Abstract
A superexpressão de peroxiredoxin 1 (Prx1) tem sido observado em vários cancros, incluindo carcinoma de células escamosas oral (CCEO). O mecanismo molecular preciso de sobre-regulação de Prx1 na carcinogénese, no entanto, é ainda pouco compreendidos. O objetivo deste estudo é investigar a relação entre Prx1 e hipóxia e potencial mecanismo (s) de Prx1 em CCEO linha de células SCC15 e modelo de xenotransplante. Nós tratado de tipo selvagem e Prx1 knockdown SCC15 células com hipóxia transitória seguida de reoxigenação. Nós detectada a condição de hipóxia, a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), e a expressão e /ou actividade de Prx1, heme oxigenase 1 (HO-1) e o factor nuclear kappa B (NF-kB). Descobrimos que a hipóxia induz a acumulação de ROS, up-regula Prx1, aumenta a NF-kB translocação e actividade de ligação ao DNA, e para baixo-regula HO-1
in vitro
. Em células Prx1 knockdown, o nível de HO-1 expressão foi aumentado, enquanto NFkB translocação e actividade de ligação de ADN foram diminuiu após hipoxia ou tratamento de hipoxia /reoxigenação. Além disso, nós imitou o microambiente do tumor oxigenação dinâmica no modelo de xenoenxerto avaliado e os índices acima em tumores com o diâmetro máximo de 2 mm, 5 mm, 10 mm ou 15 mm, respectivamente. Nossos dados mostraram que o tumor condição hipóxica e expressão de Prx1 estão significativamente associados com o crescimento do tumor. A expressão de HO-1 e NF-kB, e a actividade de ligação de NF-kB de ADN foram significativamente elevados em tumores de 15 mm, e o nível de 8-hidroxideoxiguanosina foi aumentada em tumores de 10 mm e 15 mm, em comparação com aqueles de tamanho de dois milímetros. Os resultados deste estudo fornecem evidências experimentais de que a sobre-expressão de Prx1 está associada com a hipoxia, e Prx1 /NF-kB /HO-1 via de sinalização podem estar envolvidos na carcinogénese oral,
citação:. Zhang H, Hou M, Ge G, Miao C, Zhang J, X Jing, et al. (2014) Indução de Peroxirredoxina 1 por hipóxia Regula Heme oxigenase-1 via NF-kB no câncer oral. PLoS ONE 9 (8): e105994. doi: 10.1371 /journal.pone.0105994
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 20 de maio de 2014; Aceito: 25 de julho de 2014; Publicação: 27 de agosto de 2014
Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural (81070836), a Pequim Natural Science Foundation (7102065) e ZYLX201407, Pequim Administração Municipal de Hospital Key Projeto de Desenvolvimento Médico. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma de células escamosas oral (CCEO) é o câncer mais comum de cabeça e pescoço em todo o mundo. Apesar das vantagens da cirurgia, quimioterapia e radioterapia, a taxa de sobrevida em 5 anos de CCEO não melhorou significativamente nos últimos 30 anos [1] – [3]. Metástases e quimioterapia resistência /radioterapia ainda são as principais preocupações na terapia do câncer clínica. A hipoxia, uma característica comum de cancro, promove a invasão de células tumorais e metástases no microambiente tumoral que conduz à resistência de células de tumor à quimioterapia e à radioterapia [4], [5]. Tem sido relatado que as características patológicas incluindo a capacidade de invasão activa, metástase de nódulo linfático e proliferação vascular está associada a hipoxia do tecido tumoral em CEB [6], [7]. A exposição a hipoxia hipobárica leva a um aumento significativo da produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS) em animais. A acumulação de ROS induzidos por hipoxia pode resultar em estresse oxidativo e progressão tumoral [8]. A resposta mediada por ROS pode ser regulada por antioxidantes e sistemas de enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase, a catalase e a tioredoxina /peroxiredoxina [9].
Peroxirredoxinas (Prxs) são uma super família de peroxidases dependentes de tiorredoxina antioxidantes multifuncionais. Peroxirredoxina 1 (Prx1) é um membro da família importante na Prxs e actua como um antioxidante para eliminar ROS em uma ampla gama de organismos. Prx1 está envolvido em várias actividades biológicas condições /incluindo o stress oxidativo, a proliferação celular e a apoptose de células [9]. Prx1 é abundante em muitas doenças malignas incluindo esôfago, pulmão, mama e pâncreas. expressão Prx1 elevada está associada com a sobrevivência diminuída em geral e prognóstico clínico [10], [11]. A sobre-expressão de Prx1 também tem sido relatada em CEB, mas o mecanismo molecular preciso de Prx1 na carcinogénese oral, continua a ser obscura [12]. A expressão do factor nuclear kappa B (NF-kB) e heme oxygenease-1 (HO-1) são aumentados em CEB [13], [14]. Numerosos estudos mostraram que as respostas NF-kB à hipóxia-reoxigenação
in vitro
[15]. NF-kB pode ser regulada por Prx1, através da sua activação inicial no citoplasma [16] ou alterando a concentração do oxidante que conduz à inactivação oxidativa do NF-kB [17]. HO-1, uma proteína de choque térmico de 32 kDa, pode catalisar a degradação oxidativa do heme para a biliverdina, que é subsequentemente reduzida a bilirrubina. HO-1 pode ser induzida por hipoxia, e choque térmico oxidantes citotóxicos [18], [19]. HO-1 é um dos alvos de NF-kB sob condições estressantes [20] – [23]. Embora o mecanismo de Prx1 no stress oxidante não é claro, vários evidências sugerem que pode Prx1 resposta à hipoxia e regular NF-kB via cascata. Neste estudo, foi investigada a alteração de Prx1 em resposta à hipoxia e avaliou os possíveis correlações entre Prx1 e NF-kB /HO-1 utilizando sistema de célula de câncer bucal e modelo de xenotransplante.
Materiais e Métodos
cultura celular
células CEs humano, SCC15, (ATCC, Manassas, VA) foram mantidas em DMEM-F12 suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco, EUA) contendo 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. SCC15 células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2 e 95% de ar. Para derrubar Prx1, SCC15 células foram transfectadas com plasmídeo Prx1 shRNA (Santa Cruza Biotechnology) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo de controlo shRNA-A (Santa Cruza Biotechnology) foi transfectada como controlo. A eficiência de Prx1 shRNA knockdown foi determinada por qRT-PCR e análise de Western blot.
Pimonidazole coloração em células SCC15
As células foram cultivadas em lamelas durante 24 h antes do tratamento hipoxia. Durante o tratamento de hipoxia, as células foram colocadas numa incubadora de hipoxia com gás contendo 1% de O
2, 5% de CO
2 e 94% N
2 a 37 ° C durante diferentes períodos de tempo. 200 uM de pimonidazole foi adicionado ao meio e incubou-se durante 30 min. Depois de lavadas com PBS, as células foram fixadas com paraformaldeído (3%) à temperatura ambiente durante 10 min e subsequentemente lavou-se novamente com PBS. Depois bloqueou-se com BSA, lamelas foram incubadas com hypoxyprobe-1 de ratinho MAB1 anticorpo monoclonal (1:100) no kit Hypoxyprobe-1 mais (Chemicon Int., Temecula, CA) durante a noite. Utilizou-se um anticorpo secundário conjugado com FITC anti-ratinho. Lamelas foram montadas e células imunomarcadas foram examinadas em um microscópio Olympus IX71 (Tóquio, Japão).
Detecção de ROS
A produção de intracelular ROS nas células foi medida com 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCF-DA) usando análise FACS. As células SCC15 foram recolhidas e suspensas em 500 uL diluído DCF-DA. A mistura foi incubada a 37 ° C durante 20 min e, em seguida, lavada duas vezes com PBS. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo dentro de 1 h. Os dados foram normalizados para os valores de controlo. A intensidade de fluorescência média DCF foi medida com excitação a 488 nm e emissão a 525 nm. As experiências foram realizadas em triplicado.
Imunofluorescência
Células cultivadas em lamelas foram enxaguadas com PBS, fixadas e permeabilizadas em acetona a -20 ° C durante 10 min. Após incubação com PBS contendo BSA a 5% durante 1 h, anticorpos monoclonais anti-NF-kB anticorpo (Cell Signaling Technology, 1:100 em PBS-BSA) foram adicionados a 4 ° C e incubadas durante a noite. As lamelas foram lavadas com PBS, incubadas com Alexa Fluor 546 anti-coelho (Molecular Probes, 1:500) anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 h, e montado em Dako Cytomation fluorescente meio de montagem. imagens confocais foram coletados por meio de um microscópio de varredura a laser confocal Leica SP2 equipado com excitação UV, um laser de argônio, a 633 /1,32 objetivo OIL PH3 CS, e um conjunto pinhole confocal a 1 unidade de Airy. Todas as imagens confocais foram secções ópticas individuais.
Xenoenxerto modelo
Quarenta macho BALB /c ratos pelados (Pequim Vital River Laboratories, China) foram usados para produzir tumorigenicidade do SCC15 células
in vivo
. O protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de ética local para uso animal. As células SCC15 (6 × 10
6) foram suspensos em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato e foram transplantadas subcutaneamente nos flancos direito e esquerdo de ratinhos nus idade de 4 semanas. O crescimento tumoral foi monitorizado a cada 3 dias após o transplante. Os tumores foram colhidos quando o diâmetro máximo dos tumores atingiu 2 mm, 5 mm, 10 mm ou 15 mm, respectivamente. Para marcar células hipóxicas, os ratinhos nus foram injectados por via intraperitoneal com 0,1 ml de solução salina contendo cloridrato pimonidazole (1 – [(2-hidroxilo-3-piperidinil) propil) -2-nitroimidazole) a uma dosagem de 60 mg /kg de peso corporal 1 hora antes da retirada do tumor. Os ratinhos foram aplicadas a eutanásia e os espécimes de tumores foram removidos e imediatamente armazenados em azoto líquido para análise molecular /celular, ou em formalina para fazer blocos de tecido embebidos em parafina. Total de 80 tumores foram divididos em quatro grupos de acordo com o diâmetro do tumor (20 tumores /tamanho).
coloração Pimonidazole em tumores
Os blocos embebidos em parafina com amostras de tumor foram seccionados para a coloração pimonidazole. As secções foram incubadas com primário de coelho anti-anti-soro pimonidazole hypoxyprobe-1 MAB1 (diluição: 01:50; Chemicon, EUA) a 4 ° C durante a noite. Para avaliar a condição de hipóxia, cinco luz representante áreas microscópicas foram computadas em cada seção (ampliação × 200) e a densidade óptica média (MOD) foi calculado usando a imagem Pro Plus 7.0 analisador, MOD = IOD /área.
qRT-PCR
o ARN total foi extraído a partir de células cultivadas e tecidos tumorais, utilizando TRIzol (Invitrogen Life Technologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Sintetizou-se ADNc por transcrição inversa de ARN de 2 ug com o High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, EUA). alíquotas de um microlitro de ADNc foram utilizados como moldes. Os FAMTM corrente de corante /sondas MGB de Prx1, HO-1 e beta-actina foram sintetizados pela ABI (Ensaio ID: Prx1, HS0060202; HO-1, HS00015796; ACTB humano, 4352935E). Para análise dos dados, o método -ΔΔCT 2
foi usada com normalização dos dados de genes interessadas para gene housekeeping ß-actina. Os experimentos foram realizados em triplicado.
análise Western blot
Células e tecidos tumorais foram lisadas em tampão de ensaio de imunoprecipitação (50 mM de Tris-Cl [pH 7,4], 1% de NP40, NaCl 150 mM , 1 mM de EDTA, 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug cada uma de aprotinina e leupeptina, e Na3VO4 1 mM). Depois centrifugou-se a 12000 g durante 30 min, o sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi determinada usando o método de Lowry. Quantidades iguais de proteínas foram separadas em géis de 12% SDS-PAGE e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpo anti-Prx1 (1:5000, Upstate, EUA) e anti-HO-1 (1:2000, Abcam, EUA). Anticorpo de β-actina (Sigma, St. Louis, MO) foi utilizada como um controlo de carga. bandas imunorreactivas foram detectados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e quimioluminescência aumentada por reagentes (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As experiências foram realizadas em triplicado.
NF-kB de ADN actividade de ligação a detecção
A proteína nuclear foi extraído a partir de células e tecidos de tumor utilizando NE-PER citoplasmáticas de extracção Reagentes e Nucleares (Thermo, EUA) . Em resumo, as células e os tecidos foram suspensos em tampão hipotónico e incubadas em gelo durante 10 min, seguido por centrifugado a 12000 g e 4 ° C durante 10 min para precipitar núcleos. Depois lavou-se no tampão hipotónico, os núcleos foram lisadas num tampão de lise para obter os extractos núcleos. actividade de ligação a ADN de NF-kB foi detectado utilizando o NF-kB (p65) Factor de Transcrição Assay Kit (Cayman Chemical Company, EUA).
A imuno-histoquímica
Os blocos embebidos em parafina foram seccionados para imuno-histoquímica análise. Os cortes foram tratados com 20 mg /l de proteínase K (diluição: 1:1000; Sigma-Aldrich, EUA) a 37 ° C durante 30 min para a recuperação de antigénio. Depois de bloquear a actividade da peroxidase endógena com 0,3% de peroxidase de hidrogénio durante 15 min, as secções foram tratadas com 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG; 1:8000; Abcam, EUA) ou de NF-kB (Cell Signaling Technology, 1:100) primário anticorpo, a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram incubadas em anticorpos IgG secundários biotinilados a 37 ° C durante 30 min, e então visualizadas utilizando DAB para 2-5 min. hematoxilina de Mayer foi usada para contracoloração das secções, que foram então desidratadas e montadas. Para controlo negativo, PBS foi usado no lugar de anticorpos primários. As células com coloração positiva foi determinada por contagem da percentagem de células coradas usando a imagem Pro Plus 7.0 Analyzer. Um mínimo de 1.000 células foram contados para cada espécime de tumor.
A análise estatística
Os níveis de expressão de Prx1, HO-1, NF-kB e 8-OHdG, e os dados de produção de ROS, coloração pimonidazole, imunofluorescência e actividade de ligação de NF-kB DNA foram analisados e comparados por meio de análise de uma via de variância (ANOVA). Toda a análise estatística foi realizada usando SPSS software para Windows 17.0. foram consideradas estatisticamente significativas as diferenças
P Art 0,05. Todas
P valores
eram de dois lados.
Resultados
Prx1 knockdown aumenta hipóxia e ROS intracelular produção
Foi utilizado plasmídeo shRNA para derrubar Prx1 em células SCC15. Como mostrado na Figura 1A e 1B, os níveis de ARNm e a expressão da proteína Prx1 foram reduzida para 40-50% por shRNA transfecção em células SCC15. Após Prx1 knockdown, detectamos a condição hipóxica em ambas as células Prx1 knockdown e células de controle, que foram transfectadas com vector vazio. Os nossos dados mostraram que a condição hipóxica foi aumentada por hipoxia ou hipoxia /reoxigenação excepto de 12 h de tratamento de hipoxia em células de controlo (Figura 1C, painel superior). Em células Prx1 knockdown, a condição hipóxica aumentou mais significativamente em comparação com células de controlo (Figura 1C, inferior pannel). A maior hipoxia foi observada em células knockdown Prx1 após 24 h de hipoxia /2 h tratamento reoxigenação, e 2 h de tratamento reoxigenação não diminuir o nível de hipoxia elevado por tratamento de hipoxia. Nós também detectou a produção de ROS intracelular. Semelhante a condição de hipóxia, a produção de ROS intracelular foi aumentada por tratamento hipoxia hipoxia excepto 12 h e 12 h hipoxia /2 h reoxigenação tratamento (Figura 1D). A acumulação intracelular de ROS é mais elevada em células Prx1 knockdown em relação ao que em células de controlo.
, proteína Prx1 foi significativamente diminuído por shRNA transfecção. B, mRNA Prx1 foi significativamente reduzido pela shRNA transfecção. C, Pimonidazole coloração mostrou o aumento do estado de hipoxia em células após o tratamento hipoxia /reoxigenação. nível D, intercelular ROS identificados por citometria de fluxo em células após o tratamento hipóxia /reoxigenação. *
P Art 0,05 vs. células WT SCC15;
#
P
. 0,05 vs. controlo de hipoxia células WT SCC15
Prx1 regula negativamente a HO-1 sob condições de hipóxia
A fim de determinar se Prx1 foi relacionada com a HO-1 em células SCC15 em condições de hipóxia, que avaliou os níveis de Prx1 e HO-1 expressão após o tratamento hipóxico. Como mostrado na Figura 2A (a, b), a expressão da proteína de Prx1 foi aumentada por tratamento hipóxico. No entanto, a expressão da proteína de HO-1 foi diminuída em fases iniciais de hipoxia quando a expressão Prx1 foi aumentada, e, em seguida, aumentada enquanto que a expressão Prx1 diminuiu em 12 h hipoxia /2 h reoxigenação, 24 h hipoxia e 24 h hipoxia /2 h reoxigenação, como indicado na Figura 2A (c e d). Em /2 h 4 h reoxigenação grupo hipóxia, o nível de proteína Prx1 foi aumentada em 50%, enquanto que HO-1 de proteína foi regulada para baixo em 30% em comparação com células não tratadas (Figura 2A-B e D). No entanto, em células Prx1 knockdown, HO-1 foi significativamente regulada para cima após hipoxia ou hipoxia /tratamento reoxygenantin excepto para o grupo de 24 h. A expressão da proteína de HO-1 foi aumentada em 30% (Figura 2A-d), e o nível de ARNm foi aumentada de 1,4 vezes em células SCC15 knockdown Prx1 tratados com 4 h hipoxia /2 h reoxigenação em comparação com células não tratadas (Figura 2C) . A expressão de ARNm de Prx1 foi aumentada em 2,7 vezes, enquanto a expressão de ARNm de HO-1 foi regulada negativamente em 40% (Figura 2B e 2C).
A (a), a expressão da proteína de Prx-1 e HO-1 detectados por transferência de Western após tratamento hipoxia /reoxigenação; A (b e d), Prx1 e HO-1 de proteína para a quantificação relativa de p-actina; A (c), a correlação de Prx-1 e HO-1 após tratamento hipoxia /reoxigenação. B e C, a expressão de ARNm de Prx-1 e HO-1 detectados por qRT-PCR após o tratamento hipoxia /reoxigenação. *
P Art 0,05 vs. células WT SCC15;
#
P
. 0,05 vs. controlo de hipoxia células WT SCC15
Prx1 knockdown inibe a NF-kB translocação e actividade de ligação ao DNA
Detectamos a expressão de NF-kB endógena nas células após o tratamento hipoxia. Observou-se um aumento da expressão núcleo de NF-kB em células SCC15 após o tratamento, especialmente em 24 h grupo hipoxia (Figura 3A, painel superior). Além disso, em células Prx1 knockdown, translocação de NF-kB do citoplasma para núcleo foi diminuído em comparação com células de controlo (Figura 3A, painel inferior). Nós então detectada actividade de NF-kB em células após o tratamento hipóxia. Descobrimos que a capacidade de ligação do ADN de NF-kB p65 foi significativamente diminuída em células knockdown Prx1 após o tratamento hipoxia em comparação com células de controlo (Figura 3B).
A, expressão núcleos endógenos do NF-kB. B, actividade de ligação de NF-kB de ADN detectadas por ELISA. *
P Art 0,05 vs. células WT SCC15;
#
P Art 0,05 vs. controlo de hipoxia células WT SCC15
A hipoxia é associado com o crescimento do tumor no modelo de xenotransplante
Para avaliar a mudança. das condições hipóxicas durante o desenvolvimento do tumor, avaliou-hipoxia em tumores com o máximo diâmetro de 2 mm, 5 mm, 10 mm ou 15 mm. Como mostrado na Figura 4A, as células positivas dispersas pequenas e foram observadas em tumores de 2 mm. Em 5 mm, 10 mm e 15 mm tumores, as células hipóxicas foram localizados principalmente nos centros dos ninhos de cancro. A hipoxia em 5 mm, 10 mm e 15 mm tumores foi significativamente maior do que nos tumores de 2 mm (Figura 4B). Nós também detectado o nível de 8-OHdG para avaliar a lesão oxidativa do DNA em células tumorais. A expressão de 8-OHdG aumentou de 2 mm a 15 mm tumores (Figura 4C). Ele foi significativamente maior nos tumores de 10 mm e 15 mm, em comparação com tumores 2 mm (Figura 4D).
A, hipoxia foi detectado em 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) e 15 mm (P) tumores por coloração pimonidazole. B, hipoxia MOD aumenta significativamente em 5 mm, 10 mm e 15 mm, em comparação com tumores de tumores de 2 mm. C, 8-OHdG foi detectado por imuno-histoquímica em 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) e (d) mm tumores 15. D, O nível de 8-OHdG foi maior em 10 mm e 15 mm, em comparação com tumores de tumores de 2 mm. *
P Art 0,05; **
P
. 0,01
A superexpressão de Prx1 e HO-1 durante tumorigênese no modelo de xenotransplante
Conforme mostrado na Figura 5A, a expressão de mRNA de Prx1 aumentou significativamente em 5 mm, 10 mm e 15 mm tumores em comparação com tumores 2 mm. A expressão da proteína de Prx1 também foi elevado em 10 mm e 15 mm tumores (Figura 5B). A sobre-expressão de HO-1 foi observada em tumores de 15 mm, conforme indicado na Figura 5C e 5D.
A e C, a expressão de ARNm de Prx1 e HO-1 detectados por qRT-PCR. B e D, A expressão de proteínas de Prx1 e HO-1 detectados por Western blot. *
P Art 0,05; **
P Art 0,01
NF-kB translocação e actividade de ligação ao DNA são aumentados no modelo de xenotransplante
actividade
NF-kB translocação e DNA vinculativo ambos. estavam elevados quando do tumor desenvolvido. A análise imuno-histoquímica mostrou que a expressão de NF-kB foi significativamente aumentada nos tumores de 15 mm em comparação com tumores 2 mm (Figura 6A e 6B). Do mesmo modo, a actividade de ligação do ADN de NF-kB foi significativamente elevados em tumores 15 mm do que os tumores de 2 mm (Figura 6c).
A, a expressão de NF-kB foi detectado por imuno-histoquímica em 2 mm (a), 5 mm ( b), 10 mm (C) e 15 mm (P) tumores. B, a percentagem de células positivas de NF-kB nucleares é aumentado significativamente em 15 mm em comparação com tumores em tumores que 2 mm. C, actividade de ligação a ADN de NF-kB foi significativamente maior nos tumores de 15 mm em comparação com tumores 2 mm. *
P Art 0,05; **
P
. 0,01
Discussão
O objetivo geral deste estudo é explorar o papel de Prx1 em hipóxia na CEB. Primeiro, usamos shRNA para derrubar Prx1 em SCC15 células e, em seguida detectado Prx1, NF-kB e HO-1 em hipóxia. Também foi investigada a Prx1 com hipóxia durante o desenvolvimento do tumor no modelo de xenotransplante. Nossos dados mostraram que após a exposição à hipóxia ou hipoxia /reoxigenação, hipóxia intracelular e os níveis de ROS foram agravadas. Nós também descobrimos que HO-1 expressão foi regulada em células Prx1 knockdown, enquanto NF-kB translocação e actividade de ligação ao DNA foram diminuídos. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a acumulação elevada de ROS induzidos por hipoxia pode sobre-regular Prx1, que pode activa NF-kB regula negativamente e HO-1 em células cancerosas orais induzida por hipoxia. Nosso
in vivo
dados mostraram que a superexpressão de Prx1 está associada com hipóxia e crescimento do tumor. Estes resultados sugerem que Prx1 /NF-kB /HO-1 via de sinalização pode desempenhar um papel-chave na carcinogénese do cancro oral, induzida por hipoxia.
Uma das principais funções da Prx1 é a actividade da peroxidase dependente de tioredoxina depender exclusivamente na cisteína na região N-terminal de [24]. Limpa de ROS extras como um antioxidante. Hipóxia aumenta os níveis de ROS intercelulares através da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. A hipoxia é um dos principais factores que influenciam a iniciação e progressão tumoral através de dano oxidativo ao DNA aumentar [25]. Nos últimos anos, a sobre-expressão de Prx1 foi reportada desempenhar um papel importante em muitas malignidades devido ao seu papel crítico na patogénese de hipóxia. Em células de cancro do pulmão, hipoxia /reoxigenação pode aumentar a expressão do factor de activação por Prx1 eritróide nuclear 2 relacionado com o factor 2 (Nrf2), um importante factor de transcrição envolvidos no stress oxidante [26]. A perda de expressão Prx1 pode aumentar a sensibilidade aos oxidantes e, por conseguinte, aumentar a produção de ROS danos no ADN e oxidativo [27]. No presente estudo, a expressão de ARNm e proteína de Prx1 foi regulada em células SCC15 por qualquer hipoxia (4 H, 12 H), isoladamente ou seguido de reoxigenação (2 h). Em outro estudo relatado por Kim
et ai.,
Prx1 só foi regulada para cima pela hipóxia /reoxigenação, mas não somente pela hipoxia [27]. Descobrimos que as células estão ainda SCC15 hipóxico depois de 2 horas de tratamento reoxigenação, o que indica que Prx1 ainda podia ser induzida por hipoxia, mesmo depois de 2 h de tratamento reoxigenação. O nosso resultado sugere que a hipoxia está intimamente relacionada com a sobre-expressão de Prx1 em CEB. A sobre-regulação de Prx1 aumenta a capacidade das células para remover ROS extra e proteger as células tumorais, que podem aumentar a progressão do tumor e reduzir as eficácias de quimio e radioterapias.
Um estudo recente mostrou que em células HeLa , citoplasmática Prx1 alterada citoplasmática translocação de NF-kB para o núcleo. Prx1 Nuclear regulamenta NF-kB /ligação através da eliminação de H DNA
2O
2 [23]. Wang
et ai. Relatou que
Prx1 interage com NF-kB ao nível do ADN e, presumivelmente, modula a sua actividade de transcrição em células de cancro da mama [10]. Como um antioxidante potente, HO-1 facilita a progressão do tumor de um modo específico do tecido. Estudos têm indicado que o NF-kB induz a expressão de HO-1 em tecidos tumorais [28] – [31]. Além disso, numerosos estudos sugerem uma relação directa entre o NF-kB e HO-1, mas a função de NF-kB na regulação da expressão de HO-1 em células humanas é controverso [32] – [35]. Neste estudo, os nossos dados mostram que a hipoxia induz Prx1 e NF-kB, e regula Prx1 HO-1 por meio de activar o NF-kB.
Prx1 foi recentemente identificado como um ligando endógeno para o receptor de tipo Toll (TLR ) ligandos [36]. Em condições de normóxia, Prx1 pode aumentar a expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) através da indução da actividade do factor promotor de alfa-1 induzível por hipóxia através Prx1: interacção TLR4. Este processo é mediado por NF-kB. NF-kB interage com o promotor de VEGF, no entanto, não é necessário para Prx1, o que sugere que o NF-kB pode regular o VEGF sem indução Prx1 [37]. Prx1 e HO-1 são ambos caracterizados como o stress oxidativo induzível e proteínas relacionadas com a heme. Prx1 tem actividade de ligação a heme. A actividade antioxidante específico do tiol de Prx1 pode ser inibida pela heme. A co-expressão ou co-indução de Prx1 e HO-1 foi observada em alguns tecidos ou células, indicando que as proteínas Prx1 e HO-1 pode co-localizar e interagem para exibir actividades antioxidantes [15]. Estudos têm demonstrado que a expressão de HO-1 é principalmente regulada para cima por Nrf2. Nrf2 é também um dos principais factores de transcrição para a expressão de genes em células de cancro Prx1 hipóxicas. Pela primeira vez, que relatam que Prx1 e HO-1 pode ter uma relação de regulação negativa de uma maneira indirecta. Os mecanismos moleculares precisos, no entanto, deve ser confirmado e investigados no estudo futuro.
No modelo de xenotransplante CCEO, encontramos resultados semelhantes que a elevação significativa da HO-1 fica atrás da de Prx1. Sob condição de danos no ADN e oxidativa hipóxico, Prx1 e HO-1 está regulado positivamente e actividade de ligação a ADN de NF-kB é reforçada. Os nossos dados sugerem que Prx1 desempenha um papel antioxidante por activar o NF-kB e de regulação de HO-1 em progressão CEB relacionados com hipóxia. Em conclusão, observou-se que a hipoxia desempenha um papel importante na regulação através CEB Prx1 /NF-kB /HO-1 via de sinalização. Nosso estudo fornece uma análise sistémica de Prx1 em sistemas de células e modelos de xenotransplante de CCEO, cada um com vantagens específicas para a investigação biomarcador. Outros estudos sobre o papel funcional da Prx1 na carcinogênese oral são garantidos. As informações sobre este estudo pode ser útil no desenvolvimento de quimiopreventivos /agentes terapêuticos alvo Prx1.