Abstract

O gene p53 é mutado em mais de 50% dos tumores humanos. p53 mutante exerce uma função oncogénica e muitas vezes é altamente expressa em células cancerosas devido à evasão de degradação dependente de proteassoma. Assim, reativando degradação dependente de proteassoma da proteína p53 mutante é uma estratégia atraente para o gerenciamento de câncer. Anteriormente, verificou-se que o trióxido de arsénio (ATO), uma droga para a leucemia promielocítica aguda, degrada a proteína p53 mutante através de uma via de proteassoma. No entanto, ainda não está claro qual é a ligase E3 que tem como alvo p53 mutante para a degradação. No presente estudo, buscou-se identificar uma ligase E3 necessário para a degradação ATO mediada por p53 mutante. Descobrimos que ATO induz a expressão de E3 Pirh2 ligase ao nível da transcrição. Nós também descobrimos que knockdown de inibe Pirh2, enquanto que a expressão ectópica de Pirh2 aumenta, a degradação da proteína p53 mutante ATO-induzido. Além disso, descobrimos que Pirh2 E3 ligase interage fisicamente com e tem como alvo p53 mutante para polyubiquitination e degradação posteriormente proteossómica. Curiosamente, verificou-se que ATO coopera com a Hsp90 ou inibidor de HDAC para p53 mutante promover a degradação e a supressão do crescimento em células tumorais. Juntos, estes dados sugerem que ATO promove a degradação da p53 mutante, em parte, através da indução da via proteosoma Pirh2 dependente

Citation:. Yan W, Jung YS, Zhang Y, Chen X (2014) de trióxido de arsénico Reativa Proteasome- Degradação dependentes da proteína p53 mutante em células cancerosas na parte via expressão aumentada de Pirh2 E3 ligase. PLoS ONE 9 (8): e103497. doi: 10.1371 /journal.pone.0103497

editor: Yi Li, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de abril, 2014; Aceito: 03 de julho de 2014; Publicação: 12 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health Grant CA 121137 e CA 076069. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mutações missense da p53 do gene, principalmente agrupado dentro do domínio de ligação ao ADN do núcleo, ocorrer em uma grande fracção de tumores humanos [1]. Estas mutações p53 produzir proteínas com uma actividade de ligação a ADN específica da sequência alterada, o que não pode induzir uma variedade de genes alvo de p53 de tipo selvagem para a supressão do tumor [2]. Além disso, as proteínas p53 mutantes são encontrados para ter atividades oncogênicos, definido como ganho de função (GOF) [3], [4].

Os efeitos do p53 mutante no desenvolvimento e progressão tumoral são de longo alcance. Em comparação com os ratos sem p53, p53 mutante ratinhos knock-in espectros tumor exibem significativamente diferente e alta incidência de metástases de tumores [5] – [7]. Mais importante ainda, os estudos clínicos mostraram que um nível elevado de p53 mutante está correlacionada com tumores mais agressivos e piores resultados [8] – [10]. Além disso, a p53 mutante é clinicamente significativo, porque a sua expressão torna as células resistentes a fármacos quimioterapêuticos [11], [12]. Aparentemente, o ganho de função de p53 mutante é, em parte, dependente da sua actividade de transcrição [5], [13] – [18], e a sua actividade dominante negativa em relação à família p53 [19] – [23].

ao contrário de p53 de tipo selvagem, a proteína p53 mutante é encontrado para evadir dependente de proteassoma degradação [24] – [28], que conduz à sua hyperstabilization em tumores [29]. Vários mecanismos podem causar proteína p53 mutante para evadir degradação dependente de proteassoma. Uma possibilidade é que o stress associado a tumores pode provocar a interacção da p53 mutante com proteínas chaperone, tal como HSP70 e HSP90, que inactiva ligases E3 MDM2 e chip e, consequentemente, estabiliza o mutante p53 [24] – [27]. De facto, a inibição da expressão ou actividade de HSP90 liberta MDM2 e chip para degradar mutante p53 [26], [30]. Outra possibilidade é que a p53 mutante é capaz de formar agregados amilóides em tumores, que são resistentes à degradação proteossómica [27], [31]. A capacidade de estabilização de p53 mutante apresenta um dilema fundamental na intervenção terapêutica para pacientes com câncer com um p53 mutante. Assim, a reactivação eficaz da degradação dependente de proteassoma de p53 mutante, em células cancerosas tem um significado terapêutico.

Recentemente, descobriu-se que os objectivos de arsénio p53 mutante para a degradação, levando a supressão do crescimento em células de tumor sólido [32] . O arsênico é um metalóide com uma eficácia substancial e efeitos moderadamente adversos em pacientes com leucemia aguda promielocítica, mieloma e síndromes mielodisplásicas [33]. Curiosamente, verificou-se que o arsénio induz a expressão da p53 de tipo selvagem, TAp73, e TAp63 em células tumorais, [34] [32]. Estas actividades de arsénio fornecer uma estratégia para diminuir p53 mutante função dominante negativo e outras atividades GOF. Embora arsénio diminui a estabilidade da proteína p53 mutante através de uma via de proteassoma [32], o que tem como alvo a ligase E3 p53 mutante para a degradação continua a ser desconhecido. Neste estudo, vamos abordar esta questão para facilitar o desenvolvimento de trióxido de arsénico (ATO) como uma potencial droga anticâncer para controlar tumores com p53 mutante.

Materiais e Métodos

Cultura Celular

a linha de células de cancro pancreático humano MIA PaCa-2 (mutante contendo R248W) e a linha celular de queratinócitos HaCaT humanos (contendo mutante H179Y /R282W) foram cultivadas como anteriormente descrito [35].

plasmídeos e siRNA

Humano full-length Pirh2, Pirh2-DN (um E3 ligase mutante defeituoso), e Pirh2-ΔRING (dedo anular eliminação de domínio mutantes) foram usados ​​como descrito anteriormente [36]. Todas as proteínas Pirh2 foram FLAG-marcado no terminal N. vector de expressão de ubiquitina marcado com FLAG em pcDNA3 foi utilizado como previamente descrito [36].

Dois pequenos ARN interferentes (siRNAs) contra Pirh2, 5′-CAU CCG CAA CAG ACU UGU dTdT G-3 ‘e 5’ -GGA AGU GCA GUG CAU AAA C dTdT-3 ‘, e dois mexidos siRNAs, 5′-GCA GUG UCU CCA CGU ACU A dTdT-3′ e 5’-GGC CGA UUG UCA AAU AAU U dTdT-3 ‘, foram adquiridos ARNi de Dharmacon Technologies. Os ARNsi foram transfectados para células utilizando SilentFect (Bio-Rad) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas nos tempos indicados após a transfecção para outras experiências.

Anticorpos

de coelho anti-p53 (FL-393) foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology Inc., policlonal de coelho anti-Pirh2 foi comprado de Bethyl Laboratories Inc. monoclonal de ratinho anti-FLAG M2 e de coelho anti-actina foram adquiridos da Sigma.

A transcrição reversa PCR ensaio

O ARN total foi isolado a partir de células utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). O ADNc foi sintetizado utilizando um kit de síntese de ADNc Iscript ™ (Bio-Rad). Para medir ARNm Pirh2, RT-PCR foi realizada com o iniciador directo 5′-CTGCGAGCACTATGACAGAG-3’and iniciador inverso 5′-TTCATAGCTAGGCATAAGTTAC-3 ‘. Actina foi amplificada com o iniciador de sentido directo 5’-TCCATCATGAAGTGTGACGT-3 ‘e o iniciador inverso 5′-TGATCCACATCTGCTGGAAG-3’.

inibição proteossoma ensaio

As células foram semeadas durante 24 horas, não tratadas ou pré-tratadas com inibidor de proteassoma MG132 (4 ^ M) durante 2 h, e depois tratou-se com ATO durante 6 h.

A imunoprecipitação e análise Western blot

O experimento imunoprecipitação foi realizada como previamente descrito [37]. Resumidamente, células HaCaT e MIA PaCa-2 foram tratadas com ATO 5 ou 7,5 uM durante 6 h. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, lisadas em tampão de lise (50 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Nonidet P-40, e PMSF 0,4 mM), sonicado, e clarificada por centrifugação . Os lisados ​​celulares (500 ug de proteína total) foram incubadas durante 4 h a 4 ° C com os anticorpos indicados acoplados às esferas de Proteína A-agarose (Sigma) e depois lavou-se com tampão de lise. complexos de proteínas imunoprecipitadas e os lisados ​​de células inteiras foram sujeitos a SDS-PAGE. Para cada conjunto, 5% de lisado de células inteiras foi utilizado como um controle de entrada. anticorpo IgG foi usada como um controlo negativo. Imunotransfer�cias foram visualizados por reagentes de detecção SuperSignal Oeste Femto quimioluminescência (Pierce).

preparação de proteína de fusão GST

A glutationa S-transferase (GST) tagged Pirh2, Pirh2-ΔRING ou Pirh2-DN foi expressa por pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech). As proteínas marcadas com GST recombinantes foram purificadas tal como descrito anteriormente [37]. Resumidamente, as fusões GST de Pirh2, Pirh2-ΔRING, e Pirh2-DN foram expressos em E. coli BL21 (DE3) (Novagene) após indução com IPTG 0,5 mM durante 4 h a 37 ° C. As células bacterianas foram recolhidas e, em seguida, ressuspensas em tampão de lise de GST (200 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 0,5 M, EDTA 100 mM, 0,1% de Triton X-100, e PMSF 0,4 mM). Subsequentemente, os lisados ​​celulares foram sonicados e clarificados por centrifugação. proteínas de fusão GST foram purificadas usando esferas de glutationa-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com o protocolo do fabricante.

ensaio

p53 ubiquitinação

35S-marcados p53 de tipo selvagem ou mutante p53 ( proteínas R175H e R273H) foram sintetizados por transcrição e tradução in vitro utilizando o sistema de lisado de reticulócitos acoplado a TNT T7 (Promega). 5 ul (~ 2 x 10

4 cpm) de p53 traduzida in vitro foram adicionados a GST-Pirh2 (2 ug) e mistura-se em gelo durante 1 h para formar complexos de GST-Pirh2-p53. Os complexos foram adicionados ao tampão de ubiquitinação (Tris-HCl a 50, pH 7,4, ATP 2 mM, MgCl 5 mM de

2, 2 mM de DTT, e 1 de solução de regeneração × energia (ERS)), contendo E1 (100 ng) , E2 (200 ng), e ubiquitina (2 ug), e incubou-se a 30 ° C durante 2 h. Finalmente, as misturas reaccionais foram separadas em SDS-PAGE e analisadas por autorradiograf ia. E1, E2, ERS e ubiquitina foram adquiridos de Boston Biochem.

Estatísticas

comparações dois grupos foram analisados ​​por

t

teste de Student dos dois lados.

p valores

foram calculados, e

p

. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

O trióxido de arsénio degrada a proteína p53 mutante via-proteassoma dependente via

é bem conhecido que, em células tumorais, hyperstabilization de proteína p53 mutante é atribuída à evasão da degradação dependente de proteassoma [24] – [27], [31], [38]. Assim, a reactivação da degradação dependente de proteassoma de p53 mutante, em células de tumor tem um significado terapêutico. Anteriormente, verificou-se que ATO diminui a estabilidade da proteína p53 mutante através de uma via de proteassoma [32]. Mais importante ainda, que mostrou que knockdown de p53 mutante endógeno sensibiliza, enquanto que a expressão ectópica de p53 mutante dessensibiliza, células tumorais para o tratamento de arsénio [32]. Consistentemente, um outro estudo mostraram que a degradação induzida por arsénio da p53 mutante inibe a proliferação de células que expressam p53R273H de uma forma dependente da dose [39]. No entanto, ainda não está claro qual ligase E3 é responsável pela degradação da p53 mutante induzido por arsênico. Para testar isso, confirmou-se que a degradação induzida por arsénico da p53 mutante é através da via dependente de proteassoma. Para este fim, as células HaCaT foram não tratadas ou tratadas com 4 uM MG132, um inibidor de proteassoma 26S, na ausência ou na presença de ATO. Descobrimos que a degradação do mutante p53 induzida por arsênio foi completamente abolida pela MG132 (Fig. 1A). Do mesmo modo, verificou-se que a degradação induzida por arsénio da proteína p53 mutante foi inibida por MG132 em células MIA PaCa2 (Fig. 1B). Além disso, verificou-se que, ao contrário do efeito da via de proteassoma na proteína p53 de tipo selvagem [40], a inibição da via do proteassoma sozinha era incapaz de aumentar o nível de proteína p53 mutante (Fig. 1A-B), consistente com um relatório anterior [41]. Tomados em conjunto, estes resultados confirmam que o arsénio reactiva degradação dependente de proteassoma de p53 mutante, em células tumorais.

Western blots foram preparadas com extractos de HaCaT (A) e células MIA PaCa-2 (B), que não foram tratados ou pré-tratados com 4 mm de MG132 durante 2 h, e depois não tratada ou tratada com ATO durante 6 horas.

O trióxido de arsénio degrada a proteína p53 mutante através da indução de Pirh2 E3 ligase

Anteriormente, verificou-se que o arsénio induz a expressão de E3 Pirh2 ligase para degradar a proteína oncogénica ΔNp63, um membro da família p53 [34]. Pirh2 é conhecido por ser uma ligase E3 direccionamento da proteína p53 de tipo selvagem para a degradação de [42], [43]. Assim, exploramos se ATO induz a expressão de Pirh2 em células tumorais portadores de uma p53 mutante. Descobrimos que, após tratamento com ATO, o nível de transcritos Pirh2 foi significativamente aumentada em MIA PaCa-2 e células HaCaT (Fig. 2A), concomitantemente com o aumento de proteína Pirh2 (Fig. 2B). Estes dados sugerem que o ATO pode transcricionalmente induzir a expressão do Pirh2 para degradar p53 mutante nas células tumorais.

(A) O nível de Pirh2 transcrição é aumentada pela ATO. análise de RT-PCR foi realizada com ARN total isolado a partir de MIA PACA-2 e HaCaT células não tratadas ou tratadas com 7,5 uM para ATO 2-6 h. ARNm de actina foi amplificada como um controlo de carga. (B) Western blots foram preparadas com extractos de MIA PACA-2 e HaCaT células não tratadas ou tratadas como em (A), e, em seguida sondadas com anticorpos contra Pirh2 e actina, respectivamente.

Em seguida, nós examinou se a expressão ectópica de Pirh2 aumenta a degradação induzida por arsénico da proteína p53 mutante. Descobrimos que a expressão ectópica de Pirh2 ou ATO tratamento sozinha diminuiu significativamente o nível de p53 mutante em células HaCaT e PaCa-2 MIA (Fig. 3A-B). Mais importante, verificou-se que uma combinação de expressão ectópica de Pirh2 e ATO tratamento diminuiu ainda mais o nível de p53 mutante (Fig. 3A-B). Estes dados sugerem que a p53 mutante pode ser degradado por Pirh2 ligase E3, e a actividade de Pirh2 pode ser melhorada por tratamento ATO através de mecanismos desconhecidos.

(A-B) Western blots foram preparadas com extractos de HaCaT (A ) e MIA PaCa-2 (B), as células que foram transfectadas com pcDNA3 ou pcDNA3-FLAG-Pirh2 durante 24 h, e, em seguida, tratados com 5 ou 7,5 uM ATO durante 6 h. As membranas foram então sondadas com anticorpos contra o marcador FLAG, p53, e a actina, respectivamente. (C) Representação esquemática da proteína Pirh2 juntamente com localizações dos domínios do dedo e anel de Zn, duas mutações de substituição C145S e C148S no domínio ANEL (Pirh2-DN), e exclusão do domínio RING em Pirh2 (Pirh2-ΔRING). (D-E) A expressão ectópica de Pirh2-DN ou Pirh2-ΔRING tem pouco ou nenhum efeito sobre o nível de p53 mutante. Western blot foram preparadas com extratos de HaCaT (D) e as células MIA PaCa-2 (E), que foram transfectadas com pcDNA3, pcDNA3-FLAG-Pirh2-DN, pcDNA3-FLAG-Pirh2-ΔRING ou pcDNA3-FLAG-Pirh2 para 24 h. As membranas foram então sondadas com anticorpos contra o FLAG tag Pirh2, p53, e a actina, respectivamente.

Sabe-se que Pirh2 requer seu domínio RING para ubiquitinar p53 de tipo selvagem para a degradação proteossómica [44]. Para determinar se é necessária a atividade ligase E3 de Pirh2 para regular a expressão da p53 mutante, dois mutantes Pirh2 marcada com Flag, Pirh2-ΔRING (falta ANEL domínio de dedo) e Pirh2-DN (contendo duas mutações C145S substituição e C148S no domínio ANEL), foram usados ​​(Fig. 3C). Mostrámos que, em contraste com o tipo selvagem Pirh2, a expressão ectópica de Pirh2-ΔRING ou Pirh2-DN era incapaz de reduzir o nível de proteína p53 mutante em células HaCaT e MIA PaCa-2 (Fig. 3D-E).

Para examinar melhor se Pirh2 endógena medeia a degradação induzida por arsénico da proteína p53 mutante, as células HaCaT e Mia PaCa-2 foram transfectadas transitoriamente com um mexidos siRNA (SCR-1 e -2) ou um siRNA contra Pirh2 (siPirh2-1 e -2) durante 3 d, e, em seguida, falsamente tratados ou tratados com ATO. Mostrámos que o nível de Pirh2 foi significativamente diminuído por Pirh2, mas não mexidos, ARNsi (Fig. 4A-B). Importante, descobrimos que Pirh2 knockdown foi capaz de salvar a degradação induzida por arsénico da p53 mutante (Fig. 4A-B). Observamos, também, que o tratamento aumentou a expressão arsénio Pirh2, concomitantemente com uma diminuição da expressão da p53 mutante (Fig. 4A-B).

Western blots foram preparadas com extractos de HaCaT (A) e MIA PaCa-2 (B células), que foram transfectadas com ARNsi mexidos # 1 (SCR-1) (pistas 1-2), a SCR-2 (pistas 5-6), ARNsi contra Pirh2-1 (siPirh2-1) (pistas 3-4), ou siPirh2-2 (pistas 7-8), e depois tratou-se com ATO durante 6 h. As manchas foram então sondadas com anticorpos contra Pirh2, p53, e actina, respectivamente.

Pirh2 interage fisicamente com a proteína p53 mutante para polyubiquitination

Como E3 ligase frequentemente interage fisicamente com seus substratos , examinamos se Pirh2 associa fisicamente com p53 mutante. Para testar isto, células HaCaT e MIA PaCa-2 foram tratadas com ATO durante 6 h, e, em seguida, o p53 mutante endógeno e Pirh2 em células foram imunoprecipitados com anticorpos contra p53 e Pirh2, respectivamente. Mostrámos que Pirh2 endógena foi detectada em imunocomplexos da p53 mutante (Fig. 5a). Além disso, o mutante p53 foi detectada em Pirh2 imunocomplexos (Fig. 5B). IgG foi usada como um controlo negativo, durante a imunoprecipitação e incapazes de imunoprecipitar p53 mutante ou Pirh2 (Fig. 5A-B).

(A) células HaCaT e MIA PaCa-2 foram tratadas com 5 ou 7,5 uM para ATO 6 h. extratos de células de HaCaT (esquerda) e MIA PaCa-2 (direita), as células foram imunoprecipitados com anti-p53 ou controlar IgG. Os imunocomplexos foram então usados ​​para detectar a p53 mutante e Pirh2 juntamente com lisados ​​de células completas como o controlo de entrada. (B) A experiência foi realizada como descrito em (a), excepto que o anticorpo anti-Pirh2 foi utilizado em imunoprecipitação. (C-E) in vitro sintetizado

35S-marcados p53 de tipo selvagem (C), R175H (D), e R273H (E) foram misturados com GST, Pirh2, Pirh2-DN, ou marcada com GST Pirh2-ΔRING . Os complexos foram então misturadas com um tampão contendo E1, E2 (UbcH5b), e Ub e em seguida incubadas a 30 ° C durante 2 h. p53 ubiquitinadas foi analisada por SDS-PAGE e detectadas por autorradiografia. (F) Um modelo de degradação Pirh2 mediada por p53 mutante induzido pelo ATO.

Em seguida, investigamos se Pirh2 serve como uma ligase E3 de ubiquitinação de p53 mutante. Para testar isso, no ensaio de ubiquitinação in vitro foi realizada com p53R175H mutante

35S-rotulados ou p53R273H juntamente com recombinante GST-Pirh2, GST-Pirh2-DN, ou Pirh2-ΔRING. Mostrámos que p53 mutantes foram polyubiquitinated por Pirh2 mas não por Pirh2-DN e Pirh2-ΔRING (Fig. 5D-E, comparar pista 3, com as pistas 4 e 5). Uma vez que o tipo selvagem p53 é um alvo conhecido de Pirh2, p53 de tipo selvagem foi utilizada como um controlo positivo. Do mesmo modo, mostrámos que p53 de tipo selvagem foi polyubiquitinated por Pirh2 mas não por Pirh2-DN e Pirh2-ΔRING (Fig. 5C, comparar pista 3, com as pistas 4 e 5). Em conjunto, estes dados demonstram que é capaz de Pirh2 polyubiquitinating p53 mutante.

O trióxido de arsénio coopera com a Hsp90 ou inibidor de HDAC para p53 mutante promover a degradação e a supressão do crescimento em células tumorais

Estudos anteriores mostraram que em células de tumor, a proteína de chaperona HSP90 interage com p53 mutante para formar MDM2-p53-HSP90 complexo e, consequentemente, estabiliza o mutante p53 [24], [26], [45]. Por conseguinte, os inibidores de HSP90 geldanamicina e 17AAG perturbar MDM2-p53-HSP90 complexo para degradar mutante p53 [26], [30], [45]. Além disso, SAHA, um inibidor de HDAC, foi encontrada para reduzir a expressão de p53 mutante através da inibição da transcrição mediada por p53 mutante-HDAC8 [46] e a estabilidade da proteína p53 mutante mediada por HDAC6 [30]. Para explorar a possibilidade de os inibidores de HSP90 e as HDACs são capazes de induzir a expressão Pirh2 para degradar mutante p53, HaCaT e células MIA PaCa-2 foram tratadas com 17AAG ou SAHA. Nós mostramos que o tratamento ou 17AAG SAHA teve pouco ou nenhum efeito na expressão da proteína Pirh2 em HaCaT (Fig. 6A) e células MIA PaCa-2 (Fig. 6B). O resultado sugere que a ATO e inibidores de HSP90 e HDAC pode degradar a proteína p53 mutante através de vias diferentes. Assim, temos a hipótese de que a ATO pode cooperar com a Hsp90 ou inibidor de HDAC para p53 mutante promover a degradação e a supressão do crescimento em células tumorais. Para testar isto, células HaCaT e MIA PaCa-2 foram tratadas com ATO, 17AAG, ou SAHA, sozinho ou em combinação. Verificou-se que a proteína p53 mutante foi marcadamente diminuída pela ATO, 17AAG, ou SAHA, e ainda mais reduzida, por combinação de ATO com 17AAG ou SAHA (Fig. 6C-D). Consistentemente, verificou-se que a proliferação de HaCaT (Fig. 6E) e MIA PaCa-2 células (Fig. 6F), foi significativamente inibida pela ATO, 17AAG, ou SAHA, e ainda mais inibido pela combinação da ATO com 17AAG ou SAHA. Estes dados sugerem que a combinação de ATO com outros agentes anti-cancro, tais como inibidores de HSP90 e HDAC, pode alcançar sinérgicos terapias para tumores que albergam um mutante p53.

(A-B) Western blots foram preparadas com extractos de HaCaT (a) e células MIA PaCa-2 (B), que não foram tratados ou tratados com 17AAG 1 pM ou 2 pM SAHA durante 12 h. As membranas foram então sondadas com anticorpos contra Pirh2 e actina, respectivamente. (C-D) transferências de Western foram preparadas com extractos de HaCaT (C) e células MIA PaCa-2 (D), que foram não tratadas ou tratadas com 7,5 uM ATO, 1 uM 17AAG ou 2 uM SAHA, isoladamente ou em combinação para 12 h. As membranas foram então sondadas com anticorpos contra p53 e actina, respectivamente. células (E-F) HaCaT (E) e MIA PaCa-2 (F) foram tratados como em (C-D) durante 24 h. Células sobreviventes a partir de ambos os grupos tratados e de controlo foram contados e apresentados como média ± DP de três experiências separadas. *,

p

. 0,05

Discussão

Em condições normais, o tipo selvagem p53 é expresso em níveis baixos devido à degradação mediada por múltiplos ligases E3 , incluindo MDM2, Pirh2, COP1, ARF-BP1 e WWP1 [43]. Em contraste, o mutante p53 frequentemente se acumula a níveis elevados em células tumorais, embora a sua expressão nos tecidos normais também é mantido em níveis baixos através da acção de MDM2 [28]. O hyperstabilization específico de tumores da p53 mutante é um determinante crítico do seu GOF. Com efeito, o silenciamento de mutante p53 por ARNsi inibe a proliferação de células de tumor humano [16], [47]. Assim, tendo como alvo para a degradação de p53 mutante proporciona uma base racional para estratégias anti-cancro atraentes para atenuar a proliferação de células cancerosas. Recentemente, foi sugerido que as células tumorais em nonproliferating, suprimindo macroautofagia promove a rotatividade da proteína p53 mutante através autofagia mediada por acompanhante de uma forma dependente com lisossoma [29]. Infelizmente, a necessidade de proliferação de células tumorais condicional limita o potencial de autofagia mediada por chaperona para aplicação clínica. Além disso, actualmente disponíveis quimioterapias são incapazes de esgotar a p53 mutante. Por exemplo, muitos agentes anti-cancro de primeira linha aumentar tanto a p53 de fenótipo natural e da p53 mutante e pode promover a formação e progressão do tumor em tumores com p53 mutante [28], [48]. Assim, a estabilização de p53 mutante por agentes quimioterapêuticos paradoxalmente limita a eficácia desses tratamentos.

Anteriormente, verificou-se que ATO, um fármaco clinicamente preferida para a leucemia promielocítica aguda, diminui a estabilidade da proteína p53 mutante através de uma via de proteassoma e bloqueio do proteassoma pode aliviar a degradação mutante p53 induzida por arsênio [32], [49]. Neste estudo, descobrimos que ATO induz a expressão de Pirh2 E3 ligase. Além disso, descobrimos que knockdown de inibe Pirh2, enquanto que a expressão ectópica de Pirh2 aumenta, a degradação induzida por arsénico da proteína p53 mutante. Nossa descoberta sugere que a expressão induzida por arsénico da Pirh2 em células cancerosas reativa o mutante p53 degradação dependente de proteassoma (Fig. 5F). Embora o mutante p53 pode ser alvo de MDM2 em células normais, não pode polyubiquitinate MDM2 a p53 mutante, em células cancerosas [28]. Este defeito é provavelmente devida ao aumento dos níveis de HSP70 e HSP90 em células cancerosas, que formam complexos com a proteína p53 mutante [24] – [26], [45]. Além disso, a sobre-expressa MDM2 isoforma B nas células cancerosas podem interagir com o-MDM2 de comprimento total e inibir a p53 mutante ubiquitinação mediada por MDM2 [38]. Estas alterações constituem uma oportunidade para alvejar tumores abrigando a p53 mutante. Com efeito, verificou-se que coopera com ATO 17AAG SAHA ou para inibir a expressão de p53 mutante e proliferação de células tumorais.

Embora a expressão ectópica de Pirh2 ou ATO tratamento sozinho pode diminuir significativamente o nível de p53 mutante, a combinação de expressão ectópica de Pirh2 e ATO tratamento diminui ainda mais o nível de p53 mutante (Fig. 3A-B). Isto implica que a capacidade de Pirh2 ligase E3 para degradar mutante p53 pode ser melhorada por tratamento de ATO. Uma possibilidade pode ser devido a modificações pós-translacionais-induzidas ATO de p53 mutante e Pirh2. Com efeito, foi relatado que depois da administração de arsénio na leucemia promielocítica aguda (APL), PML-RARa fusão oncoproteína sofre SUMOilação por pequenos modificadores de ubiquitina-like (Sumo) e são então submetidas a degradação mediada por RNF4 proteossómica [50], [51 ]. Inactivação de SUMOilação bloqueia completamente a degradação PML [52]. Assim, são necessários mais estudos para investigar se Pirh2 e /ou mutante p53 são modificados por sumo, que pode ser melhorada por tratamento de ATO, em células tumorais.