Abstract

proteína de dedo de zinco 217 (ZNF217) é essencial para a proliferação celular e tem sido implicada na tumorigénese. No entanto, a sua expressão e exatos papéis em câncer colorretal (CRC) permanecem obscuros. Neste estudo, demonstramos que ZNF217 expressão foi aberrante regulada nos tecidos CRC e associados com pior sobrevida global de pacientes com CCR. Além disso, descobrimos que ZNF217 era um alvo putativa de microRNA (MIR) -203 utilizando análise bioinformática e confirmou que o uso de ensaio de repórter luciferase. Além disso, em knockdown vitro de ZNF217 ou expressão forçada de miR-203 a proliferação de células atenuadas CRC, invasão e migração. Além disso, o tratamento combinado de ZNF217 siARN e miR-203 exibiram efeitos inibidores sinérgicos. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem novas evidências que ZNF217 tem um papel oncogênico no CRC e é regulado pelo miR-203, e abrem a possibilidade de ZNF217- e terapia miR-203-alvo de CRC

Citation.: Li Z, Du G, Dong Z, Yang Y, Zhang X, Wang L, et ai. (2015) miR-203 Suprime ZNF217 regulação alta no câncer colorretal e seu Oncogenicidade. PLoS ONE 10 (1): e0116170. doi: 10.1371 /journal.pone.0116170

Editor do Academic: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 25 Setembro, 2014; Aceito: 03 de dezembro de 2014; Publicação: 26 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. o projecto foi apoiado pelos China ciência projectos Nacionais naturais da Fundação (Grant No. 81072406, 81271916, 31270971 e 81301506), Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado de Educação Superior da China ( Grant No. 20120131110055), ea Província de Shandong Natural Science Foundation (Grant No. ZR2010HZ004). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o segundo e terceiro tumor maligno mais comum em fêmeas e machos, respectivamente, em todo o mundo, com mais de 1,2 milhões de novos casos e cerca de 608,700 mortes só em 2008 [1]. Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e tratamento do CRC, o prognóstico para pacientes com CCR continua pobre [2]. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas abordagens terapêuticas para CRC. Para conseguir isso, uma compreensão mais profunda das redes moleculares e genéticos que controlam a iniciação e progressão da CRC é imperativo.

ZNF217 gene é um oncogene recém-clonado no 20

th. Ele localiza no 20q13.2 e codifica um fator de transcrição cromossomo Kruppel-like do zinco família de proteínas dedo [3]. ZNF217 proteína contém 8 Kruppel previu-C2H2, como motivos de dedo de zinco e uma região rica em prolina [4]. Um número cada vez maior de estudos têm mostrado que os membros da família de proteínas de dedo de zinco desempenhar papéis importantes no desenvolvimento de uma variedade de cancros [5]. Muitas pesquisas têm provado que copiam aumento número de 20q13.2 cromossoma está associada a metástase do CRC [6] e ZNF217 é regulada no cancro do cólon como medido pela seção microdis captura a laser e multiplex quantitativa PCR em tempo real [7].

MicroRNAs (miRNAs) são não-codificante, 18 a 24 nucleótidos, ARN de cadeia simples de comprimento que têm a capacidade de regular negativamente a expressão de genes envolvidos em vários processos celulares, incluindo a proliferação celular, a apoptose, a migração, invasão e estresse resposta [8, 9, 10, 11, 12]. Tem sido demonstrado que os padrões de expressão anormais de miARN estão presentes em muitos carcinomas humanos [13] e está relacionado com a patogénese, a progressão e a história natural de vários tipos de cancro [11, 14]. Dados recentes sugerem que miARN pode funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumores e desempenham papéis críticos no desenvolvimento do cancro [15]. Um estudo apresenta evidências de que ZNFs são reguladas ao nível pós-transcricional no cancro da mama por miR-181.º, que visa diretamente as regiões codificantes de ZNFs [4].

Neste estudo, usando algoritmos de bioinformática e ensaio de repórter luciferase , verificou-se que ZNF217 é um alvo de miR-203, um supressor de tumor miARN. Para explorar os potenciais papéis de ZNF217 como um novo biomarcador de prognóstico para CRC e sua regulação pelo miR-203 miRNA em tecidos CRC e emparelhado tecidos colorretais normais, foram realizados experimentos in vitro e confirmou que 1) ZNF217 pode promover a proliferação, invasão e migração de linhas e células CRC 2) ZNF217, bem como seus efeitos em linhas celulares de CRC são reprimidos por miR-203, na esperança de elucidar o mecanismo de desenvolvimento CRC e proporcionar novas descobertas para o tratamento alvo de CRC.

Materiais e métodos

as amostras de tecido

Um total de 82 pacientes com CCR submetidos à ressecção cirúrgica de tumores para CRC entre julho de 2004 e março de 2009 no Departamento de Cirurgia Geral, Qilu Hospital da Universidade de Shandong, Jinan, China, foram recrutados para este estudo. Todos os dados dos pacientes foram obtidas dos registros clínicos e patológicos, incluindo idade, sexo, tamanho do tumor, diferenciação, localização, profundidade de invasão e metástase, assim como tumor-nódulo-metástase fase (TNM). O estadiamento patológico pós-operatório de cada sujeito foi determinada de acordo com a 7ª edição da União de Controle do Câncer Internacional (UICC) sistema tumor-nódulo-metástase (TNM) para CRC. Os tecidos de tumor ressecado e tecidos emparelhados não cancerosos adjacentes (pelo menos, 5 cm de distância da margem do tumor) foram imediatamente removidos, congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Nenhum paciente recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Qilu Hospital, Universidade de Shandong Ética e consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes inscritos.

coloração imuno-histoquímica e avaliação para ZNF217

A imuno-histoquímica (IHQ) foi usado para detectar ZNF217 expressão em tecidos CRC embebidos em parafina. HCC tecidos embebidos em parafina e foram cortadas secções de 5 | iM de forno a 65 ° C durante 2 h, e desparafinadas utilizando procedimentos padrão. Após a recuperação de antigénios e lavagem com tampão Tris, foi aplicado ZNF217 anticorpo primário (Biossíntese Biotecnologia CO, LTD, Beijing, China) para lâminas e expressão de ZNF217 foi avaliada por incubação com um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase (Zhongshan Goldenbridge Biotecnologia, Pequim , China) seguindo as orientações do fabricante.

ZNF217 coloração foi avaliada sob um microscópio de luz por dois investigadores independentes que desconheciam os resultados clínicos. A coloração foi considerada positiva para ZNF217 quando uma forte correlação era evidente no citoplasma. Os tecidos foram classificados semi-quantitativamente por contagem do citoplasma positivo de 10 campos separados a 400 x de ampliação nas áreas com a maior densidade de citoplasma positivo. A pontuação de corte apropriado foi obtido através de análise de curva ROC (ROC) plotados tomando as pontuações percentuais do tumor ou tecido não tumoral adjacente como variáveis ​​independentes. A pontuação mais próximo de ambos máxima sensibilidade e especificidade, [isto é, o ponto (0.0,1.0) sobre a curva] foi seleccionado como o ponto de corte. As amostras com pontuação coloração acima ou abaixo da nota de corte foi classificada como positiva ou negativa, respectivamente.

Cultura de células e transfecção

linhas celulares de CRC (HT-29, SW480 e SW620) e humana linha de células 293T de rim embrionário (HEK) foram adquiridos a partir do Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e a linha celular HCT116 foi adquirido a partir de Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia celular (China). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM; hialina, UT) contendo soro de bovino fetal a 10% (Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C numa incubadora suplementado com 5% de CO

2.

a transfecção foi realizada com reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. A concentração final de 50 nM miRNA, 100 nM (siRNA) e seus respectivos controles negativos foram usados ​​para cada transfecção.

Previsão de miRNAs candidatos e repórter luciferase ensaio

Os dois mais generalizada e web algoritmos baseados em bioinformática (TargetScan e micrornaorg) foram utilizados para prever miARNs candidatos que visam a sequência de nucleótidos da região 3 ‘não traduzida (UTR) do mRNA ZNF217. Para verificar a sua eficácia, um ensaio de repórter de luciferase foi realizada utilizando os vetores PMIR-REPORTTM (RiboBio, Guangzhou, China) contendo tipo selvagem (WT) -ZNF217 3′-UTR sequência ou mutante (MUT) – sequência ZNF217 3′-UTR . células HEK293T foram transitoriamente cotransfectadas com miR-203 imita /miR-controle negativo e WT-ZNF217 3′-UTR vector /MUT ZNF217 3’-UTR. actividades de luciferase foram medidas utilizando a luciferase Dual-kit de ensaio (Promega, Madison, WI), 48 h após a transfecção de acordo com as instruções do fabricante.

em tempo real de RT-PCR e Western blot

total o ARN foi extraído utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as manipulações do ARN foram realizadas sob condições isentas de RNase. A concentração de RNA foi medida utilizando um BioPhotometer mais (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) a 260 nm, e o ARN isolado foi armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Para a análise da expressão de ARNm ZNF217. Um total de 1 de ARN ug foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando o kit de SuperScript (Toyobo, Osaka, Japão) e as análises foram realizadas utilizando SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japão) e um ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (qRT-PCR Applied Biosystems , Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. nível de mRNA ZNF217 foi normalizada para p-actina e as mudanças vezes na expressão de mRNA ZNF217 foram quantificados usando o

-ΔΔCT método de quantificação 2 relativo. Os iniciadores utilizados para RT-qPCR de ZNF217 foram para a frente, 5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3 ‘e reverso, 5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3’. Todos os primers acima eram de BioSune, Shanghai, China.

Para a expressão de miR-203, cDNA foi sintetizado utilizando iniciadores específicos do gene (Ribobio, Guangzhou, China) eo kit M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) numa reacção de 20-ul. Os reagentes de reacção de RT continham 1 ug molde de ARN, 1 uL de mistura de dNTP 10 mM, 2 ul de DTT 0,1 M, 4 uL 5 x tampão de primeira cadeia, e 1 ul de 40 U /ul de inibidor de RNase. O volume foi ajustado com H 2 O isenta de ARN. A reacção de transcrição reversa foi realizada em triplicado para remover quaisquer valores aberrantes. MiR-203 de expressão foi avaliada utilizando qRT-PCR e um ABI Prism 7500 Sequence Detection System As alterações vezes na expressão de miARN foram determinadas utilizando o 2

-ΔΔCT método; a expressão foi normalizada para o nivel de expressão U6 small nuclear RNA. Os iniciadores utilizados para RT-qPCR de miR-203 foram miR-203 directo 5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3 ‘, 5′-U6 frente CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ e o iniciador inverso 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC universal-3 ‘.

As proteínas totais foram extraídos a partir de células em cultura usando tampão RIPA contendo PMSF e quantificada usando o kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, Haimen, China). Um total de 30 ug de proteínas foram submetidas a SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF. Após o bloqueamento, a membrana foi incubada com anticorpo de ratinho anti-ZNF217 monoclonal (Abcam, Southampton, Reino Unido) ou rato anticorpo monoclonal anti-β actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), seguida de incubação com conjugado com HRP secundário anticorpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Os sinais foram determinados por um kit de detecção por quimioluminescência (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi medida com um ensaio de metil-thiazolyltetrazolium (MTT). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10 placas

3 /cavidade em 96 cavidades. Após cultura durante 24, 48, 72, 96 e 120 h, as células foram incubadas com 20 uL de MTT (5 mg /mL) durante 4 h a 37 ° C. Os cristais formados nas células foram volatilizados por incubação com 150 ul de dimetilsulfóxido durante 10 min à temperatura ambiente e quantificado por medição da densidade óptica a 490 nm utilizando um leitor de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (Tecan, Suíça).

invasão celular e migração ensaio

os potenciais invasivas e migratórias das células foram avaliadas por meio transpoço inserções com poros de 8 mm (Corning). Para o ensaio de invasão, 24 h após a transfecção, 3,0 x 10

5 células em meio livre de soro foram adicionados à inserção superior pré-revestidos com matriz Matrigel. 500 uL meio com FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Após incubação durante 48 h, as células não-invasoras foram removidos a partir da superfície superior da membrana Transwell com uma mecha de algodão, e as células invadidas sobre a superfície da membrana inferior foram fixadas em metanol, coradas com 0,1% de violeta cristal, fotografadas e contadas . ensaio de migração celular foi realizada usando procedimentos semelhantes, excepto que 2 × 10

5 células foram adicionados em pastilhas não-revestidos. As células em seis campos aleatórios a 200 x de ampliação para cada inserção foram contadas. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Análise estatística

O teste t de Student foi utilizado para analisar as diferenças na expressão ZNF217 entre o tumor e tecidos normais. As correlações entre a expressão ZNF217 e características clinicopatológicas foram analisados ​​através de um teste não paramétrico: teste de Mann-Whitney U e entre dois grupos de teste de Kruskal-Wallis para três ou mais grupos. O χ2 e exato de Fisher foram realizados para determinar as associações entre a expressão ZNF217 e os parâmetros clínico. curva de sobrevida global foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças de sobrevivência de subgrupos de pacientes foram comparadas pelo teste de log-rank. análise multivariada de regressão de Cox foi realizada para estimar os fatores prognósticos independentes para a previsão de sobrevivência. A correlação entre ZNF217 e miR-203 foi determinada por análises de correlação de Pearson. As análises estatísticas e gráficos foram conduzidos usando SPSS versão 17.0, Microsoft Excel e software GraphPad Prism. P 0,05 foi considerado como diferença significativa.

Resultados

ZNF217 expressão está correlacionada com características clinicopatológicas de CRC

análise IHC de 82 casos de CRC e seus correspondentes tecidos não cancerosos mostrou que positiva coloração para ZNF217 foi observada no citoplasma das células de CRC e correspondentes células de mucosa não cancerosos (Fig. 1a). Os percentuais médios de células coradas positivo para ZNF217 na mucosa não canceroso canceroso e correspondentes foram 76,3% e 38,9%, respectivamente. Ao comparar a percentagem de células positivas, foi determinado que ZNF217 expressão em carcinoma colorrectal era estatisticamente maior do que na mucosa não cancerosos adjacentes (P 0,001; Fig. 1B).

(A-esquerda ) coloração do citoplasma ZNF217 em células de CRC. (A-direita) Falta de expressão ZNF217 em células epiteliais do cólon normais. (B) A percentagem de células coradas positivamente em cancro e tecidos normais adjacentes (* P 0,05, ** 0,01). Análise (C) de Kaplan-Meier da sobrevivência global em pacientes de CRC de acordo com ZNF217 nível de expressão. O grupo positivo ZNF217 (n = 55) apresentaram sobrevida significativamente menor em comparação com o grupo negativo (n = 27; P = 0,0405: teste log-rank).

A análise de correlação revelaram que ZNF217 expressão era positivamente correlacionada com o tamanho do tumor, a profundidade de invasão, e nó de linfa, (P 0,05), mas não com a idade do paciente, sexo, grau histológico, e metástases distantes (P 0,05; Tabela 1). Além disso, teste de Kaplan-Meier mostrou que pacientes com coloração ZNF217 positiva tiveram sobrevida menor do que aqueles com coloração ZNF217 negativo (P = 0,028; A Fig. 1C).

Redução da ZNF217 expressão reprime a proliferação de células CRC, a migração e invasão

Para medir as propriedades biológicas de ZNF217 em células BF, testou-se a proliferação e a motilidade das células de CRC sob a condição de knockdown siRNA mediada ZNF217 de gene. Em primeiro lugar, examinou-se o nível de expressão ZNF217 num painel de linhas celulares de CRC, incluindo HCT-116, HT-29, SW620 e SW480. Os resultados mostraram que ZNF217 nível de expressão foi a mais elevada em células SW480 e o menor em células HT29 entre todas as linhas celulares testadas (Fig. 2a). Com base neste padrão de expressão, que, por conseguinte, chosed SW480 para estudos posteriores. Nós transitoriamente expressão modulada ZNF217 por transfecção de siRNA em células SW480 e descobriram que mediada por siARN ZNF217 silenciamento diminuição da proliferação celular (Fig. 2B) e a migração celular e invasão capacidade diminuída (Fig. 2C). Tomadas em conjunto, as nossas observações indicaram que ZNF217 poderia promover a proliferação, a migração e a invasão de células de CRC

(B) Redução da expressão ZNF217 por transfecção de siRNA-ZNF217 inibiu significativamente a proliferação (* P 0,05). E (C ) migração e invasão de células SW480 (200 × ampliação, * P 0,05) em comparação com controlos parentais e negativos

ZNF217 foram directamente visados ​​pelo miR-203

Usando. bases de dados on-line de predição miARN alvo (microrna.org e TargetScan), verificou-se que era ZNF217 um alvo potencial de miR-203 (Fig. 3A). Para verificar esta descoberta, construímos repórteres de luciferase de WT e Mut 3′-UTR de ZNF217 e realizou ensaio de actividade luciferase em células HEK293T. Os resultados mostraram que a transfecção de miR-203 mimetiza inibe significativamente a expressão de WT mas não Mut 3’UTR do ZNF217 em células HEK293T (Fig. 3B). Consistente com estes resultados, a transfecção de miR-203 imita diminuiu a expressão endógena de ZNF217 em ambos os níveis de proteína em células SW480 (Fig. 3C e 3D) e ARNm. Além disso, no painel analisados ​​de 30 pacientes de CRC, observou-se uma correlação inversa entre ZNF217 e miR-203 de expressão em tecidos de CRC e seus tecidos adjacentes normais (Figura 4E, r = 0,792, P .; 0,01; Fig. 3E). Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que o miR-203 regula negativamente a expressão ZNF217 via que visam directamente a sua sequência 3′-UTR.

(A) As sequências de ligação putativos miR-203 em ZNF217 3′-UTR. ensaio (B) A actividade da luciferase foi realizado para as células HEK293T co-transfectadas com vectores contendo REPORTTM PMIR-WT-ZNF217 3′-UTR ou sequências 3′-UTR MUT-ZNF217 e miR-203 imita. Os dados são apresentados como a mudança de dobragem normalizada em actividade de luciferase. (C, D) de ARNm e proteína ZNF217 foram determinados em células SW480 transfectadas com miR-203 imita ou controlo de miR-negativa por qRT-PCR e transferência de Western, respectivamente. (E) correlação inversa entre a expressão do mRNA ZNF217 and-203 miR níveis em tecido CRC foi analisada utilizando análise de correlação de Pearson.

(A) A expressão ectópica de miR-203 por transfecção de miR-203 imita significativamente reduzida proliferação de células SW480, em comparação com os controlos parentais e negativas (* P 0,05). (C) A expressão ectópica de miR-203 inibiu a migração de células, nomeadamente e invasão de células SW480 (200 × ampliação, * P 0,05). Inversamente, a inibição da expressão de miR-203 por transfecção de inibidores de miR-203 simultaneamente (B) a proliferação promovida (* P 0,05) e (D) migração e invasão de células SW480, em comparação com os controlos parentais e negativos (200 × ampliação, * P 0,05). Figura é um representante de 3 experimentos com resultados semelhantes.

Efeito do miR-203 na proliferação de células CRC, migração e invasão

Para validar se o miR-203 poderia regular a proliferação de células CRC , foi realizado um ensaio de proliferação em células SW480 transfectadas com miR-203 imita ou o seu controlo negativo, e descobriu que a expressão aumentada de miR-203 proliferação significativamente inibido, (Fig. 4A), a motilidade (Fig. 4B), bem como a invasão SW480 de células. Inversamente, a regulação negativa de miR-203 em células SW480 transfectadas inibidores aparentemente promoveu a proliferação, motilidade e invasão de células SW480 (Fig. 4C).

A sobre-expressão de miR-203 reforça parcialmente induzida ZNF217 proliferação, migração e invasão do CRC células

Para explorar ainda mais ZNF217 efeitos mediados por tumorigênicos são regulados pelo miR-203, que co-transf SW480 células com ZNF217 siRNA em combinação com miR-203 imita. Nós observados efeitos inibidores sinérgicos em ZNF217 expressão (Fig. 5A), bem como a proliferação (Fig. 5B), a migração e invasão (Fig. 5C) de células SW480 co-transfectadas com ZNF217 siRNA e miR-203 imita em comparação com células SW480 transfectadas com ZNF217 siRNA ou miR-203 imita sozinho. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que as funções de ZNF217 como um oncogene potente são regulados por miR-203.

(A) ZNF217 supressão efectiva da expressão da proteína por ZNF217 siARN e miR-203, respectivamente, e imita combinadamente. Note-se que a expressão ZNF217 é mais eficiente suprimida pelo tratamento combinado. Supressão de ZNF217 simultaneamente resultou em (B) inibição significativa do crescimento celular e (C) migração e invasão (200 x de ampliação) de células SW480, em comparação com os controlos negativos. Observe o efeito inibitório sinérgica de combinação de ZNF217 siRNA e miR-203 imita, em comparação com qualquer um deles sozinho (* P 0,05)

Discussão

ZNF217 é um recentemente. membro identificado da família de proteínas de dedo de zinco. Ele funciona principalmente como um fator de regulação da transcrição envolvendo na regulação da ocorrência do tumor e desenvolvimento [16]. ZNF217 possui vários diversos domínios estruturais, incluindo oito C2H2 dedo de zinco motivos de ligação de ADN, bem como um domínio rico em prolina (16-20%) localizado nos resíduos 757-1,005. Prolinerich domínios têm sido mostrados para funcionar como activadores transcricionais em muitos genes, tais como CTF /[3] NF-1. gene ZNF217 tem sido extensivamente estudado no cancro da mama [4, 17], câncer de ovário [18, 19, 20], carcinoma de esôfago de células escamosas [21], câncer gástrico [22, 23, 24] e câncer de próstata [25, 26] , mas não no CRC. Além disso, o aumento do número de cópias do cromossoma 20q13.2 foi encontrado para ser associado com a metástase de CRC. Assim, é especialmente interessante para explorar seus potenciais papéis no desenvolvimento CRC.

No presente estudo, descobrimos que ZNF217 expressão em ambos os níveis de mRNA e proteína foi significativamente maior nos tecidos do tumor colorretal do que na sua correspondência não tecidos tumorais e sua sobre-expressão foi associada com características clínico-patológicas malignas e curta sobrevida dos pacientes de CRC, indicando que ZNF217 funciona como um oncogene em CRC.

a maioria dos pacientes com câncer são morreu de complicações decorrentes da metástase. Portanto, tendo como alvo doenças metastáticas é uma estratégia anti-câncer fundamental. Muitos estudos têm revelado que as proteínas de dedo de zinco que desempenham papéis cruciais nos processos de invasão tumoral e metástase incluindo ZNF217 pode ser regulada por uma variedade de genes [27, 28]. No presente estudo, descobrimos que knockdown de ZNF217 por siRNA levou à redução da proliferação, invasão e migração de células CRC in vitro. Estes resultados revelam as características oncogênicos de ZNF217 em CRC. Na verdade, tem sido relatado que células tumorais HO-8910, LNCaP e DU145 [26], bem como tecidos de cancro da mama [4] construtivamente expressar elevado nível de ZNF217. Krig et al relataram que mis-regulação de E-caderina e genes alvo ZNF217 ainda não caracterizadas [29] pode ser responsável pelas alterações na imortalização celular, a resistência à apoptose, a resistência aos agentes quimioterapêuticos, e fosforilação de Akt em células com nível de ZNF217 alta expressão . Apesar de centenas de genes são alvos potenciais de ZNF217 e locais de ligação de consenso têm sido propostas, os genes específicos que regulam ZNF217 expressão são pouco conhecidas.

Acumulando evidências indicam que a expressão aberrante de miRNAs está ligada ao desenvolvimento de CRC [ ,,,0],30, 31, 32]. abordagens sofisticadas baseadas em computador para identificação de miRNA e previsão alvo, bem como técnicas de validação para confirmar essas previsões têm contribuído grandemente para a descoberta de novos miRNAs e sua caracterização funcional. Consequentemente, pequena molécula desregulação mediada pelo miRNA surge como uma potencial nova abordagem terapêutica para doenças humanas, incluindo câncer [33]. Entre miRNAs relacionadas ao câncer humanos, miR-203 tem atraído a atenção significativa porque é expresso de forma aberrante em uma variedade de cânceres. Em nosso estudo, foram identificados para que o miR-203 foi marcadamente regulada no CRC humana e restauração da expressão de miR-203 pode inibir a proliferação, invasão e migração de células SW480. Pelo contrário, a transfecção de miR-203 inibidor estimulou a proliferação, invasão e migração de células SW480. Estes achados sugerem que miR-203 está envolvido nos processos de metástase do CRC e estão de acordo com os estudos anteriores que mostram que miR-203 foram expressas na inferior ao nível normal em alguns tipos de câncer [34, 35, 36, 37]. No entanto, o miR-203 foram relatadas para exercer uma função de oncogene em cancros da bexiga e rim [38] e adenocarcinoma pancreático [39]. As discrepâncias no miR-203 funções em diferentes tipos de câncer pode refletir as diferenças de contexto celular ou genes, alternativamente, direcionados.

O estudo atual fornece várias linhas de evidências de que ZNF217 é um novo alvo de miR-203 e sua interacção antagónica desempenha um papel importante no desenvolvimento de CRC. Em primeiro lugar, o ensaio de repórter de luciferase demonstraram que a actividade da luciferase sob o controlo do ZNF217 3’UTR pode ser regulada por miR-203. Em segundo lugar, foi observada uma correlação inversa entre ZNF217 e os níveis de miR-203 em tecidos de CRC. Em terceiro lugar, a sobre-expressão de miR-203 suprimiram ZNF217 níveis e levou a uma redução da proliferação celular, migração e invasão em linhas celulares de CRC.

Em resumo, neste estudo demonstrou-se que ZNF217 é frequentemente sobre-regulada em CRC e um oncogene potencial para o desenvolvimento de CRC. Enquanto isso, a nossa investigação descrita ZNF217 /miR-203 ligação e forneceu um mecanismo potencial para ZNF217 desregulação e contribuição para a invasão de células de CRC. Estes resultados abrem a possibilidade de aplicar miR-203 em direção a tratamentos CRC clínicos.

Reconhecimentos

Os autores são gratos a Shao-Feng Yan (Departamento de Neurocirurgia, Hospital Qilu, Universidade de Shandong, Jinan , China) para fornecer o siRNA-ZNF217 os autores também desejam agradecer Chao Wang por sua orientação técnica de Shandong Hospital Provincial.