Abstract

Em alguns pacientes com câncer de esôfago, a radioterapia pode não prevenir metástases à distância resultando assim na sobrevida. O mecanismo subjacente de metástases nesses pacientes não está bem estabelecida. Neste estudo, foi demonstrado que a radiação ionizante pode induzir a transição epitelial-mesenquimal (EMT) acompanhado com o aumento da migração e invasão celular, através de regulação negativa da fosfatase e tensina homólogo (PTEN), e a activação da sinalização de Akt /GSK-3β /caracol. Nós desenvolvemos uma radiorresistente (RR) A linha de células de cancro escamoso esofágico, KYSE-150 /RR, por tratamento com radiação ionizante fraccionado (IR), e confirmou a sua radiorresistência usando um ensaio de sobrevivência clonogénica. Descobrimos que a linha de células /RR KYSE-150 exibido características típicas morfológicas e moleculares da EMT. Em comparação com as células parentais, KYSE-150 células /RR mostrou um aumento na pós-IR colónia sobrevivência, migração e invasão. Além disso, foi observada uma diminuição no PTEN em KYSE-150 células /RR. Postulamos que a sobre-expressão de PTEN pode induzir a transição epitelial-mesenquimal em KYSE-150 células /RR e restaurar aumento da migração de células induzida por IR. Mecanisticamente, fraccionado IR inibe a expressão de PTEN, o que leva a activação de Akt sinalização /GSK-3β e está associado com os elevados níveis de proteína Snail, um factor de transcrição envolvidos em EMT. Correspondentemente, o tratamento com LY294002, um inibidor de fosfatidilinositol-3-quinase, imitou efeito sobre-expressão de PTEN em KYSE-150 células /RR, sugerindo ainda um papel para a Akt /GSK-3β /caracol sinalização em efeitos mediados através de PTEN. Em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que fracionada EMT mediada por IR em células /RR KYSE-150 é através de vias dependentes de PTEN, com destaque para um efeito proinvasive direta de tratamento de radiação sobre as células tumorais

Citation:. Ele E, Pan F, G Li, Li J (2015) fracionado radiação Ionizante Promove a transição epitelial-mesenquimal em células de câncer de esôfago humano por meio PTEN Deficiência Mediada Akt Activation. PLoS ONE 10 (5): e0126149. doi: 10.1371 /journal.pone.0126149

Recebido: 27 de outubro de 2014; Aceito: 29 de março de 2015; Publicado em: 22 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. a pesquisa foi apoiada pelo Grant Financeiro Geral da China de Pós-Doutorado Science Foundation (a JL, Grant No. 2013M542451) (https://jj.chinapostdoctor.org.cn/V1/Program1/Info_Show.aspx?InfoID=270124f8-9c55-4916-ab8d-1ee53c952329). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de esôfago é um dos cânceres mais difíceis de tratar com a maior taxa de mortalidade oitavo entre todos os tipos de câncer em todo o mundo. [1] é o quarto cancro mais frequentemente diagnosticado e a quarta principal causa de morte por câncer na China. [2] carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) é o principal subtipo histopatológico de câncer de esôfago na China. A radioterapia é o esteio do tratamento da ESCC, mas falha local manteve-se uma grande preocupação, com doença persistente ou recorrente que está sendo relatado em cerca de 40-60% dos pacientes. [3] Um subconjunto de pacientes com câncer de esôfago não respondem à radioterapia devido ao surgimento de células radioresistente (RR) tumorais. A evolução clínica nestes pacientes é caracterizado por surtos frequentes e lesões metastáticas distantes. Investigando os mecanismos subjacentes envolvidos no desenvolvimento de células tumorais RR é de primordial importância para estudar o efeito da radioterapia na CCEE.

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é um processo pelo qual as células epiteliais diferenciadas sofrer alterações morfológicas notáveis a partir de um fenótipo de paralelepípedos epitelial para um fenótipo f ibroblástico alongada [3], que é caracterizada por diminuição da expressão de marcadores epiteliais, tais como a e-caderina e aumento da expressão de marcadores de mesenquimais, tais como vimentina e N-caderina. [4] Actualmente, EMT tem sido implicado em dois dos processos mais importantes responsáveis ​​pela mortalidade relacionada com o cancro ou seja, a invasão e a progressão para doença metastática distante, e a aquisição de resistência à terapêutica. [5] os estudos recentes sugerem que a EMT desempenha um papel crucial no desenvolvimento do cancro radiorresistência. Radiação mediada EMT tem sido amplamente estudada em vários tipos de tumores, tanto

in vitro

e

in vivo

, como colorretal, do colo do útero, mama e cancro do pulmão. [6-10] No entanto , o papel exacto de EMT e os mecanismos subjacentes envolvidos no desenvolvimento do cancro do esófago em radiorresistência continua por ser elucidado.

e Fosfatase homólogo tensina (PTEN) é um importante gene supressor de tumor, que é um regulador negativo da via -Akt fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K), participando assim na regulação do ciclo celular, proliferação, apoptose, adesão celular, e EMT durante a progressão do cancro e desenvolvimento embrionário. [11, 12]. Tem sido relatado que a diminuição da expressão de PTEN, pós-IR, induz radiorresistência, através da promoção da proliferação de células e inibição da apoptose de células do cancro do pulmão de células não pequenas e carcinoma nasofaríngeo. [13, 14] Directamente restaurar a função PTEN foi anteriormente relatado para ser uma abordagem valiosa para alcançar radiossensibilização

in vitro

. [15] no entanto, se PTEN participa desencadeada por radiação EMT e tumor metástase em ESCCs ainda não está claro.

Portanto, no presente estudo, temos a hipótese de o papel da PTEN no desenvolvimento de EMT induzida por radiação na CCEE. Foi examinado se (i) a irradiação poderia aumentar a capacidade de invasão de ESCCs induzindo EMT, (ii) deficiência de PTEN foi envolvido em EMT induzida por radiação, e (iii) EMT induzida por radiação foi através da activação de Akt /GSK-3β /sinalização caracol .

Materiais e Métodos

Materiais

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 foi obtida a partir de Gibco (Life Technologies Corporation, IN), soro fetal bovino (FBS) foi comprado de HyClone (Thermo, MA). Anticorpos para PTEN, E-caderina, N-caderina, Slug, Snail, vimentina, Akt, Akt fosforilada (P-Akt), GSK-3β, phosphorylatedGSK-3β (p-GSK-3β) e peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário foram adquiridos a CST (Cell Signaling Technology, MA). O inibidor de PI3K, LY294002, foi adquirido da Sigma (Sigma-Aldrich, MO). GoScript reversa sistema de transcrição e GoTaq qPCR Mestre Mix Kit eram de Promega (Promega, WI).

linha celular e cultura de células

linha de células CICAc Humano, KYSE-150 (JCRB1095, fornecido pelo Dr. . Fangfang Bu) [16, 17], foi cultivada em RPMI 1640 com FBS a 10% e 100 unidades de penicilina-estreptomicina e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO

2 numa incubadora humidificada. Antes de cultura, linhagem de células KYSE-150 foi autenticado pelo curta repetição em tandem profiling (Beijing Gene Microread Technology Co., China).

radiação ionizante fracionado tratamento (FIR) [18]

O KYSE -150 células foram cultivadas em 25 cm

2 frascos. Ao atingir aproximadamente 75% de confluência, as células foram irradiadas com 1 Gy de raios-X à temperatura ambiente usando a Hitachi MBR-1520-R irradiador (Hitachi Medical Corporation, Tóquio, Japão) a uma taxa de dose de 4.73Gy /min, e as células foram devolvidas à incubadora imediatamente após a irradiação. As células foram sub-cultivadas em novos frascos a aproximadamente 90% de confluência. Este processo foi repetido de modo a conseguir a exposição a radiação a uma dose de 1 Gy, 3 vezes; 2 Gy, 3 vezes; e 4 Gy, 7 vezes, e cada exposição foi em um intervalo de três dias; com a dose total de 37 Gy, sendo ao longo de um período de 2 meses. Vários clones foram isolados a partir das células de RR e cultivados individualmente. As células parentais foram tratados usando o mesmo procedimento, excepto que não foram irradiadas. Os ensaios clonogénicos foram utilizados para determinar o nível de resistência e um clone chamado KYSE RR-150 /RR foi seleccionado para a experiência.

sobrevivência clonogénica ensaio

células parentais e RR foram plaqueadas em seis poços placas de 500, 1000, 2000, 3000, 4000 células por poço. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram tratadas com uma dose individual de radiação (0, 2, 4, 6, ou 8Gy respectivamente). As células foram devolvidas à incubadora imediatamente após a irradiação para permitir que as colónias se formar. Após 14 dias, as colónias foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. As colónias contendo 50 culas foram contadas ao microscópio. fracção sobrevivente, (SF) foi calculado como o número de colónias /(células semeadas x eficiência de plaqueamento). A curva de sobrevida foi calculado utilizando GraphPad Prism 5.0. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes.

construção do plasmídeo e a transfecção

O plasmídeo recombinante pcDNA3.0-PTEN foi construído pela inserção do ADNc de PTEN humano no vector pcDNA3.0 (Invitrogen, CA ) com iniciadores como se segue: para a frente, 5 ‘cggggtaccccggccaccATGACAGCCATCATCAAAGAGATC 3’ (sublinhado Kpn1 + Kozak) e reversa, 5 ‘ccgctcgagcggTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC 3’ (sublinhado Xho1). KYSE-150 células /RR foram transfectadas com pcDNA3.0-PTEN ou controle do vetor pcDNA3.0. Todas as transfecções foram efectuadas utilizando ScreenFectA Transfection Reagent (Incella, Egggenstein-Leopoldshafen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas foram analisados ​​por transferência de Western, ou reacção inversa quantitativa em cadeia de polimerase (RT-qPCR).

ARN interferência no ensaio

KYSE-150 células, que não foram irradiados, foram transfectadas com 100 nmol de pequeno ARN interferente (siRNA) ou -PTEN nontargeting mexidos siRNA utilizando o reagente de transfecção ScreenFectA conforme as instruções do fabricante. siRNA-PTEN foi sintetizado com a seguinte sequência: 5′-GGGCCAGGTCATAAATAAT-3 ‘; enquanto que a sequência mexidos-siARN foi como se segue: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘

análise Western blot

As células foram lisadas em sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a tampão de lise, e foram homogeneizados para. extração de proteínas. Quantidades iguais de proteína de cada ligado foram separadas por SDS-PAGE (acrilamida 10%) e transferidas para membranas de PVDF Western blotting (Millipore Corporation, MA). Isto foi seguido por incubação com anticorpos primários a PTEN, E-caderina, N-caderina, Slug, Snail, vimentina, anticorpo secundário de Akt, P-Akt e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH, como controlo de carga), e conjugado com HRP . Os sinais blot foram então visualizadas com quimioluminescência aumentada (Thermo, MA).

extracção de ARN e RT-qPCR ensaio

O ARN total a partir de células cultivadas, após vários tratamentos, foi extraída com reagente TRIZOL ( life Technologies Corporation, IN) de acordo com as instruções do fabricante. Um micrograma de ARN total foi utilizado para a transcrição reversa. Um microlitro do produto total de transcrição reversa foi adicionado ao tempo-qPCR verdadeira mistura (20 ul) contendo 10 uL 2 x GoTaq qPCR Master Mix e iniciadores (sentido e anti-sentido; 1 uL) para determinar a expressão de ARNm de PTEN humano, E -cadherin, N-caderina, Caracol, Lesma, vimentina e β-actina. A expressão do gene de ARNm a partir de cada amostra foi calculada através da normalização com β-actina. Todos os iniciadores foram desenhados usando software de entrada PrimerQuest IDT (Tabela 1). As amostras foram amplificadas com uma retenção precycling a 95 ° C durante 30 s, 40 ciclos de anelamento e extensão a 60 ° C durante 34 s. Cada medida foi realizada em triplicado com ApplidBiosystems 7500 StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Inc., CA) e analisados ​​utilizando Applied Biosystem 7500 software v2.0.1.

ensaio de migração e invasão

Os ensaios de migração foram efectuados em um de 24 poços contendo filtros Transwell câmara de policarbonato com poros de 8 ^ m (Corning, Acton, MA). Um total de 500 forma uL contendo 20% de FBS como o factor quimiotáctico foi adicionado ao compartimento inferior e, em seguida, 1 × 10

5 células de cada grupo em DMEM isento de soro foram adicionadas ao compartimento superior da câmara e incubou-se durante 24 h. A superfície superior da câmara foi então raspada para remover as células não migratórias. células migradas foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e fotografadas sob um microscópio de luz (100 ×). As câmaras foram lavadas com 100 ul de ácido acético a 10% e a densidade óptica do eluente de células coradas foi medida a 560 nm. Cada grupo foi preparado em três poços duplicados. Para o ensaio de invasão, um sistema Transwell revestidas com 2 mg /ml foi utilizado de membrana basal, matrigel, (Corning, Acton, MA). O resto do procedimento foi semelhante ao ensaio de migração como descrito acima

-cicatrização de feridas ensaio

As células foram semeadas em placas de 12 poços e cultivadas até 40% de confluência.; a monocamada de células confluentes foi riscada com uma ponta de pipeta 20 mL para produzir uma linha vertical através do meio dos poços. A propagação do fechamento da ferida foi observada após a 0 e 24 h de intervalo e foi fotografada utilizando um microscópio de luz.

A análise estatística

As diferenças foram avaliadas pelo teste t de Student, para comparação de dois grupos. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (SD). A

P valor

de 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

Efeito da irradiação sobre a morfologia celular e EMT marcadores

Depois de dois meses. de abeto com uma dose total de 37 Gy, subclones foram isolados e denominados KYSE-150 células /RR, e o seu carácter RR foi demonstrado por ensaio de sobrevivência de células clonogénicas. Fig 1A mostra que KYSE-150 células /RR sobreviveu por um período mais longo quando comparado com células parentais.

As curvas de sobrevida celular radiação (A) e as figuras clonog�icas do controle KYSE-150 células sem irradiação e radiorresistência subclone KYSE-150 células /RR. (B) Morfologia das células /RR KYSE-150 KYSE-150 e foi examinado por microscopia de contraste de fase. (C) A expressão de marcadores EMT (E-caderina e vimentina) e repressores de transcrição de E-caderina (e caracol Slug) foram detectados por qRT-PCR, os dados apresentados como média ± DP, *

P

0,05. Os dados representam médias com desvio padrão de três experiências independentes. (D) Western blot representativos de E-caderina, vimentina, Caracol e Slug foram mostrou.

As células RR demonstraram alterações morfológicas. O controle KYSE-150 células (KYSE-150 Ctrl) teve uma morfologia epitélio-like, com conjunto célula-célula apertado e aparência de paralelepípedos-like (Fig 1B esquerda). As células /RR KYSE-150 desenvolvido uma morfologia fusiforme, com o aumento da formação de pseudopodia e perda de contacto célula-a-célula, o que é característico de fenótipo mesenquimal (Fig 1B direita). O ganho destas características morfológicas em sublinhas de RR pode sugerir no sentido de suas características transformada, como a migração e invasão. [19]

Para confirmar se esta mudança fenótipo foi atribuído a EMT, o mRNA e expressão de proteína de EMT- genes associados foram detectados por qRT-PCR e Western blots. KYSE-150 células /RR mostrou a regulação negativa da epitelial marcador E-caderina, e upregulation de vimentina marcador mesenquimais, quando comparado com KYSE-150 células CTRL (Fig 1C e 1D). Snail e Slug, reguladores negativos de E-caderina, eram críticos para EMT. [19] Em células /RR KYSE-150, tanto do caracol e Slug foram significativamente aumentados ao nível da proteína (Figura 1E), mas não foram alteradas no ARNm nível (Fig 1C). Estes resultados demonstram que a irradiação é suficiente para induzir EMT na linha celular CICAc.

Efeitos da irradiação sobre a migração celular e invasão

As células tumorais que se submetem a EMT ter aumentado a capacidade de migração celular e invasão. Para investigar se as células KYSE-150 /RR exibir tais características, foi avaliada a capacidade de migração e invasão de KYSE-150 Ctrl e células /RR KYSE-150

in vitro

. Cicatrização de feridas ensaio mostrou que a KYSE-150 células /RR tiveram fechamento significativamente mais rápido da área da ferida, comparando com KYSE-150 células CTRL (Fig 2A). A migração celular e invasão de células /RR KYSE-150 foi encontrada para ser aumentada em 50% e 33%, respectivamente, quando comparado com KYSE-150 células CTRL (Fig 2C). Imagens representativas para a capacidade de migração e invasão de cada uma das linha de células são mostradas na Fig. 2B

(A) células KYSE-150 foram submetidos a um ensaio de cicatrização da ferida, com ou sem radiação a 100 vezes. Imagens representativas foram fotografados à direita e 24 h após a zero. (B) Imagens representativas de ensaio de migração e ensaio de invasão de KYSE-150 células com ou sem radiação foram fotografados após 24 h com coloração de cristal violeta. (C) gráficos de resumo de migração e invasão (dados mostrados como média ± SD, *

P Art 0,05).

deficiência de PTEN é necessário para EMT induzida por irradiação

é relatado que a expressão de PTEN é diminuída em células tumorais RR. [13, 14] Foi investigada a expressão de ARNm e proteína de PTEN em KYSE-Ctrl e 150 células /RR KYSE-150. Os nossos resultados mostraram que a radiação diminuiu significativamente a expressão de PTEN tanto em ARNm e os níveis de proteína (Fig 3A). Para determinar os efeitos da deficiência de PTEN na migração celular e EMT, siRNA alvejando de PTEN foi usado (Fig 3B esquerda). A migração e invasão ensaio demonstrou que o knockdown de PTEN resultou num fenótipo claro migratório em células KYSE-150 quando comparadas com as células transfectadas de veículo (Fig 3D). As transferências de Western mostraram que as células KYSE-150-siPTEN exibiu perda de adesão celular marcador de E-caderina e em alçado mesenquimais diferenciação marcador vimentina (Fig 3C a esquerda).

(A) da radiação diminui significativamente a expressão de PTEN na Kese-150 células /RR não importa no nível de mRNA (dados apresentados como média ± SD, **

P Art 0,01) e nível de proteína (western blot representativos). (B) A eficiência transfectadas de siPTEN em KYSE-150 (à esquerda) e pcDNA-PTEN em KYSE-150 células /RR (direita) (dados apresentados como média ± SD, **

P Art 0,01) . (C) Análise de Western blot mostrou representativas expressão de PTEN, E-caderina e vimentina em KYSE-150 células transfectadas com siPTEN ou veículo, ou KYSE-150 células /RR transfectadas com pcDNA-PTEN ou pcDNA3.0. Os dados apresentados representam três experiências diferentes. (D) Imagens representativas de migração e invasão ensaio de KYSE-150 células transfectadas com siPTEN ou veículo após 48 h (à esquerda); gráficos de resumo é para migração e invasão (à direita, os dados apresentados como média ± SD, *

P Art 0,05). (E) Imagens representativas de ensaio de migração e ensaio de invasão de células /RR KYSE-150 transfectadas com pcDNA-PTEN ou pcDNA3.0 foram fotografados após 24 h com coloração de cristal violeta (à esquerda); gráficos de resumo de migração e invasão (à direita, os dados apresentados como média ± SD, *

P Art 0,05). siPTEN é curto para siRNA-PTEN.

Em seguida, usamos um vector que codifica PTEN (Fig 3B direita), para confirmar o papel de PTEN em EMT induzida por radiação e metástase do tumor. Verificou-se que a sobre-expressão de PTEN causada células KYSE-150 /RR para restaurar a expressão de E-caderina e diminuir a expressão de vimentina (Fig 3C direita). Além disso, o aumento das capacidades de migração e invasão de células /RR KYSE-150 foram significativamente inibida por sobre-expressão de PTEN (Fig 3E). Os dados indicam que a deficiência de PTEN é necessário para EMT induzida por radiação e fenótipo migratória /invasivo.

PTEN diminuição da expressão do caracol através da activação da via PI3K /Akt /GSK-3β

sinalização

e caracol Slug são repressores de transcrição que desempenham papéis importantes na metástase do tumor por downregulating e-caderina. [19] Como mencionado anteriormente, Caracol e Slug foram upregulated em KYSE-150 células /RR ao nível da proteína, mas não a nível mRNA. Para determinar se a expressão de Snail e elevada Slug eram devidos à deficiência de PTEN, após irradiação, se alterar a expressão de PTEN por transfecção com ARNsi contra PTEN ou vector de expressão de PTEN, e, em seguida, transferências de Western foram realizadas para determinar a expressão de Snail e lesma. Como mostrado na Fig 4A, expressão de Snail aumentou significativamente em KYSE-150 células Ctrl-siPTEN comparação com KYSE-150 de células Ctrl-siCtrl, enquanto, que foi diminuída em KYSE-150 células /RR-pcDNA-PTEN quando comparado com KYSE-150 /células RR-pcDNA. Em contraste, a expressão de Slug não foi significativamente alterada quando da expressão de PTEN. Além disso, de qRT-PCR mostrou nenhuma mudança significativa nos níveis de ARNm de Snail (Fig 4B). Estes resultados indicam que a sobre-regulação de Snail por irradiação é devido à redução dos níveis de PTEN.

(A) Expressão de Snail e Slug detectado por análise de Western blot em KYSE-150 células transfectadas com siPTEN ou veículo, ou células /RR KYSE-150 transfectadas com pcDNA-PTEN ou pcDNA3.0. (B) A expressão de Snail foi detectada por qRT-PCR, os dados apresentados como média ± DP. (C) Análise de Western blot mostrou representativas expressão da Akt, P-Akt, a GSK-3β e p-GSK-3β. Os dados apresentados representam três experiências diferentes. siPTEN é curto para siRNA-PTEN. (D) Análise de Western blot representativas mostraram expressão de Akt, P-Akt, a GSK-3β, p-GSK-3β, Snail e E-caderina em KYSE-150 células /RR com ou sem o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) inibidor, LY294002 (40 mM).

a ativação do PI3K /Akt /GSK-3β está emergindo como uma característica central da EMT, com GSK-3β regulação da expressão do caracol através da modificação pós-tradução. [20, 21] Nós supomos se PTEN regula a expressão do caracol através de via PI3K /Akt /GSK-3β em células CICAc. Como mostrado na Fig 4C, a fosforilação de Akt e GSK-3β foi regulada positivamente em KYSE-150 células /RR, mas não em células 150-KYSE Ctrl. E o knockout de PTEN, consequentemente, facilitada a fosforilação de Akt em KYSE-150 células ctrl, acompanhada por um aumento da fosforilação de GSK-3β (Figura 4C, no meio). Em contraste, a sobre-expressão de PTEN inibida Akt e fosforilação por GSK-3β em KYSE-150 células /RR (Fig 4C, à direita). Para fornecer uma prova adicional da inibição, dependente da sinalização de PTEN PI3K /Akt /GSK-3β, o inibidor de PI3K, LY294002, foi usada para simular o efeito de sobre-expressão de PTEN em KYSE-150 células /RR. LY294002 (40 uM) inibiu a Akt e a fosforilação por GSK-3β em KYSE-150 células /RR, e a expressão de Snail foi regulada negativamente e que da proteína E-caderina foi regulada positivamente (Figura 4D). Estes resultados sugerem que a deficiência de PTEN ativa Akt /GSK-3β /Snail via após irradiação.

Discussão

A radioterapia é um tratamento eficaz para o câncer de esôfago, mesmo em um estágio avançado. No entanto, a recorrência e metástase devido ao desenvolvimento de radiorresistência entre as células tumorais continua a ser um grande desafio. Estudos anteriores demonstraram que o fenótipo RR foi correlacionada com vários factores, incluindo alterações em pontos de verificação do ciclo celular, o crescimento retardado, e diminuição da apoptose. [22, 23] epitelial mesenquimal é também pensado para ser reguladas pela exposição a radiação. As evidências acumuladas indicam que a radiação ionizante é um dos indutores de EMT, o que tem sido demonstrado que ocorrem no momento da iniciação de metástases, que conduz à progressão do cancro, e está associada com o desenvolvimento de resistência à radioterapia por via oral, da mama e os cancros do pulmão . [6, 7, 24]

para investigar radiorresistência clínica, têm sido utilizados regimes de FIR

in vitro

para determinar os mecanismos moleculares radiorresistência subjacente. No presente estudo, nós desenvolvemos KYSE-150 células /RR derivados a partir de clones que sobreviveram após o tratamento FIR, [18], que imita de forma adequada resistência radioterapia em CICAc. célula KYSE-150 é uma linha celular de cancro esofágico amplamente utilizada para o estudo da resistência à radiação de carcinoma esofágico. [18, 25-27] linha celular KYSE-150 foi desenvolvido pelo Dr. Yutaka Shimada em 1991 a partir do CICAc pouco diferenciado ressecado a partir do esófago superior de uma de 49 anos de idade mulher japonesa receber radioterapia. [16] Portanto, esta linha de células pode ser facilmente modificado para uma linha celular RR. Verificou-se que o fenótipo de KYSE-150 células /RR comutada a partir de uma morfologia epitelial para uma morfologia mesenquimal após a irradiação. Simultaneamente, foi realizado ensaio de migração e invasão e verificaram que a capacidade de migração e a invasão de células /RR KYSE-150 foi aumentada quando comparada com as células parentais, o que sugere que EMT está envolvido no desenvolvimento de metástases em radiorresistência e CICAc.

Um passo fundamental na EMT é downregulation da caderina-E. E-caderina é regulado quer por fatores de transcrição, como zinc-finger relacionados com o Snail repressores de transcrição (Caracol e Slug), SIP-1 /ZEB-2 e básico fator de transcrição hélice-alça-hélice, torção, ou induzida ubiquitinação- endocitose. Em nosso estudo, encontramos FIR aumento da expressão de ambos Caracol e Slug a nível de proteínas e não mudou sua expressão de mRNA. a sobre-expressão ectópica de Snail também conduz à aquisição de resistência aumentada às propriedades semelhantes a células de apoptose e haste do cancro em várias células epiteliais. [28] A activação de Snail e espaçador pode ser um dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento de radiorresistência em CICAc após a radioterapia .

a activação da proteína quinase B (AKT) via desempenha um papel central nas três principais mecanismos radiorresistência, que são radiorresistência intrínseca; proliferação de células de tumor e a hipoxia. PTEN, como um inibidor da Akt, é relatado para associar com radiossensibilidade. Tem sido relatado que a expressão de PTEN foi diminuída em células RR de gástrica [15] e da nasofaringe [14] carcinoma, por sua vez, outros encontrar PTEN ser essencial para a atenuação de invasão e EMT. [11, 29] que encontramos a expressão de PTEN ser regulada negativamente após FIR, e a sobre-expressão de PTEN restaurado o fenótipo de células /150 /RR KYSE a partir da morfologia mesenquimal à morfologia epitelial, acompanhada com a diminuição da migração e invasão.

para investigar ainda mais o papel de PTEN em desencadeada por radiação EMT, Akt /GSK-3β /caracol via foi estudada, que tenha sido previamente implicado no desenvolvimento do cancro do pulmão induzida por radiação. [10, 30] Colocámos a hipótese de um papel para PTEN que conduz ao aumento de E -cadherin expressão através da via de Akt /GSK-3β /caracol. Activo GSK-3β pode fosforilar caracol para facilitar a sua degradação, [20, 21] Por outro lado inactivação de GSK-3β, pode estabilizar caracol. [30] Os nossos dados mostraram que a sobre-expressão de PTEN pode atenuar a expressão induzida por radiação de Snail por desfosforilação da Akt em células /RR KYSE-150, que acelerou a regulação negativa da p-GSK-3β e promoveu a degradação do caracol. Snail, como um dos repressores de transcrição de E-caderina, ao chegar downregulated causou a regulação positiva da expressão de E-caderina. Para provar ainda mais o envolvimento da sinalização da via PI3K /Akt /GSK-3β de um modo dependente de PTEN, inibidor de PI3K, LY294002, foi usada para simular o efeito de sobre-expressão de PTEN em KYSE-150 células /RR. LY294002 inibida Akt e fosforilação GSK-3β em KYSE-150 células /RR, ea expressão de Snail foi reprimidos e proteína E-caderina foi regulada. Considerados em conjunto, os dados sugerem que a regulação negativa de PTEN está relacionada com inactivação da GSK-3β, e a sinalização de PI3K-PTEN dependente /Akt /GSK-3β é necessário para regular positivamente caracol por EMT induzida por radiação para se desenvolver em ESCCs.

vimentina, um componente principal do citoesqueleto das células mesenquimais, é muitas vezes usada como um marcador de progressão durante EMT metastático. Tem sido relatado que o bloqueio da via PI3K /Akt sinalização expressão de vimentina atenuada em células de carcinoma oral [31]. No nosso estudo, vimentina foi regulado para cima em KYSE-150 células /RR (Fig 1D) e a sobre-expressão de PTEN inactivado PI3K /Akt sinalização que conduz a regulação negativa da expressão de vimentina nestas células (Fig 1C). Isto sugere que a deficiência de PTEN é necessário para EMT induzida por radiação. Vale ressaltar que Slug, outro repressor da transcrição-caderina E, é sobre-regulada na radiação (Fig 1D); No entanto, os níveis de Slug não foram encontrados para ser afectada pela expressão de PTEN (Fig 4A). Esta descoberta indica que EMT induzida por radiação é um processo complexo e outras vias podem também estar envolvidos.

Neste estudo foi elucidado os detalhes da via de EMT em radiação desencadeada CICAc (Fig 5). Este estudo destaca a importância de PTEN como um potencial alvo terapêutico. A infra-regulação de PTEN e regulação positiva da via PI3K desencadeada por radiação evoca as cascatas que levam a EMT. Todos estes efeitos em conjunto contribuem para a metástase do tumor e recidiva após radioterapia. Por isso, sugerimos que a deficiência de PTEN subsequente à radioterapia para o cancro esofágico desempenha um papel importante no desenvolvimento de metástases de tumores RR. Assim, a sobre-expressão de PTEN pode vir a ser uma estratégia útil para impedir a invasão de células de cancro e metástases, que pode desenvolver-se após a radioterapia em CICAc.

PTEN actua como um regulador a montante da via PI3K /Akt /GSK-3β sinalização rede para evocar as cascatas de EMT. Slug regula a expressão da caderina-E de uma forma independente PTEN.