). metilação anormal do DNA de dois genes,

AOX1

e

SPON2,

foram confirmadas através de sequenciação de bissulfato, com a maior parte dos seus respectivos locais de CpG que mostram diferenças significativas entre amostras de tumores e tecidos normais. O

AOX1 e região promotor mostrou hipermetilação em 92,6% das 54 amostras testadas CaP em contraste com apenas três dos 53 testados tecidos normais. Este estudo usou um novo BeadChip combinados com dados de expressão gênica em CaP para identificar novos locais CpG metilados diferencialmente localizados dentro de genes. Os genes diferencialmente metilados recém-identificados podem ser usados ​​como biomarcadores para o diagnóstico CaP

Citation:. Kim JW, Kim S-T, Turner AR, Jovem T, Smith S, Liu W, et al. (2012) Identificação de genes diferencialmente New metilados que têm consequências funcionais potenciais no câncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e48455. doi: 10.1371 /journal.pone.0048455

editor: Ludmila Prokunina-Olsson, do National Cancer Institute, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2012; Aceito: 26 de setembro de 2012; Publicado: 31 Outubro 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede CA106523, CA95052, e CA105055 (a JX); CA135008 (a WL e WBI); CA133066 (a WL e JWK) eo PC051264 concessão Departamento de Defesa (a JX). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metilação do ADN é uma adição covalente de um grupo metilo no átomo de carbono 5 da posição de uma base de citosina e esta mudança epigenética é encontrada quase exclusivamente em dinucleótidos citosina guanina (CpG) em células humanas diferenciadas [1]. locais CpG são encontradas principalmente em sequências repetitivas ou ilhas CpG (CGI), que são regiões de CpG ricos que podem ser encontrados em todo o genoma humano. No tecido cerebral humano normal, foram encontrados menos do que 3% de CGI localizado em regiões promotoras a ser metilado, em contraste com até 34% de CGI localizado em regiões intragênicos foram metilados [2]. No entanto, CGI metilação em regiões promotoras está bem documentada em diversos estudos, devido à associação com silenciamento de genes [3] – [5]

metilação anormal do DNA entre amostras de cancro e tecidos normais foi amplamente observado em vários cancros, incluindo. CaP [6] – [9]. Mais de 67 genes diferencialmente metilados foram identificados em APC, principalmente com base em métodos de ensaio específicos para genes [10]. Os desenvolvimentos recentes nas técnicas de state-of-the-art, como a tecnologia de microarrays e sequenciamento de próxima geração têm marcou o início de uma nova era epigenômico em estudos de metilação de ADN [11] – [14]. Vários estudos têm relatado padrões aberrantes de metilação do DNA do genoma nas amostras de tecido APC, utilizando microarrays Agilent ilha CpG, Illumina HumanMethylation27 (HM27) BeadChips ou métodos de sequenciamento de próxima geração [15] – [20]. Quatro papéis relataram perfis de metilação do DNA usando o HM27 BeadChip [17] – [20]. Kobayashi et ai. relatados mais de 8.000 locais CpG metilados diferencialmente (DMC) em amostras de CaP em comparação com tecidos normais adjacentes utilizando um número relativamente grande de amostras [18]. Mahapatra et ai. identificados e confirmados muitos genes metilados de forma aberrante que podem ser utilizados como biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico [20]. Este método HM27 BeadChip fornece dados de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único em mais de 27.000 locais de CpG. No entanto, esta plataforma HM27 cobre apenas 0,1% de todos os locais CpG no genoma humano e todos os locais de teste CpG estão localizadas em regiões promotoras.

MethylPlex de próxima geração seqüenciamento (M-NGS) combina enriquecimento enzimática de metilado ilhas CpG com uma técnica de sequenciamento de última geração [16]. Este método foi utilizado por Kim et ai. para identificar 2.481 regiões diferencialmente hypermethylated específicos do cancro em regiões promotoras, comparando amostras APC, tecidos normais adjacentes, e tecidos da próstata livre de doença. No entanto, quando se utiliza este método, Kim et al. não relatou qualquer resultado em regiões hypomethylated em CaP. Além disso, o tamanho das regiões diferencialmente hipermetilado relatado por Kim et ai. foi relativamente grandes (3000 pares de bases). Usando este método, pode difícil identificar regiões do núcleo metilado que são críticos para a regulação da expressão do gene; Por conseguinte, um ensaio adicional é necessária para a avaliação exacta da metilação do DNA em sítios CpG individuais [21]. Apesar das fraquezas de cada técnica, estes estudos de metilação do DNA do genoma forneceram evidências de que há um monte de sites não identificados diferencialmente metilados CpG (ou regiões, dependendo das técnicas de ensaio), e estes DMC não identificada pode ter um valor importante como nova droga alvos e biomarcadores de diagnóstico ou prognóstico.

Illumina HumanMethylation450 (HM450) é uma plataforma BeadChip recém-desenvolvido, que pode testar mais de 480.000 locais de CpG individuais no genoma humano [22], [23]. Esta cobertura corresponde a cerca de 1,7% de todos os locais CpG no genoma humano, e representa um enorme aumento do antecessor HM27 BeadChip (0,1% de todos os locais CpG). A alta correlação entre os dados HM450 e todo o genoma de dados de seqüenciamento bissulfito indica que esta nova BeadChip pode fornecer dados de metilação do DNA de confiança para os estudos de perfis epigenômicos [23].

Foi realizado um estudo piloto usando este novo BeadChip HM450 para avaliar amostras APC e tecidos normais adjacentes. Um conjunto de genes que são desregulados por metilação de ADN aberrante em CaP foi identificado e, em seguida, combinados com os dados de expressão de genes independentes. Em seguida, focada em dois genes aberrantes de metilação do DNA (

AOX1

e

SPON2

), com a confirmação de análises usando tecidos da próstata normais adicionais APC e adjacentes.

Materiais e Métodos

estudo

Todos os tecidos espécimes neste estudo foram obtidas a partir de pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical no tratamento da doença clinicamente localizada no Instituto Karolinska, na Suécia (

n

= 23) eo Hospital Johns Hopkins (JHH;

n

= 111). Todas as amostras de próstata utilizados para este estudo foram coletadas após apropriadas assuntos humanos aprovações foram obtidas e documentação escrita de consentimento informado foi fornecido. Todos os protocolos de estudo foram aprovados pelo Instituto Karolinska, ou o Hospital Johns Hopkins ou a Floresta University School of Medicine Institutional Review Board Wake. amostras sujeitos foram selecionados com base na capacidade de obter DNA genômico de quantidade suficiente e pureza ( células cancerosas 70% para amostras de cancro, sem células cancerosas detectáveis ​​para amostras normais) por macrodissection de correspondido ao lado não-malignas (doravante referida como normal ) e câncer contendo áreas de tecido da próstata, conforme determinado pela avaliação histológica de hematoxilina e eosina secções congeladas manchadas de espécimes de prostatectomia radical. O DNA genômico foi isolado a partir de tecidos congelados recortada, como descrito anteriormente [24].

DNA metilação Ensaio

ampla Genome-profiling de metilação do DNA foi realizada utilizando o BeadChip HM450 (Illumina, San Diego, CA) . DNAs genómicos foram modificados utilizando o kit-DNA EZ metilação (Zymo Research, Orange, CA) seguindo as recomendações de Illumina. O ensaio Illumina Infinium também foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante.

amostras de DNA foram modificadas, em preparação para a sequenciação conforme descrito anteriormente [25]. primers de seqüenciamento bissulfito foram concebidos por software Metil Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) para amplificar DNA modificado bissulfito (Tabela S1). Hot Start reacção em cadeia da polimerase (PCR) (Qiagen, Valencia, CA) foi realizada utilizando o seguinte programa de ciclos: 95 ° C durante 15 minutos; 94 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 30 segundos para 50 ciclos; e uma etapa final a 72 ° C durante 10 minutos. Os produtos de PCR amplificados foram subclonados utilizando o estojo de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após a transformação da

Escherichia coli

, foram selecionados aleatoriamente aproximadamente 10 a 20 individuais

E. coli

colônias para cada amostra avaliada. Plasmídeo de DNA foi diretamente amplificado (kit de amplificação Templiphi; GE Healthcare, Piscataway, NJ) e depois sequenciado usando Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kits v1.1 (Applied Biosystems) com o iniciador directo M13

Cada bisulfite sequenciação set. foi avaliado utilizando conjuntos de ADN de controlo reconstituído que eram misturas em quantidades variáveis ​​(0, 20, 50, 80 e 100%) de metilação de dois ADN de controlo;

M.SssI

DNA tenha sido tratada com o DNA metilado (Millipore, Billerica, MA) e genoma de DNA amplificado inteiro como DNA não metilado [26], [27].

Os dados da sequência bissulfito foram comparados com a sequência de referência genoma UCSC, a fim de avaliar o estado de metilação de cada sítio CpG utilizando software BIQ Analyzer [28]. Os clones com um mínimo de taxa de conversão de 95% de bissulfito foram incluídos nas análises subsequentes. Cada sítio CpG no nosso dados de sequenciação foi contado a partir da 5 ‘para 3’. locais CpG 2 e 34 no

AOX1 e região promotora foram excluídos da análise posterior por causa de uma freqüente falta de nucleotídeo único no longo timina homopolim�ica se estende em torno de cada um desses locais CpG.

Publicado metilação e expressão dados

DNA Raw dados metilação em CaP usando HM27 foram baixados do Gene Expression Omnibus, um repositório de dados pública [18]. Estes dados foram gerados utilizando metilação 86 tecidos da próstata adjacentes normais e 92 amostras de CaP primárias. dados de expressão gênica em CaP que foi com base no Affymetrix Exon 1.0 ST matriz foram baixados da web site de portal de dados (https://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/) [29]. Estes dados de expressão foram gerados utilizando 29 tecidos normais adjacentes, 131 amostras de CaP primários e metastáticos 19 amostras de CaP. log normalizada

2 transformada em nível de gene de dados (transcrição integral de intensidade de sinal) foram utilizados para análise estatística.

Análise Estatística

Os dados brutos HM450 foram obtidos utilizando software GenomeStudio (Illumina) após a digitalização os BeadChips. ajuste de cor equilíbrio, normalização escala simples e análise de agrupamento hierárquico não supervisionado foram realizadas usando o Bioconductor

lumi

pacote [30]. O valor β (metilação) foi calculada com base na equação sugerida pela Du et al. [31]. O valor β é uma variável contínua entre 0 e 1, com valores de p que se aproxima de uma (ou 0), indicando metilação completa (ou nenhuma metilação, respectivamente) em cada sítio CpG. CpG sites que tiveram de detecção

P

valores maiores que 0,05, foram excluídos.

associação entre cada fenótipo ou parâmetro clínico-patológico e metilação do DNA em cada local de CpG foi testado separadamente nos dados HM450. Estes testes estatísticos foram realizados com um modelo generalizado linear usando PROC GENMOD no software SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC) [32]. O beta-distribuição de valores beta foi contabilizado com um link logit binomial e uma variável de escala estimada com resíduos de Pearson. Nós determinamos se cada site individual CpG foi estatisticamente significativa com base na taxa de falsas descobertas (FDR), a fim de corrigir possíveis falsos positivos de testes múltiplos (a = 0,05). Nós também posteriormente calculada a metilação (valor β) médio de um site CpG em cada grupo e de sites selecionados CpG que tiveram maior ou igual a 0,2 diferença média metilação entre dois grupos de comparação [27], [33]. Portanto, um CpG metilado diferencialmente (DMC) foi definida como um sítio CpG que tinha um FDR ajustado

P

valor 0,05 a partir de um modelo generalizado de ensaio linear e uma diferença média entre a metilação dois grupos de comparação maiores ou iguais a 0,2 (Figura 1). Os dados HM27 também foram processadas utilizando o mesmo procedimento.

Foi utilizado o teste exato de Fisher para testar as associações entre DMCs e localizações genômicas em todo o genoma. O teste estatístico para a expressão do gene foi realizada com o teste de Wilcoxon Rank Sum no software SAS. Nós determinamos se cada gene indivíduo foi estatisticamente significativa com base na FDR ajustado

P

valor (α = 0,05).

Resultados

Identificação da diferencialmente metilados Sites CpG em CaP

Realizamos todo o genoma de perfis de metilação do DNA usando o Illumina HM450 BeadChip. Foram avaliadas quatro amostras de tumores emparelhado e tecidos normais adjacentes, além de 15 amostras tumorais desemparelhados adicionais que foram originalmente coletadas de indivíduos suecas (Tabela S2A). Após a normalização, todos os 23 amostras de tecido mostraram distribuições de intensidade de sinal muito semelhantes, enquanto agrupamento hierárquico não supervisionado em todo o conjunto de dados de metilação do DNA mostrou os dois grupos principais foram, cada um composto por um fenótipo; tumor ou normais (Figura S1). Esta separação clara entre APC e amostras normais indicaram um padrão de metilação do DNA diferentes entre dois fenótipos.

Para identificar DMCs aberrantes no câncer de próstata, foi realizada a análise estatística e reduzimos a selecção de locais CpG com base nas diferenças de metilação do DNA ( Figura 1). Um total de 28,735 locais CpG mostrou significância estatística com FDR ajustado

P Art 0,05 e pelo menos 0,2 diferença média metilação entre APC e amostras normais (Tabela S3). Estas 28,735 DMCs incluiu 20,187 locais CpG hypermethylated (hiper-DMCs) e 8.548 hypomethylated CpG locais (hipo-DMCs) em tumores, em comparação com os tecidos normais. Curiosamente, 69,5% de hiper-DMCs (extragrandes 14,038 locais CPG) foram localizados em CGI, costas CGI ou prateleiras CGI, mas apenas 37,0% de hipo-DMCs foram encontrados nessas regiões (exato de Fisher bicaudal

p

10

-44; Tabela 1A). Além disso, a distribuição de hiper identificados e hipo-DMCs em tumores foi estatisticamente diferente entre as categorias região do gene fornecidas pelo fabricante (exato de Fisher bicaudal

p

= 2,0 × 10

-44; Tabela 1B ) [23]. Hyper-DMCs foram mais frequentemente identificadas em regiões promotoras proximal (incluindo local de início da transcrição [TSS] 1500, TSS200, região 5’untranslated [UTR] and1st exão) do que hipo-DMCs, no entanto hipo-DMCs foram mais frequentemente encontradas em não-promotor regiões (incluindo o corpo do gene e 3’UTR).

Um total de 19.570 DMCs localizados em regiões gênicas, correspondeu a 7.031 genes únicos. Um total de 32 de 67 genes previamente relatados em CaP ter hipermetilação do promotor foram identificados na nossa lista (Tabela S4) [10]. Este número excede o número de genes comuns a partir do método de H-NGS (20 genes comuns), que é um tanto surpreendente, porque H-NGS proporciona melhor cobertura prática de CpG genómico (29,6%) sítios em comparação com o HM450 BeadChip (1.7%) [ ,,,0],16].

Nós comparamos os nossos resultados com conjuntos de dados publicados. Entre 28,735 DMC, um total de 1,175 locais de CpG estavam presentes nos BeadChips HM27 que foram utilizadas num estudo anterior CaP [18]. A análise estatística indicou que 1,157 (98,5%) de 1,175 locais de CpG ADN mostrou metilação significativamente diferente entre amostras tumorais e normais (FDR ajustado

P

0,05) e todos estes locais CpG 1,157 mostrou o mesmo sentido de mudança de metilação nos dois conjuntos de dados (928 hiper-DMCs e 229 hipo-DMCs, Tabela S3).

Associações DMC com Gene desregulamentado Expressão em CaP

Para encontrar a metilação do DNA aberrante que pode causar gene mudança expressão em APC, foram analisados ​​dados de expressão de genes entre a nossa lista de genes DMC. Para aumentar a probabilidade de identificar verdadeiros positivos, só testado genes que preencheram três critérios. Em primeiro lugar, mais do que um DMC foram identificados em regiões promotoras proximais (TSS1500, TSS200, 5’UTR e exão 1) de um gene; segundo, pelo menos, três quartos dessas múltiplas DMCs em uma região promotora do gene tinham a mesma direção das mudanças de metilação (hiper ou hipometilação em PCA); Em terceiro lugar, pelo menos uma DMC em uma região de promotor de gene tinha, pelo menos, 0,4 diferença média entre a metilação do cancro e fenótipos normais. Com base nestes critérios, um total de 276 genes foram seleccionados a partir de 9.643 DMC que foram localizadas nas regiões promotoras de genes proximais e disponíveis 269 os dados de expressão de genes correspondentes foram testadas [29]. Um total de 122 genes mostraram diferenças significativas na expressão gênica entre amostras tumorais e normais (FDR ajustado

P Art 0,05 e correlação inversa entre a metilação do DNA e mudança de expressão, Tabela 2 e Tabela S5). Este conjunto incluiu sete genes de metilação conhecidas em APC, por exemplo,

GSTP1, CAV1 e RARB

. Um total de 65 de 122 genes estão confirmados para ter metilação diferencial nos dados HM27 [18]. Estes 65 genes os dados confirmados em HM27 mostrou o mesmo sentido de mudanças de metilação com os nossos dados HM450. Além disso, 55 dos 122 genes foi identificado como cDMRs em dados de sequenciamento de metilação de próxima geração (M-NGS) [16].

Confirmação da AOX1 Promotor Hipermetilação em amostras adicionais CaP

Entre o conjunto de 122 genes metilados de forma aberrante,

AOX1

, que codifica aldeído oxidase 1 e está localizado no cromossomo 2q33.1, foi o gene mais significativamente regulada em amostras APC, com base em dados HM450 . As mudanças na metilação do DNA e expressão gênica de

AOX1

entre APC e tecidos normais foram muito semelhantes ao

GSTP1

(Tabela 2). Um total de 13 dos 19 testados locais CpG no

gene AOX1

foram identificados como hiper-DMCs (gama de FDR ajustado

P

: 7,4 × 10

-8~0.01 e gama de diferença média metilação: 0.20~0.52) e 11 destes 13 DMCs estavam localizadas em regiões promotoras proximais (Tabela 2 e Figura S2A)

Dois locais CpG no

região do promotor AOX1

. também foram confirmados como hiper-DMCs no conjunto de dados HM27 independente (Tabela S3 e Figura S2A) [18]. Mahapatra et ai. Também este gene identificado como um gene diferencialmente metilada usando a mesma plataforma HM27 [20]. Kim et al. identificou uma região diferencialmente metilado em

AOX1

que se sobrepõe com os nossos 13 locais hiper-DMC e utilizando o método M-NGS em amostras de CaP [16]. Kim et al. também se apresentou seqüenciamento bissulfito do

AOX1

promotor em duas linhas de células de próstata, nos quais confirmados indícios de metilação diferencial no

AOX1

. Contudo estado de metilação em amostras de tecido APC com resolução de nucleotídeo único ainda não foi realizado.

Por isso, usamos seqüenciamento bissulfito para confirmar a nossa descoberta no

AOX1 gene

entre CaP adicional e normal da próstata amostras de tecido (Tabela S2B). Nós ampliou o

AOX1 e região promotora, que incluiu 5 hiper-DMCs e sobrepostas com uma ilha de CpG, então sequenciado depois da transformação bacteriana (Figura S2A). Os dados de uma série de DNAs de controle, apresentaram resultados confiáveis ​​deste bisulfite conjunto de sequenciação (Figura S2B). Entre um total de 107 amostras de tecido de JHH incluindo 54 amostras APC e 53 tecidos normais (51 pares combinados), observou-se a

AOX1

promotor do gene a ser fortemente hipermetilado em amostras de CaP em comparação com tecidos normais em todos os 34 sítios CpG testadas (média metilação em todos os 34 locais CpG: CaP

vs

normais = 0,73

vs

0,07, Figura 2A e Tabela S6..); essas diferenças foram estatisticamente significativas (FDR ajustado

P Art 8,8 × 10

-11). Nós plotados a metilação média de todos os 34 locais de CpG em cada amostra de tumor e as amostras normais correspondentes (

n

= 51, Figura S2C). Este lote indicado a quase todas as amostras de tumor tinha maior do que o valor médio de 0,3 a metilação no

AOX1

promotor, enquanto que o tecido normal adjacente emparelhado tinha metilação relativamente menor (menos do que o valor médio de metilação 0,3). Depois de analisar estes dados, vamos definir arbitrariamente um nível de corte de 0,3 para a atribuição de

AOX1

metilação do promotor de distinguir tumor do tecido normal (Figura 2B). A sensibilidade da metilação do DNA na AOX1

promotor para a detecção de CaP foi de 92,6% (50 de 54 amostras testadas PCA) e 94,3% de valor positivo de previsão. Nós não fomos capazes de calcular especificidade nesta população de replicação, porque as amostras incluídas tecidos normais adjacentes de pacientes APC. No entanto, 50 dos 53 (94,3%) dessas amostras normais apresentaram resultados negativos da

AOX1

metilação do promotor.

A. metilação média de 34 sítios CpG testados em cada fenótipo. As barras de erro indicam intervalos de confiança de 95% para cada site CpG. B. Distribuição de

AOX1

metilação do promotor em cada fenótipo. Cada círculo ou quadrado representa a metilação média de 34 testados locais CpG em cada amostra de tecido testado.

Confirmação da SPON2 Promotor hipometilação em amostras adicionais CaP

SPON2

, que codifica espondina 2 e está localizado no cromossomo 4p16.3, foi o segundo gene mais up-regulada entre o conjunto de 122 genes significativamente desregulados na APC, com base em dados HM450. Um total de cinco sítios CpG no

SPON2

promotor foram identificados como hipo-DMCs (gama de FDR ajustado

P

: 2.1 × 10

-14~8.0 × 10

intervalo -8 e da diferença média metilação: -0.20~-0,50) e estes cinco DMCs também foram localizados na região promotora LOC100130872 (Tabela 2)

Nós metilação também confirmou do

SPON2

região promotora, que inclui cinco hipo-DMC e situa-se numa margem ilha CpG, utilizando o mesmo método de sequenciação de bissulfito descrito acima (Figura S3A). Os dados de uma série de DNAs de controle, apresentaram resultados confiáveis ​​deste bisulfite conjunto de sequenciação (Figura S3B). Um total de 109 amostras de tecido JHH incluindo 54 amostras APC e 55 tecidos normais (54 pares combinados) foram testados para a

SPON2

metilação do promotor. O resultado do seqüenciamento bissulfito mostraram hipometilação do

SPON2

promotor do gene em amostras de CaP em comparação com tecidos normais, e estas diferenças foram estatisticamente significativos em 25 dos 27 testados locais CpG (diferença média metilação entre amostras APC e tecidos normais : -0,27 -0,1 ~, Figura 3 e Tabela S7). No entanto, os valores de metilação neste conjunto de 25 locais CpG mostrou mais variação do que o que observamos para o AOX1

promotor (Figura 2A). Um total de 55 tecidos normais mostrou metilação do DNA médio entre 0,46 e 0,81 nos 25 locais de CpG, mas amostras PCA (

N

= 54) mostrou a metilação de DNA média entre 0,30 e 0,63. metilação do DNA do

SPON2

promotor não mostrou qualquer associação com os parâmetros clínico incluindo a idade no momento da cirurgia, pontuação de Gleason e estádio TNM em amostras APC e tecidos normais (dados não mostrados).

cada círculo ou quadrado representa a metilação média de 27 locais CpG testados em cada fenótipo. As barras de erro indicam intervalos de confiança de 95% para cada site CpG.

DMCs associados a propriedades clínicopatológicos

Para identificar locais CpG associados a propriedades clínico-patológicas, foram comparados os dados de metilação de amostras APC com Gleason score ou o estado de recorrência bioquímica (BCR). Em primeiro lugar, as amostras de CaP foram divididos pelo escore de Gleason (inferior Gleason 6 e 3 + 4 vs. maior Gleason 4 + 3, 9, 10). Um total de 245 locais CpG foram identificados como Gleason score DMCs associadas (FDR ajustado

P Art 0,05), mas apenas 40 locais CpG mostrou superior a 0,2 diferença média metilação entre maior e menor Gleason PCA (Tabela S8) . Dados de 22 genes que tiveram escore de Gleason DMCs associados em regiões gênicas de expressão de genes foram testados para a associação com a pontuação de Gleason em amostras APC. Entre estes 22 genes testadas, apenas

PPARGC1A

mostraram diferenças significativas de expressão genética entre os tumores com menor Gleason contra o maior Gleason PCA (FDR ajustado

P

= 0,022). Além disso, a metilação de

PPARGC1A

(cg12691631) foi inversamente correlacionada com a expressão do gene (Figura S4)

As comparações entre BCR (recorrência bioquímica;. Definida como detecção de PSA total superior a 0,2 ng /ml após a cirurgia) e grupos não-BCR identificados apenas dois locais de CpG como DMC (cg11385353 em

AGXT Comprar e cg14218447 numa região intergénica) usando FDR ajustado

P Art 0,05 e superior a 0,2 médio diferença de metilação entre dois grupos. Estes dois locais CpG apresentaram diferença significativa após ajuste para informações sobre o tratamento. No entanto, a expressão do gene da

AGXT

não mostraram diferença entre BCR e não-BCR principal PCA (dados não mostrados).

Discussão

Nós testamos a metilação do DNA em mais de 480.000 locais CpG usando o HumanMethylation450 Beadchip em amostras APC e tecidos normais. Nós com sucesso identificados 28,735 locais CpG diferencialmente metilados em CaP. Muitos dos DMCs identificados foram repetições independentes de descobertas anteriores de metilação do DNA diferencial de CaP [16], [18]. No primeiro, 98,5% (1.157 de 1.175) dos locais comuns CpG que estavam presentes na nossa lista DMC eo HM27 BeadChip mostraram diferenças de metilação significativas no conjunto de dados anterior [18]. Na segunda, um total de 1.014 fora de 2.481 (40,9%) regiões metiladas específicos do cancro que foram identificados usando o método M-NGS em APC, sobreposto com nossos DMCs [16]. Ao considerar as enormes diferenças na cobertura prática CpG destes dois métodos (M-NGS

vs

. HM450:29.6%

vs

. 1,7%), a taxa de concordância de 40,9% pode ser considerado muito elevado.

a distribuição de DMC no HM450 mostrou um padrão semelhante para a distribuição de DMC em uma linha de células de cancro do cólon [22]. Sandoval et ai. encontrado que os locais CpG mais hipermetilado foram localizados em CGI, costa CGI, e regiões de prateleira CGI, enquanto que mais de metade dos locais de CpG hipermetilado foram identificados em regiões do promotor proximal. Nossos dados foi consistente com a observação, mostrando que 69,5% de hiper-DMCs foram localizados em CGI, costa CGI, e as regiões de prateleira CGI, enquanto que 52,4% de hiper-DMCs foram identificados em regiões promotoras proximais.

ter notado que um total de 6.907 locais de CpG ensaiadas pela BeadChip HM450 acontecer a ser localizado dentro de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) loci. Um total de 336 locais CpG entre os 28,735 DMC que foram identificados também localizado em loci SNP, tal como indicado na Tabela S3. Por isso a atenção especial é necessário para interpretar quaisquer associações observadas com esses 336 DMCs.

Nós escolhemos limitar a análise à região promotora proximal porque esta região é bem caracterizada por seus efeitos de metilação do DNA no silenciamento de genes. Esta abordagem também nos permitiu avaliar associações com alterações de expressão de genes com base em um conjunto de dados CaP independente, com base no pressuposto de que correlação inversa entre a metilação do promotor e expressão do gene podem plausivelmente indicar um resultado funcional de genes diferencialmente metilados identificados no CaP. Esta abordagem identificou um total de 122 genes incluindo sete genes metilação do DNA conhecidos em CaP. Como confirmação positiva da nossa abordagem,

de GSTP1, que é o gene hipermetilado mais minuciosamente estudado em CaP foi encontrado para ser hipermetilado nesta análise (Tabela 2). Um total de 7 dos 15 locais de CpG na HM450 BeadChip foram identificados como hiper-DMCs (gama de diferença média metilação: 0,27 ~ 0,48) no

GSTP1

gene (Tabela S3). O RNA mensageiro da

gene GSTP1

foi previamente mostrado ser significativamente regulada em CaP primário e tumores metastáticos mostrar ainda mais para baixo-regulação [29].

O aldeído-oxidase 1 (

AOX1) gene está envolvido em várias vias metabólicas, incluindo o metabolismo de drogas e geração de espécies de oxigénio reactivas [34] – [36]. a expressão da proteína de AOX1 reduzida na pancreatite crónica e uma ausência de expressão de proteína de AOX1 no cancro pancreático foram relatados [34]. Além disso, a diminuição da expressão da proteína de AOX1 foi detectada no carcinoma hepatocelular e esta desregulação da expressão de AOX1 foi associada com a fase do tumor e estado metastático [37]. hipermetilação DNA aberrante da região do promotor de AOX1

foi relatado recentemente no câncer de cólon e PCA [16], [18], [20], [38], [39]. Dentro do contexto destes dados publicados anteriores, os nossos dados suportam ainda um papel para a metilação de ADN anormal na AOX1

promotor de tumores APC, ao mesmo tempo proporcionar a cobertura mais abrangente de DMC neste gene até à data.

as diferenças observadas de metilação do DNA na AOX1

promotor entre amostras APC e tecidos normais foram notáveis. Esta região promotora mostrou um padrão de metilação muito consistentes em 34 locais CpG abrangendo 400 pares de bases em cada um fenótipo. Esta localização genómica é passível de avaliação por meio de outros ensaios, tais como a metilação ou pirossequenciao-PCR específica

A maioria dos tumores PCA (92,6%; sensibilidade). Observou-se que têm a metilação de ADN positivo, com um corte significativo metilação -off de 0,3 e 94,3% de tecidos normais, mostrando a metilação do DNA negativo com o mesmo corte. Esta sensibilidade de

AOX1

metilação foi semelhante a outros genes metilados bem conhecidos, incluindo

GSTP1

e

RARB

que foram testados usando métodos pyrosequencing [40]. Esta elevada sensibilidade de

AOX1

metilação do promotor e enormes diferenças de metilação do DNA entre as amostras APC e tecidos normais sugerem a utilidade potencial deste gene como um biomarcador para diagnóstico CaP.