Sumário

A autofagia é um processo evolutivamente conservada responsáveis ​​pela degradação e reciclagem de componentes citoplasmáticos através autolysosomes. Segmentação eixo AR é uma estratégia padrão para o tratamento do câncer de próstata; No entanto, o papel de AR em processos autofágicos ainda não está completamente entendido. No presente estudo, verificou-se que a RA desempenhou um papel negativo na AR degrader autofagia induzida por Celastrol. Knockdown da AR em células de câncer de próstata AR-positivos resultaram em autofagia reforçada. A expressão ectópica da AR em células de câncer de próstata AR-negativo, ou ganho de função da sinalização AR em células AR-positivas, levou à supressão de autofagia. Desde miR-101 é um inibidor da autofagia e sua expressão foi reduzida junto com AR no processo de autofagia induzida por Celastrol, nós supomos que AR inibe a autofagia através de transativação de

miR-101

. AR sítio de ligação foi definido no montante do

miR-101

gene por ensaios de repórter de luciferase e chip. expressão de miR-101 correlacionada com o estado de AR em linhas celulares de cancro da próstata. A inibição da autofagia induzida por Celastrol por AR foi comprometida através do bloqueio de miR-101; enquanto que a transfecção de miR-101 conduziu a inibição da autofagia induzida por Celastrol apesar de depleção AR. Além disso, a mutagénese do sítio AR obrigatório em

miR-101

gene levou à diminuição da supressão da autofagia pela AR. Finalmente, a inibição por autofagia miR-101 mímico foi encontrado para melhorar o efeito citotóxico de Celastrol em células de cancro da próstata. Nossos resultados demonstram que a RA inibe a autofagia

via

transativação de

miR-101

, assim combinação de miR-101 imita com Celastrol pode representar uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento de câncer de próstata.

Citation: Guo J, Huang X, Wang H, Yang H (2015) Celastrol Induz Autophagy por Segmentação AR /miR-101 em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 10 (10): e0140745. doi: 10.1371 /journal.pone.0140745

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 13 de junho de 2015; Aceito: 30 de setembro de 2015; Publicação: 16 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Natural Science Foundation da Província de Heilongjiang, China (C201432), Inovação Projeto de Pesquisa de Harbin, China (2012RFLXS011) e Fundação de Pesquisa científica para o Devolvido Overseas Chinese estudiosos, Ministério de Educação do Estado

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a autofagia é um processo conservada responsáveis ​​pelo volume de negócios de longo. proteínas viveram ou remoção de organelas danificadas em células eucarióticas. É regulado por uma série de genes relacionados autophagy (ATG) que estão envolvidos na iniciação, a formação e maturação autophagosome [1]. Autophagy normalmente ocorre em níveis basais, mas é induzida em resposta ao stress, incluindo a estimulação de fome, hipoxia, privação de hormona ou [2]. O aumento da autofagia pode fornecer um benefício para as células cancerosas para lidar com as condições que não são favoráveis ​​para sobreviver.

Celastrol, um triterpen�de isolado da medicina tradicional chinesa ‘Thunder of God Vine’ tem demonstrado eficácia contra câncer de próstata humana

in vitro

e

in vivo

[3, 4]. Ela promove a desestabilização do receptor de androgénio (AR) através da inibição da Hsp90 ou activação da calpaína [5, 6]. Ar é um membro da superfamília de esteróide de factores de transcrição activados de ligandos. Ela desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata, a terapia de privação de androgénio, assim, através de castração médica ou cirúrgica é uma estratégia padrão para o tratamento de cancro da próstata [7]. Bloqueio via de sinalização AR foi mostrado para provocar autofagia em linhas celulares de cancro da próstata positivos AR, o que é favorável para a sobrevivência celular ou a morte celular, dependendo dos inibidores específicos aplicados e os contextos celulares [8-11]. Indução de autofagia foi encontrada para melhorar a viabilidade celular em cima da privação do andrógeno e hipóxia ou em condições de fome [8, 9, 11]. AR degrader foi mostrado para induzir a morte de células através da indução de autofagia [10]. Várias moléculas, tais como Grp78 e AMPK tem sido demonstrado estar envolvida na regulação da privação de androgénio autofagia induzida [8, 9]. No entanto, como um factor de transcrição, o mecanismo pelo qual regula autofagia AR ainda não foi completamente compreendido. Nossos dados de microarranjos mostraram que a expressão de miR-101 foi regulada para baixo quando a autofagia foi induzida por Celastrol. MiR-101 foi classificado como um inibidor da autofagia, que suprime a indução e maturação de autofagia, visando

ATG4D

,

RAB5A

e

STMN1

[12]. Além disso, um local de ligação de AR foi previsto na região a montante do

miR-101

gene [13]. Estas descobertas levaram a nossa hipótese de que Celastrol induz a autofagia, visando AR /miR-101 em células de câncer de próstata. No presente estudo, verificou-se o sítio de ligação da AR na região a montante do

miR-101

gene por ensaios de repórter de luciferase e chip. A expressão de miR-101 foi encontrada uma correlação com o estado de AR em linhas celulares de cancro da próstata. Apesar depleção AR por Celastrol, transfecção de miR-101 em células LNCaP mímico leva à inibição da autofagia. Quando o miR-101 foi bloqueada, a inibição AR em autofagia foi aliviada. Além disso, a mutagénese de sítio de ligação de AR na região a montante do gene da

miR-101

levou à diminuição da inibição da autofagia AR-mediada.

Materiais e Métodos

Chemical e oligonucleotídeos

Celastrol foi adquirida da empresa química Cayman (Ann Arbor, MI, EUA). Todos os oligonucleótidos foram sintetizados por Ribio (Cantão, China), com as seguintes sequências: miR-101 mímico, 5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3 ‘; miARN imitar controlo negativo (Ncontrol) # 22: 5’-UUUGUACUACACAAAAGU ACUG-3 ‘, o miR-101 inibidor: 5′-UUCAGUUAUCACAGUACUGUA-3′; inibidor de miRNA Ncontrol # 22: 5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3 ‘. siRNA para AR: 5’-GGTGATCACAGGATAGGTATT-3 ‘, siRNA de controlo: 5′-GGGCCATGGCA CGTACGGCAAG-3’.

Cultura de células e transfecção de células

linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP, 22Rv1 , DU145 e PC-3 foram obtidas a partir de Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology (Xangai, China), e cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco BRL Co. Ltd., EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Biological Industries, Israel) e 1% de penicilina /estreptomicina numa atmosfera humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO

2/95% de ar.

Para inanição de androgénio, as células LNCaP foram cultivadas em meio RPMI livre de fenol vermelho-1640 (Gibco BRL Co. Ltd., EUA) contendo 1% de FBS despojado com carvão (Invitrogen, Eugene, OR, EUA) durante 24 h antes de experiências.

a transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Eugene, OU, EUA). transfecção transiente de pEGFP-C1-AR ou vector vazio (Addgene) foi realizada em LNCaP ou PC-3 células. Após a transfecção, o meio foi substituído com meio fresco contendo 1 nM de R1881. Transfecção estável de pEGFP-C1-AR ou vector vazio foi realizada em células DU145. As células foram pré-tratadas com R1881 (1 nM) durante 24 h antes da experiência. As células LNCaP foram transfectadas com pEGFP-LC3 (Addgene) e seleccionados com 0,8 mg /ml de G418 (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) para se obter transfectantes estáveis.

Os plasmídeos

pGL3-Basic foi uma oferta generosa do Dr. Li Yu (Instituto de Tecnologia de Harbin, China). Para gerar construções repórter, pGL3-B-miR-101-L e pGL3-B-miR-101-S, um fragmento de DNA 1793 pb no montante de

miR-101

gene que contém o previsto AR obrigatório local e o seu fragmento mais curto com eliminação do sítio de ligação previsto AR foram amplificados utilizando os iniciadores 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCT ACAT-3 ‘; 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCCACCCAGCTCACC-3 ‘, 5′-e CGCAC GCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3′; 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCC ACCCAGCTCACC-3 ‘, respectivamente, e clonado no vector pGL3-Basic. A construção repórter que contém um fragmento de 300 pb com o local previsto de AR de tipo selvagem de ligação, pGL3-B-miR-101-PEP, foi amplificado com PCR utilizando os iniciadores 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3 ‘, 5’-e CCGCTCGAG CTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC- 3 ‘. Para mutagenizar o sítio de ligação previsto Ar em pGL3-B-miR-101-PEP (designado pGL3-B-miR-101-MBS), foi realizada em duas etapas de PCR. Para o primeiro passo do PCR, utilizando os seguintes iniciadores (nucleótidos mutados foram indicados por letras minúsculas): 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCC TACAT-3 ‘; 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ‘, 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAA AGTTA-3′; e foram usadas 5’-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3 ‘. Os produtos de PCR foram utilizados como molde para o segundo passo de PCR utilizando o par de iniciadores externo.

construto pGL3-B-miR-101W foi gerado por amplificação por PCR de um fragmento de ADN de 2166 pb contendo tanto no sítio de ligação AR e a sequência do gene de miR-101 utilizando os iniciadores 5′-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ‘, 5′-CCGCTCGAGAT GTTACCACGCCATTTA-3′ e clonagem no vector pGL3-Basic. A sua forma mutante de construção, pGL3-miR-101M, foi gerado com-PCR em dois passos como descrito acima utilizando dois pares de iniciadores que contêm um local de ligação AR mutante 5’-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ‘; 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ‘, 5′-e CTATcTtaAATATtcTaTAAAGTTA-3′; 5’-CCGCTCGAGATGTT ACCACGCCATTTA-3 ‘. Letras em minúsculas indicam os nucleótidos mutantes.

Quantitative real-time PCR

O ARN total foi extraído a partir de células usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Eugene, OR, EUA). Um total de 1,0 ^ g de ARN total foi usada para sintetizar DNA complementar usando EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (transgen, Pequim, China). qPCR foi realizado para determinar os níveis de expressão de cada gene usando os seguintes iniciadores: Atg5: 5′-GCAAGCCAGACAGGAAAAAG-3 ‘, 5′-GACCTTC AGTTGGTCCGGTAA-3′; ATG7: 5’-CAGGAGATTCAACCAGAGAC-3 ‘, 5′-AGAT ACCATCAATTCCACG G-3′; AR: 5’-CAGCAACAGCAGCAGGAAGC-3 ‘; 5’-CTTT TGCATTCGGCCAATGG-3 ‘; GAPDH: 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘; 5’-G GCATGGACTGTGGTCATGAG-3 ‘. Pri-miR-101: 5’-GTATTTCGTAGGACAGG-3 ‘; 5’-TCTACAGGAAGCGAGT-3 ‘. Os dados foram normalizados para níveis de expressão de GAPDH.

miARN expressão foi analisada como relatado por Shi

et al [14]. Resumidamente, o ARN total (1 ug) foi poliadenilado utilizando um kit de poli (A) Tailing (Ambion Inc., Foster, CA) seguindo as instruções do fabricante. Após extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol, o RNA foi transcrito reverso com transcriptase EasyScript (transgen, Pequim, China) e 0,5 ug de poli (T) adaptador 5′-GCTGTCA ACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT (24) N (A /C /G reversa ) -3 ‘de acordo com os protocolos do fabricante (Invitrogen, Eugene, OR, EUA). expressão de miR-101 foi determinada utilizando os iniciadores 5’-GCTGTCAACGATACGCTA-3 ‘e 5′-CAGTACTGTG ATAACTGAA-3’. Os dados foram apresentados como uma média de três experiências e normalizadas para a expressão de ARN U6 endógena utilizando o método ΔΔCT.

análise Western blot

lisados ​​celulares totais foram preparados usando tampão RIPA contendo 10 mM de Tris -HCl (pH 8,0), NaCl 150 mM, 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio, 0,8% de Triton X-100 e mistura de inibidores de protease (Roche, Mannheim, Alemanha). Western blot foi realizada tal como descrito em [15]. Resumidamente, 40 a 100 ug de proteínas por poço foram separados por gel de poliacrilamida e depois electro-transferidas para membranas de PVDF. Após 2 h de bloqueio, as membranas foram lavadas e sondadas com os anticorpos primários seguintes: de coelho anti-LC3, de murganho anti-p62 e anti-PARP (Cell Signaling Technology, EUA), de ratinho anti-GAPDH (KC-5G4) (Kangchen , Xangai, China), AR rato (SC-816) e PSA rato (sc-7316) (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). a expressão da proteína foi detectada por ECL (PPLYGEN, Beijing, China) e visualizada utilizando LI-COR Odyssey 2800 (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA).

ensaios de repórter de luciferase

DU145 células de cancro da próstata foram plaqueadas em placas de 24 poços (1 × 10

5 por poço) durante 24 h e co-transfectadas com 300 ng de construções repórter (pGL3-B-miR-101-L, pGL3-B-miR -101-S, pGL3-B-miR-101-PEP, pGL3-B-miR-101-MBS ou pGL3-Basic), 300 ng de plasmídeos pEGFP-C1-Ar ou pEGFP-C1 e 10 ng de pRLSV40 (Promega , San Luis Obispo, CA, EUA) utilizando Lipofectamine 2000. Após a transfecção, o meio foi substituído com meio fresco contendo R1881 (1 nM) e colhidas 24 h mais tarde. actividades de luciferase foram analisadas usando o sistema luciferase dupla ensaio de repórter (Promega, San Luis Obispo, CA, EUA) num Turner TD20 /20 luminómetro e normalizada para a actividade da luciferase da Renilla. Os ensaios

ChIP

chip foi realizada como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, as células DU145 ou LNCaP foram transfectadas com pEGFP-C1-AR ou pEGFP-C1. Após 24 h de transfeco, o meio foi substituído com meio fresco contendo 1 nM de R1881 durante a noite. As células foram colhidas e reticulado com 1% de formaldeído, durante 10 min a 37 ° C. As células fixadas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato arrefecida em gelo, e ressuspensas em tampão hipotónico gelado (HEPES 10 mM, MgCl 1,5 mM

2 e KCl 10 mM), seguido de homogeneização. núcleos recolhidos foram ressuspensos em tampão hipotónico e sonicada até um comprimento médio de ADN de 200 a 1000 pb. Alíquotas (1%) de ADN cortado foram removidos como entrada, e o restante foi usado para a reacção ChIP indivíduo de forma igual. As soluções foram pré-aclarados de cromatina através da adição de proteína A-Sepharose (GE Healthcare, Fairfield, EUA) durante 2 horas e incubou-se com 10 ug de anticorpo AR ou IgG como controlo negativo durante a noite a 4 ° C. Os complexos de proteína /ADN imunes foram recolhidos por centrifugação a 4 ° C, lavou-se com tampão de diluição (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM e um cocktail inibidor de proteína), e tampão de eluição (0,1 M NaHCO

3 e 1% de SDS). Protein /DNA ligações cruzadas foram revertidos pela adição de NaCl até uma concentração final de 200 mM, seguido por incubação a 65 ° C durante 4 h. Depois da purificação do ADN, a PCR foi realizada para detectar a expressão de miR-101 utilizando os seguintes iniciadores: 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTA CAT-3 ‘, 5′-e CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3’. Os produtos de PCR foram analisados ​​em géis de agarose (2%), com brometo de etídio.

microscopia confocal

células LNCaP com expressão da GFP-LC3 foram semeadas em placas de 6 poços. Após o tratamento Celastrol, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 15 min e lavadas com PBS três vezes. As células foram em seguida permeabilizadas com 0,05% (v /v) de Triton X-100, coradas com DAPI (Invitrogen, Eugene, OR, EUA) e analisadas utilizando microscopia confocal (Zeiss, LSM510). O número de ponteada GFP-LC3 foi quantificada. foram seleccionados células positivas que continham cinco ou mais pontos lacrimais. Cinquenta células por condição de cada ensaio foram analisados.

ensaios MTT

células LNCaP foram plaqueadas numa placa de 96 poços (5000 /poço). Após os tratamentos, foi adicionado MTT (5 mg /ml) e incubou-se a 37 ° C durante 4 h para permitir a clivagem completa do sal de tetrazólio por células metabolicamente activas. tampão de lise celular (20% de SDS, 20 mM de HCl) foi adicionada a cada poço, seguida por análise colorimétrica utilizando uma absorvância Leitor de Microplacas iMark (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) a 595 nm.

Colony ensaios de formação de

células LNCaP foram tratados com Celastrol na presença ou ausência de miR-101 de controlo negativo ou mímica ou bafilomicina A1 (biotecnologia Sangon, Shanghai, China) durante 24 h. Após os tratamentos, as células LNCaP (500 /poço) foram semeadas em placas de seis poços e cultivadas durante 15 dias sem perturbação. As células foram então fixadas com 4% de formaldeído em PBS e coradas com violeta de cristal. Colónias com mais de 50 células foram contadas.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software estatístico SPSS. Todos os valores foram expressos como a média ± DP, duas comparações entre grupos foram realizadas pelo teste t de Student emparelhado. Os dados a partir de vários grupos foi analisada por ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de Dunnett. Para todos os testes, o nível de significância foi definido como * ou #,

P Art 0,05; **,

P

. 0,01

Resultados

Celastrol induz a autofagia em células cancerosas humanas da próstata

Segmentação AR com Celastrol para tratamento de câncer de próstata tem foi demonstrado por vários grupos [3, 5]. Desde a inibição AR está associada com a indução de autofagia, seja Celastrol poderia induzir a autofagia em células de câncer de próstata humana foi determinada. Como mostrado na Fig 1, a indução de genes relacionados com a autofagia

Atg5

e

ATG7

foi observado em pontos de tempo iniciais após o tratamento Celastrol em células de cancro da próstata LNCaP (Fig 1A). ATG7 actua como a enzima E1-ubiquitina como Atg5 enquanto actua como substrato ubiquitinação ou uma enzima E3, como no processo de ubiquitinação duas fases [1]. De acordo com suas funções na indução de autofagia,

ATG7

apresentaram maior expressão e resposta mais cedo do que

Atg5

após tratamento Celastrol (Fig 1A). Ambos Atg5 ATG7 e são necessários para o recrutamento de LC3, a proteína associada a microtúbulos que se difunde no citoplasma, a membrana autophagosome. Para visualizar o recrutamento LC3, as células LNCaP foram transfectadas com um plasmídeo que codifica para a LC3 GFP. foram observados pontos lacrimais GFP-LC3 para aumentar de forma significativa após 6 h de tratamento com Celastrol (Figura 1B e 1C). Em conformidade, a conversão de LC3-I da sua forma lípido LC3-II, a marca de autofagia, foi detectado após 3-6 h tratamentos e aumentou visivelmente depois de 12-24 h de tratamento (Figura 1D). p62 é um receptor na membrana autophagosome, que é degradado no lisossoma após a fusão com ele autophagosome [17]. nível de proteína p62 foi reduzida após 6-24 h o tratamento com Celastrol (Figura 1D), confirmando ainda que Celastrol autofagia induzida em células LNCaP.

células LNCaP parentais (A, D) ou as células transfectadas com GFP-LC3 (B, C) foram tratados com Celastrol a 2,0 uM para os tempos indicados. expressões de ARNm de genes relacionados autophagy foram medidos por qPCR (A). RQ, a quantidade relativa. células transfectadas GFP-LC3 foram coradas por DAPI depois de tratamentos. GFP-LC3 pontos lacrimais foram observadas sob microscópio confocal (B) e quantificada em C. As células que continham mais de 5 pontos lacrimais foram seleccionados e cinquenta células foram analisados ​​para cada tratamento. D, os extractos de proteína foram coradas imunologicamente com anticorpos contra a LC3, p62 e GAPDH (controlo de carga). Os asteriscos indicam significância em comparação com o controlo (0 h). *,

P Art 0,05; **,

P

. 0,01

níveis de expressão AR correlacionam inversamente com induzida por Celastrol autofagia

Nas mesmas amostras de cima, proteína AR foi diminuída por Celastrol durante processos autophagy indução. Celastrol tratamento causou uma diminuição substancial nos níveis de expressão do AR em 3-6 pontos de tempo e h uma depleção quase completa em 12-24 h pontos de tempo (Fig 2A). Em consonância com as conclusões anteriores, siRNA knockdown da AR em células LNCaP positivos AR levou a ~ aumento de 2 vezes da conversão LC3-I para LC3-II (Fig 2B). Em comparação com o controlo, a proteína p62 foi diminuída por AR siRNA (Figura 2B), indicando que a RA regulada negativamente autofagia. androgénio sintético R1881 foi usado para activar a sinalização AR endógeno em células LNCaP, o que foi evidenciado pelo aumento dos níveis de proteína de AR e sua PSA alvo (Fig 2C). Com AR sinalização activação, autofagia foi inibida, como mostrado pelo aumento dos níveis de p62 e diminuição meia vezes de LC3-II /rácio LC3-I (Figura 2C), ainda confirmando que AR desempenha um papel na regulação negativa autofagia. Além disso, pEGFP-AR foi transfectado em células LNCaP. Após o tratamento Celastrol, diminuição da conversão de LC3-I lc3-II foi detectada em células transfectadas pEGFP-RA em comparação com a transfecção simulada (Figura 2D), o que indica que a sobre-expressão de AR forçado autofagia inibida desencadeada por Celastrol. Celastrol autofagia também induzida em células DU145 negativas Ar, que podem ser suprimidas por AR exógena (Figura 2E).

A, as células LNCaP foram tratados com Celastrol a 2,0 uM para os tempos indicados, o nível de proteína de AR foi revelado por transferência de Western utilizando GAPDH como um controlo de carga. B, as células LNCaP foram transfectadas com AR ou ARNsi de controlo, durante 24 h, os efeitos sobre o knockdown AR e a indução autofagia foram verificadas por transferência de Western utilizando anticorpos de GAPDH (controlo de carga) AR, LC3, e p62. C, as células LNCaP foram submetidos a jejum de androgénio, tal como descrito em “Materiais e Métodos”, seguido por um tratamento nM de R1881 durante 24 h. AR e sua PSA-alvo, bem como os fabricantes autofágicos LC3 e p62 foram detectadas por Western blotting utilizando GAPDH como um controlo de carga. células LNCaP (D) ou DU145 (E) foram transfectadas com pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ou vector vazio (EGFP-V). D, após a transfecção, as células LNCaP foram cultivadas em meio contendo R1881 (1 nM) e tratou-se com ou sem Celastrol (CEL) a 2,0 uM durante 24 horas (D). E, DU145 células transfectadas estavelmente foram pré-tratados com R1881 (1 nM) durante 24 h antes do tratamento Celastrol como D. LC3 foi detectada por transferência de Western utilizando GAPDH como um controlo de carga.

AR medeia a supressão de expressão de miR-101 por Celastrol tratamentos

para ver envolvimento miARN no processo de autofagia induzida por Celastrol, as células LNCaP foram tratados com Celastrol durante 12 h para induzir autofagia. matriz miARN foi realizado e mostrou que a expressão de miR-101, um inibidor autofagia, foi diminuída em Celastrol (dados não mostrados). A supressão da expressão de miR-101 por Celastrol foi confirmada por RT-PCR, o que revelou uma diminuição ~ 3 vezes de pri-miR-101 e miR-101 amadurecer em células LNCaP Celastrol pós-tratamento (Figura 3A, para a esquerda e do meio). Isto foi acompanhado por uma depleção quase completa de AR (Fig 3A, à direita), sugerindo uma correlação positiva entre a expressão de AR e miR-101 após tratamento Celastrol. Ar é um factor de transcrição e o seu local de ligação tem sido previsto na região a montante do

miR-101

gene [13]. Assim, é concebível que a RA é o mediador da repressão da expressão de miR-101 por Celastrol. Para testar esta possibilidade, primeiro determinado se AR poderia ligar-se ao previsto AR sítio de ligação na região a montante do

miR-101

gene por ensaios de repórter de luciferase. construções repórter de luciferase foram gerados como se mostra na Figura 3B. pGL3-B-miR-101-S (sem o previsto AR local de ligação) mostrou cerca de 5 vezes a diminuição da actividade de luciferase em comparação com pGL3-B-miR-101-L (com fragmentos abrangendo o previsto AR local de ligação) (Fig 3C ). Além disso, pGL3-B-miR-101-MBS em que o sítio de ligação de AR foi mutada mostraram ~ 5 vezes a diminuição da actividade de luciferase em comparação com pGL3-B-miR-101-PEP que continha o local de ligação de tipo selvagem (Figura 3C) , indicando que esta sequência específica é responsável pela identificação de AR. Em seguida, utilizamos ensaios chip para determinar se AR poderia ligar-se a esta sequência. células DU145 foram transfectadas com pEGFP-AR ou pEGFP-V. proteínas nucleares foram isolados e imunoprecipitados com anticorpo AR ou IgG de rato controle. Como esperado, o fragmento de miR-101 que contém o local de ligação foi especificamente amplificado em células transfectadas com pEGFP-AR (Fig 3D superior), demonstrando que a AR pode ser recrutados para este local. Em células LNCaP,

miR-101

fragmento foi amplificado após transfecção simulada (parte inferior Fig 3D), mostrando que a AR endógeno poderia ser recrutados para o são de

miR-101

. Finalmente, AR superexpressão completamente resgatado pri-miR-101 e miR-101 amadurecer expressões após o tratamento Celastrol, mostrando AR mediação

miR-101 redução

transcrição mediante tratamento Celastrol (Fig 3E).

A , expressões miR-101 e AR após o tratamento Celastrol (CEL). **,

P Art 0,01, em comparação com DMSO. B, Representação esquemática do repórter luciferase constrói conforme detalhado em “Materiais e Métodos”. tipo selvagem e de ligação AR locais mutantes foram indicadas por hífen itálico e transversal, respectivamente. C, células DU145 foram transfectadas com construções repórter indicada na presença de pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ou o plasmídeo por 24 h pEGFP-C1 (EGFP-V), e, em seguida, foi detectada actividade de luciferase. pRLSV40 plasmídeo foi co-transfectado para a normalização. **,

P Art 0,01, entre transfections EGFP-AR e EGFP-V. D, Ensaio ChIP. Os extractos celulares de células DU145 ou LNCaP transfectadas com pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ou pEGFP-C1 (EGFP-V) foram imunoprecipitados com anticorpo AR ou IgG de murganho normal. De entrada foi de 1/100 da cromatina sonicada antes da imunoprecipitação. A PCR foi realizada como descrito na secção “Materiais e Métodos”. E, células LNCaP transfectadas com pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ou vector vazio (EGFP-V) foram tratados com Celastrol (CEL, 2,0 uM) ou DMSO durante 3 h, pri-miR-101 e amadurecer o miR-101 foram determinados por qPCR. Os asteriscos indicam significância entre transfections EGFP-AR e EGFP-V. *,

P Art 0,05; **,

P

. 0,01

AR regula miR-101 expressão em células cancerosas humanas da próstata

AR estatuto poderia afetar miR-101 expressão em humanos células cancerosas da próstata. Real-Time PCR revelou que os níveis de expressão de pri-miR-101, bem como madura miR-101 eram significativamente mais elevados em LNCaP AR-positivas e células que 22Rv1 do que em células DU145 e PC3 AR-negativa (Fig 4A). AR foi derrubado por siRNA em LNCaP (Fig 4B, esquerda) ou células 22Rv1 (Fig 4B, à direita). AR knockdown resultou numa diminuição da expressão de miR-101 maduro, que eram comparáveis ​​ao decréscimo de pri-miR-101 em ambos LNCaP e 22Rv1 células (Fig 4C). expressão AR forçada causada miR-101 níveis aumentaram em células DU145 e PC3 AR-negativos (Fig 4D). Da mesma forma, exógeno AR também aumentou o miR-101 expressões Celastrol após o tratamento (Fig 4D). Em células LNCaP, AR endógeno foi re-ativado por R1881 após a privação de andrógeno. Com a activação de AR (Figura 4E, superior), os níveis de miR-101 de expressão foram regulados positivamente (Figura 4E). Estes resultados demonstram que a RA principalmente regula

miR-101

transcrição, mas não de maturação.

A, expressões de pri-miR-101 e miR-101 amadurecer foram determinadas na célula positiva ou negativa AR linhas por qPCR. **,

P Art 0,01 entre dois grupos comparados. células B, LNCaP ou 22Rv1 foram transfectadas com AR ou ARNsi de controlo (Ctrl siRNA). efeitos knockdown AR foram verificadas por transferência de Western. Expressões de pri-miR-101 e miR-101 amadurecer foram determinadas por qPCR (C). *,

P Art 0,05

contra

controle de siRNA. D, ou DU145 células PC-3 foram transfectadas com pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ou vector vazio (EGFP-V) e tratou-se com DMSO ou Celastrol (CEL, 2 uM) durante 24 h. Expressões de madura miR-101 foi determinada por qPCR. *,

P Art 0,05 entre transfections EGFP-AR e EGFP-V. E, as células LNCaP foram tratados com R1881 (1 nM) durante 24 h após a inanição de androgénio, tal como descrito na Figura 2C. Os níveis de proteína AR foram determinados por Western blotting utilizando GAPDH como um controlo de carga. MiR-101 expressões foram determinadas por qPCR. ** P . 0,01

contra

DMSO

AR inibe a autofagia induzida por Celastrol através da regulação da

miR-101

em células de câncer de próstata

em seguida, determinou-se AR regula negativamente a autofagia induzida por Celastrol através da inibição da expressão de miR-101 em células de câncer de próstata. MiR-101 mímico foi usado para aumentar o nível de miR-101 em células LNCaP. Com o miR-101 sobre-regulação por adição de miR-101 mímico (Figura 5A, superior), autofagia nível basal foi inibida (razão LC3-II /LC3-I diminuiu para metade) (Figura 5A, parte inferior). Embora a redução AR por Celastrol foi favorável para a indução autofagia, além de miR-101 mímico resultou na inibição autofagia como demonstrado pela diminuição meia vezes de LC3-II /LC3-I rácio e aumento do nível de p62 (Figura 5A, parte inferior). Em células DU145, expressão estável de AR exógena poderia regular a expressão de miR-101 e podem suprimir a autofagia desencadeada por Celastrol. Quando o miR-101 foi inibida pela adição do inibidor de miR-101, conforme determinado por qPCR (figura 5B, parte superior), autofagia foi resgatado independentemente da sobre-expressão de AR (Figura 5B, parte inferior). Estes dados sugerem que a AR papel negativo desempenhado na regulação da autofagia depende de seus alvos a jusante. Além disso, um par de miR-101 construções de expressão, pGL3-B-miR-101-W que contém o tipo selvagem são, e pGL3-B-miR-101-M que tem mutantes são foram gerados. pGL3-B-miR-101-W aumentou significativamente a expressão de miR-101 que pGL3-B-miR-101-M em co-transfecção com AR exógeno em células DU145 com ou sem tratamento Celastrol (Figura 5C). De acordo com os níveis de miR-101, co-transfeco com pGL3-B-miR-101-W, que pode ser transactivado por AR mostrou supressão mais em autofagia ao nível basal ou induzida Celastrol comparação com pGL3-B-miR-101 H que não podia ser reconhecida por AR (Figura 5C), indicando que a AR inibe a autofagia induzida por Celastrol através de transactivação de miR-101.

Para ver se o miR-101 poderia afectar supressão de AR em autofagia induzida por Celastrol, células LNCaP positivas AR foram transfectadas com miR-101 controlo mímica ou negativo (CN) durante 24 h (a), seguido por tratamento de 24 h adicionais com Celastrol (2,0 uM, CEL). níveis de miR-101 foram determinados por RT-PCR. #,

P Art 0,05

contra

NC transfecção sem treament Celastrol. **,

P Art 0,01 entre miR-101 e NC transfecções com o tratamento Celastrol. Os níveis de proteína p62 e de LC3, bem como AR foram determinados por Western blotting utilizando GAPDH como um controlo de carga. B, células DU145 negativas AR foram transfectadas com pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) ou vector vazio (EGFP-V) na presença de miR-101 inibidor (miR-101 INH) ou um controlo negativo (CN). As células foram incubadas em Celastrol (2,0 uM, CEL) por um adicional de 24 h. níveis de miR-101 foram determinados por RT-PCR. #,

P Art 0,05

contra

EGFP-V mais transfections NC. *,

P

0,05 entre EGFP-V e EGFP-AR na presença de miR-101 inibidor. Os níveis de proteína de AR, p62 LC3and foram detectados por Western blotting. C, células DU145 foram transfectadas com pGL3-B-miR-101-W (com o local de ligação de tipo selvagem AR) ou pGL3-B-miR-101-H (com o local de ligação AR mutante), juntamente com o vector de expressão de AR (EGFP- AR) ou vector vazio (EGFP-V), durante 24 h, em seguida, tratada com DMSO ou Celastrol (CEL, 2.0 uM) durante mais 24 h. níveis de miR-101 foram determinados por RT-PCR. #,

P Art 0,05

contra

EGFP-V mais transfections pGL3-B-miR-101-M. *,

P

0,05 entre pGL3-B-miR-101-M e transfecções pGL3-B-miR-101-W. Os níveis de proteína de AR, LC3 e p62 foram detectados por transferência de Western utilizando GAPDH como um controlo de carga.

AR modula miR-101 expressão sem afectar a morte celular

Uma vez que a redução AR também resulta na viabilidade celular reduzida, se a supressão e autofagia indução de miR-101 foram observadas devido a morte celular foi determinada. As células LNCaP foram tratados com MDV3100 antagonista de AR (enzalutamida) para diferentes tempos. Como esperado, a proteína AR foi diminuída (Fig 6A).