Sumário
Nós aqui avaliada a atividade anti-cancro colorectal potencial por erastin, um canal de ânion dependentes de voltagem (VDAC) liga�o ao composto. Nosso
in vitro
estudos mostraram que erastin exerceu efeitos citotóxicos potentes contra várias linhas celulares de cancro colorrectal humanos, possivelmente através de indução de estresse oxidativo e apoptose celular dependente de 9 caspase. Além disso, poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) de abertura foi observado em células cancerosas tratadas com erastin, o que foi evidenciado pela VDAC-1 e ciclofilina-D (CYP-D) de associação, a despolarização mitocondrial, e liberação do citocromo C. inibidores de caspase, o eliminador de ROS MnTBAP, e bloqueadores de MPTP (sanglifehrin A, ciclosporina A e ácido bongkrékico), bem como knockdown shRNA-mediada de VDAC-1, todos os citotoxicidade induzida por erastin significativamente atenuada e a apoptose em células de cancro colorrectal. Por outro lado, a sobre-expressão de um VDAC-produção aumentada induzida por erastin ROS, PTPm abertura, e a apoptose de células de cancro colorrectal.
In vivo
estudos mostraram que a injeção intra-peritoneal de erastin doses bem tolerada HT-29 de crescimento de xenotransplante drasticamente inibida em grave imunodeficiência combinada ratos (SCID). Juntos, estes resultados demonstram que erastin é citotóxico e pró-apoptótica de células de cancro colorrectal. Erastin pode ser investigado como um agente anti-cancro colorectal romance
Citation:. Huo H, Zhou Z, Qin J, Liu W, Wang B, Gu Y (2016) Erastin Disrupts mitocondrial Transição de Permeabilidade Pore (PTPm ) e induz a apoptose morte de células de cancro colorrectal. PLoS ONE 11 (5): e0154605. doi: 10.1371 /journal.pone.0154605
editor: Cong Cao, Universidade de Suzhou, China
Recebido: 23 Março, 2016; Aceito: 16 de abril de 2016; Publicado: 12 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Huo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação Ciência do Hospital do Povo Nona filiados a Shanghai Jiao Tong-University School of Medicine (No. 2.015.521, a YG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é o principal contribuinte da mortalidade relacionada com o cancro, tanto na China [1] e em todo o mundo [2,3]. Estima-se que mais de 100.000 novos casos de cancro colorectal são diagnosticados a cada ano, o que causa mais de 50.000 mortes por ano [4]. A quimioterapia tem sido amplamente utilizada para o tratamento de cancro colo-rectal, no entanto, resistência a medicamentos e /ou toxicidade para fora do alvo limitar a eficiência de quimio-drogas actuais [5,6,7]. Assim, o nosso grupo [8,9] e outros [10,11] têm vindo a apostar no desenvolvimento de novos e agentes anti-cancro colorectal mais eficientes.
Mitocondrial poro de transição de permeabilidade (PTPm) é um multi- complexo canal de proteína encontra-se nas mitocôndrias, cuja principal função é a de manter o equilíbrio da cadeia respiratória mitocondrial [12]. PTPm é composto principalmente de três proteínas: incluindo dependente da voltagem do canal de aniões (VDAC) na membrana mitocondrial para fora (OMM), adenina nucleótidos translocador 1 (ANT-1) na membrana mitocondrial interna (IMM) e matriz localização ciclofilina-D ( CYP-D) [12]. Tem sido mostrado que vários estímulos irá induzir ANT-1 e CYP-D associação e PTPm abertura, conduzindo assim a espécies de oxigénio reactivas (ROS) de produção, depleção de ATP e a molécula de pró-apoptótica (
i
.
e
. citocromo c) liberação [12,13]. Depois disso, caspases (principalmente caspase-9) e apoptose celular serão ativados [12,13].
Estudos recentes identificaram um primeiro-in-class molécula pequena, ou seja, erastin de ligação VDAC [14,15] . Tem sido demonstrado que erastin é selectivamente citotóxicos para certas linhas celulares de cancro [14,15,16,17]. Por exemplo, Yagoda et ai., Mostrou que se liga a erastin VDAC, resultando em danos oxidativos letal para as células cancerosas [18]. O papel potencial de erastin em células de cancro colorectal, e os mecanismos de sinalização subjacentes não foram estudados. No presente estudo, mostramos que erastin foi citotóxico e pró-apoptótica para células de câncer colorretal, possivelmente através de interromper PTPm.
Materiais e Métodos
2.1. Cultura celular
como descrito [8,9], linhas celulares de cancro colorrectal, incluindo HT-29, DLD-1 e células Caco-2, foram adquiridos a partir do banco de células da Academia Chinesa de Ciências (CAS) Xangai Biológica Institute (Xangai, China). As células foram mantidas em FBS contendo meio RPMI /DMEM. linha de células epiteliais do cólon NCM460 humano foi fornecido pelo centro celular Fudan IBS (Xangai, China). As células foram cultivadas em meio F12 nutriente de Ham (Gibco) [19].
2,2. Reagentes e produtos químicos
Erastin foi comprado de Selleck (Xangai, China). Os bloqueadores de MPTP incluindo sanglifehrin A, ciclosporina A e ido bongkruico foram adquiridos a Sigma (Xangai, China). O anti-oxidante MnTBAP também era da Sigma. A caspase-3 inibidor específico Z-DEVD-FMK e o inibidor específico Z-LEHD-fmk da caspase-9 foram adquiridos a partir de Calbiochem (Darmstadt, Alemanha). Todos os anticorpos utilizados neste estudo foram obtidos de Santa Cruz Biotech (Xangai, China).
2.3. ensaio de viabilidade celular
A sobrevivência das células MTT foi medida pelo ensaio de 3- [4,5-dimethylthylthiazol-2-il] -2,5- difeniltetrazólio (MTT, Sigma) [9]. Diferentes densidades de semeadura foram otimizadas no início dos experimentos.
2.4. Trypan azul coloração ensaio
ensaio azul
Trypan foi descrito em nossos estudos anteriores [9]. Resumidamente, após tratamento aplicado erastin, o número de células mortas (azul de tripano) foram contadas positivos. A proporção de mortalidade (%) foi calculada pelo número de células coradas com azul de tripano dividido pelo número total de células.
2,5. Colónia ensaio de formação de
Seguindo o tratamento erastin, as células (2 x 10
3) foram inicialmente suspensas em meio de cultura com 0,25% de agar (Sigma). A suspensão de células foi, em seguida, com revestimento no topo de um meio de ágar pré-solidificado 0,25% numa placa de cultura de 100 mm. O meio foi substituído em cada dois dias. Após 10 dias de incubação, as colónias de sobrevivência estavam manchados e manualmente contados.
2.6. Ensaio de incorporação de BrdU
Células (3 x 10
3 por poço) foram semeadas em placas de 96 poços, após o tratamento aplicado, a proliferação celular foi avaliada através da incorporação de BrdU ELISA ensaio colorimétrico (Roche, Indianapolis, IN ) com o protocolo do fabricante. O valor ELISA OD do grupo de tratamento foi normalizado ao do grupo controle sem tratamento.
2.7. Ensaio de apoptose celular por meio de coloração de anexina V
após o tratamento, a apoptose das células foi detectada pelo ensaio de Anexina V FACS como relatado anteriormente [9]. O número de células coradas com Anexina V foi gravado.
2,8. A quantificação da apoptose por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)
como descrito [8,9], a apoptose celular ELISA Kit de Detecção Plus (Roche, Palo Alto, CA) foi utilizado para quantificar a apoptose de células de acordo com a protocolo do fabricante.
2.9. a actividade da caspase ensaio
Após o tratamento, as proteínas citosólicas foram extraídas em tampão descrito [8,9]. Vinte ug de extractos citossólicos por amostra foram adicionados ao tampão de ensaio de caspase com substratos de caspase-3 /-8 /-9 (Roche, Xangai, China). A libertação de 7-amido-4- (trif luorometil) cumarina (AFC) foi quantificada através de um sistema de Fluoroskan definido para um valor de excitação de 355 nm, [8,9]. Os resultados foram expressos como unidades de fluorescência relativa /ug de proteína.
2,10. Western Blotting
Resumidamente, as aliquotas de 30 ug de proteínas de lisados de cada amostra foram separados por 10% SDS a electroforese em gel de poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com anticorpo secundário durante uma hora à temperatura ambiente. O parafuso foi visualizada por ECL (reforçada quimiluminescência) máquina. Cada banda foi quantificada através do software ImageJ, eo valor foi normalizado para cada banda de controlo de carga.
2.11. espécies reactivas de oxigénio (ROS) de detecção
intracelular ROS foi medida por citometria de fluxo através de ensaio de oxidação de dichlorofluorescin (DCF). DCFH-DA entra passivamente nas células e é clivada por esterases celulares não específicas e oxidado na presença de ROS. Após o tratamento, as células (3 x 10
5 por amostra) foram incubadas com a DCFH-DA (5 ^ M) durante uma hora a 37 ° C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e mantidas em 1 mL de PBS, ROS fluorescência foi analisada utilizando o sistema de Fluoroskan acima.
2.12. Detecção de redução potencial mitocondrial (ΔΨ
m)
Como descrito [20], o ΔΨ
m foi medida através de JC-10 corante fluorescente. Quando o potencial mitocondrial está a diminuir, monomérico JC-10 vai formar no citosol, o qual exibe fluorescência verde [20]. Resumidamente, após tratamento erastin aplicados, as células foram coradas com 5 ug /ml de JC-10 (Invitrogen) durante 10 min, e detectado imediatamente no Fluoroskan um sistema ajustado para um valor de excitação de 485 nm [20].
2.13. imunoprecipitação mitocondrial (MITO-IP)
As células foram tripsinizadas, e fracções mitocondriais foram preparadas por meio de um Kit de mitocôndrias /Citosol Fraccionamento (BioVision, Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante. Duzentos ng de lisados celulares a partir de fracções mitocondriais foram pré-limpo com 20 ul de proteína A /G PLUS-agarose (Santa Cruz) durante 1 hora. O sobrenadante foi então rodado durante a noite com 0,25 ug de anticorpos anti-ant-1 (Santa Cruz Biotech). A seguir, os lisados foram centrifugados durante 5 min a 4 ° C em um micro-centrifugadora para remover os agregados não específicos. A proteína A /G PLUS-agarose (35 uL) foi então adicionado aos sobrenadantes durante 4 horas a 4 ° C. As peletes foram lavadas seis vezes com PBS, ressuspensas em tampão de lise, e, em seguida, ensaiadas por Western blotting [20].
2.14. knockdown estável de VDAC-1 por lentivírus shRNA
Os dois conjuntos de VDAC-1 hairpin RNAs curtos embalados por lentivírus (shRNA-1 e shRNA-2, sequências não sobrepostas) foram concebidos, sintetizados e verificada por Genechem (Xangai, China). Dez ul /ml de partículas lentivirais foram adicionados a células HT-29 durante 12 horas. Em seguida, o meio contendo lentivírus foi substituído por meio completo e as células foram cultivadas durante mais 24 horas. Em seguida, foi adicionada puromicina (5,0 ug /ml, Sigma) para seleccionar colónias resistentes estavelmente durante 2-3 semanas. Expressão de VDAC-1 foi detectada por transferência Western. As células de controlo foram tratados com corrida non-sense shRNA partículas lentivirais (Santa Cruz Biotech).
2.15 Over-expressão de VDAC-1 e de forma estável células selecção
O full-length humana VDAC-1 cDNA, comprado de Genechem (Xangai, China), foi sub-clonado em pSUPER-puro-bandeira (um presente de laboratório do Dr. Bi) [21]. O vector vazio (pSUPER-puro-flag) ou VDAC-1 construção que expressa foi transfectado em células HT-29 através de Lipofectamine 2000 protocolo (Invitrogen). Os clones estavelmente foram seleccionados através de puromicina (5 ug /ml). Após 12-14 dias de selecção, de forma estável células foram submetidas a ensaio de transferência de Western de um VDAC-expressão.
2.16.
In vivo
eficácia antitumoral avaliação
estudos de crescimento do tumor foram realizadas em severa modelo de ratos imunodeficientes xenotransplante combinada (SCID). Todos os ratos foram adquiridos no Biotério da Shanghai Jiao Tong-University School of Medicine (Xangai, China). Resumidamente, 2 × 10
6 viáveis células HT-29 em 100 uL de meio de crescimento (por ratinho) foram inoculadas por via subcutânea, e ratinhos portadores de ~ 100 mm
3 tumores foram aleatoriamente divididos em três grupos com 10 ratos por grupo . Os ratinhos foram tratados diariamente com 10 ou 30 mg /kg de peso corporal de erastin (injecção intraperitoneal, durante 4 semanas) ou controlo de veículo (solução salina). Os volumes dos tumores foram calculados pela fórmula modificada elipsóide: (π /6) × AB
2, em que A é a mais longa e B é o eixo perpendicular menor da massa tumoral, [22,23]. Ratos pesos corporais também foram registados semanalmente. endpoints humanas sempre foram utilizados para minimizar os ratos sofrimento. os animais foram observados em bases diárias. Sinais como locomoção significativa reduzido, diarreia grave, piloereção grave ou de uma súbita perda de peso ( 20%) foram registrados. Se os animais atingirem estes pontos de extremidade foram sacrificados por sangria sob anestesia com 2,2,2-tribromoetanol (4 mg /10 g de peso corporal, Sigma). Todas as injecções foram realizadas pelo método de anestesia 2,2,2-tribromoetanol. Os estudos com animais foram aprovados pela Shanghai Jiao Tong-University School of comissão Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e Ética da Medicina (Contato: Dr. Jun Wang, 2.014.126).
2,17. A análise estatística
Todos os dados foram normalizados para os valores de controlo de cada ensaio e foram apresentados como média ± desvio padrão (SD). Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguido pelo teste F de Scheffe um usando o SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). A significância foi escolhido como p 0,05.
Resultados
3.1. Erastin exerce citotóxica, mas não efeitos citostáticos para células de câncer colorretal cultivadas
Para testar a atividade de erastin na sobrevivência de células de câncer colorretal, células HT-29 foram tratadas com concentrações crescentes de erastin (0,1-30 mM). ensaio de MTT foi realizado. Como mostrado na Fig 1A, erastin inibiu potentemente a sobrevivência de células HT-29, o que foi evidenciado pela redução do MTT OD. Erastin mostrou um efeito dependente da dose (Figura 1A), e 30 uM de erastin exibido o efeito mais dramático (Fig 1A). Erastin levou pelo menos 48 horas para exercer efeito citotóxico significativo no HT-29 células (Fig 1A). O efeito citotóxico por erastin também foi demonstrada pelo ensaio de coloração com azul de tripano (Fig 1B) e o ensaio de formação de colónias (Figura 1C). Erastin tratamento (1-30 pM) aumentou significativamente o número de células positivas de azul de tripano HT-29 (Figura 1B) ( “morto”), passando o tempo de sobrevivência diminuindo HT-29 colónias (Fig 1C).
Cancro colorectal células (HT-29, DLD-1 e células Caco-2 linhas) de células epiteliais do cólon ou NCM460 foram tratados com o controlo de veículo (0,1% de DMSO, “Ctrl”) ou concentrações indicadas de erastin de tempo aplicada, a sobrevivência das células foi testada por um ensaio MTT (A e e) e o ensaio de formação de colónias (C); A percentagem de azul de tripano positiva (células “mortas”) foi registada (B); A proliferação celular foi testada pelo ensaio de incorporação de BrdU (D e F). Para cada ensaio, n = 5. Os dados apresentados foram média ± DP. As experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes obtidos. * P 0,05 vs grupo de “Ctrl”.
Curiosamente, erastin (1-30 uM) apareceu ineficazes na inibição da proliferação de células HT-29, e a incorporação de BrdU não foi alterado em células HT-29 após erastin citotóxico (1-30 uM) de tratamento (Figura 1D). Portanto, o efeito citotóxico por erastin é improvável devido a inibição da proliferação. MTT resulta na Fig 1E mostrou que erastin (1-30 M) também foi citotóxico para duas outras linhas celulares de cancro colorectal: DLD-1 e Caco2. No entanto, mesmo tratamento erastin foi geralmente segura para as células epiteliais do cólon não-cancerosas NCM460 (Figura 1E). Mais uma vez, a incorporação de BrdU, o indicador de proliferação de células, não foi afectada pela erastin (10 pM) nas células DLD-1 e Caco2, nem em NCM460 células epiteliais (Figura 1F). Com base nestes resultados, mostramos que erastin exerce citotóxica, mas não citostático, a atividade de células de câncer colorretal em cultura.
3.2. Erastin induz a produção de ROS e apoptose dependente da caspase em células de câncer colorretal cultivadas
Em seguida, foi avaliada a atividade potencial do erastin na apoptose celular. Tal como descrito nos nossos estudos anteriores [8,9], foram realizados vários ensaios de apoptose. Os resultados do ensaio de caspase mostraram que a actividade de caspase-3 e caspae-9 estava significativamente aumentada em células HT-29 após erastin citotóxico (1-30 uM) de tratamento (Figura 2A), indicando a activação da via da apoptose mitocondrial [24]. Por outro lado, a actividade de caspase-8, um indicador da activação da via apoptótica extrínseca [25,26], manteve-se inalterada em células de HT-29 tratadas com erastin (Fig 2A). activação de apoptose celular por erastin também foi confirmado pelo ensaio de Anexina V FACS (Fig 2B) e ADN de histona apoptose ensaio ELISA (Fig 2C). dose-dependente Erastin aumento percentual anexina V e histona DNA ELISA OD em células HT-29 (Fig 2B e 2C).
células de câncer colorretal (HT-29, DLD-1 e Caco-2 linhas) ou NCM460 As células epiteliais do cólon foram tratados com o controlo de veículo (0,1% de DMSO, “Ctrl”) ou concentrações indicadas para tempo erastin aplicada, a apoptose das células foi examinada por ensaios listados (AC, G e H); produção de ROS foi também examinada (D e I). As células HT-29 foram pré-tratadas com z-DEVD-FMK ( “zDEVD”, 50 uM), Z-LEHD-fmk ( “zLEHD”, 50 uM) ou MnTBAP (10 uM) durante 1 hora antes de ser aplicada erastin estimulação , a sobrevivência das células e a morte das células foram testados por ensaio MTT (e) e ensaio de azul de tripano (F), respectivamente. Para cada ensaio, n = 5. Os dados apresentados foram média ± DP. As experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes obtidos. * P 0,05 vs. grupo de “Ctrl”.
# p 0,05 vs. grupo de erastin única (E e F).
Desde erastin é um composto de ligação VDAC, o que pode perturbar cadeia respiratória mitocondrial e causar a produção de ROS [18]. Nós próxima testou o nível de estresse oxidativo em células HT-29 tratado com erastin. Os resultados na figura 2D demonstra claramente que erastin aumentou o nível de ROS nas células HT-29. Para estudar o papel da apoptose e produção de ROS em citotoxicidade induzida por erastin, foram aplicados diversos inibidores farmacológicos. Como mostrado na Fig 2E e 2F, a caspase-3 inibidor específico Z-DEVD-FMK, o inibidor específico Z-LEHD-fmk da caspase-9, ou o captador de superóxido MnTBAP [27] toda a citotoxicidade induzida por erastin aliviados em HT-29 células (Figura 2E e 2F). Em duas outras linhas celulares de cancro colorrectal, erastin (10 uM) também induziu a caspase-9 (Figura 2G) e apoptose de activação (Figura 2H), bem como a produção de ROS (Fig 2I). Tais efeitos por erastin novamente não foram observadas em células epiteliais do cólon NCM460 (Figura 2G-2i). Portanto, erastin induz a produção de ROS e apoptose dependente da caspase em células de cancro colorrectal.
3.3. Erastin induz abertura PTPm em células de câncer colorretal cultivadas
Desde erastin é um composto VDAC de ligação [18], o estatuto de PTPm em células de câncer colorretal tratados com erastin foi então avaliada. Em primeiro lugar, a imunoprecipitação mitocondrial ensaio (Mito-IP) [28,29] demonstraram que a ANT-1 e CYP-D formou um complexo em células HT-29 tratadas com erastin (Figura 3A), que é conhecido como a etapa inicial de abertura do PTPm [12,13]. Em segundo lugar, o nível de citosol do citocromo C foi também aumentado em células HT-29 após o tratamento erastin (Fig 3B), que é um evento conhecido após a abertura do PTPm [12,13]. Além disso, o aumento de JC-10 intensidade de fluorescência verde indicou perda de potencial mitocondrial (ΔΨm) (Fig 3C). Todos estes resultados indicam claramente que a abertura do PTPm após o tratamento erastin em células HT-29. Note-se que resultados semelhantes por erastin também foram obtidos em outras duas linhas celulares de cancro colorrectal (dados não mostrados).
HT-29 células foram tratadas com erastin aplicada por tempo indicado, a abertura PTPm foi evidenciado por VDAC-1 mitocondrial 1 -ant-associação (A), citocromo C ( “cito-C”) de libertação (B) e de JC-10 aumento da intensidade (C). Células HT-29 foram pré-tratados com sanglifehrin A (SFA, 2,5 uM), a ciclosporina A (CsA, 0,5 uM) ou ácido bongkrékico (BA, 5 uM) antes de erastin (10 uM) de tratamento, a sobrevivência das células (D) e apoptose (E) foram analisados posteriormente. Células HT-29 que expressam estavelmente VDAC-1 shRNA-1 /-2 ou controlo precipitação shRNA ( “SCR shRNA”) foram tratados com erastin (10 uM), uma expressão VDAC-(F), a sobrevivência da célula (L) e a apoptose ( H) foram testados. ANT-1-assocaited Cyp-D (A), citosol expressão do citocromo C (B) e VDAC-1 expressão (F) foram quantificadas. Para cada ensaio, n = 4. Os dados apresentados foram média ± DP. As experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes obtidos. * P 0,05 vs. grupo de “Ctrl”.
# p 0,05 vs grupo de erastin única (D e E) ou o grupo “SCR shRNA” (G e H). “Trans” significa controle de transfecção (FH).
Para estudar o papel da PTPm na citotoxicidade causada-erastin, aplicamos vários bloqueadores conhecidos farmacológicas MPTP, incluindo sanglifehrin A (SFA) [30], ciclosporina A (CsA) [31] e ácido bongkrékico (BA) [28,32]. Tal como demonstrado, o pré-tratamento com estes bloqueadores MPTP atenuou significativamente HT-29 da morte celular induzida por erastin (Figura 3D) e apoptose (Figura 3E). Para suportar ainda mais a nossa hipótese, a estratégia shRNA foi aplicado para selectivamente e de forma estável knockdown VDAC-1, o principal componente do PTPm e proteína de ligação de erastin [12]. Dois estavelmente HT-29 linhas que expressam distinta VDAC-1 shRNAs (-1 /-2) foram estabelecidos (Fig 3F). Importante, a citotoxicidade induzida por erastin (Figura 3G) e apoptose (Fig 3H) foram significativamente inibidas em células HT-29 VDAC-1-silenciados. Estas evidências farmacológicas e genéticos sugerem que a citotoxicidade induzida por erastin contra células de câncer colorretal requer VDAC-1 vinculativas e posterior abertura PTPm.
3.4. VDAC-1 sobre-expressão potencia do erastin citotoxicidade
Para apoiar ainda mais o papel fundamental da VDAC-1 em citotoxicidade induzida por erastin, nós exogenamente expressa VDAC-1 em células HT-29. Ocidentais blotting resultados na Figura 4A confirmada VDAC-1 sobre-expressão estavelmente em células HT-29 com VDAC-1 construto. Como resultado, a redução da viabilidade induzida por erastin (Figura 4B) e a apoptose (Fig 4C) foram aumentadas. Outros estudos mostraram que a sobre-expressão de VDAC-1 facilitada a produção de ROS induzidas por erastin (Fig 4D) e JC-10 aumento OD (o indicador de abertura PTPm, Figura 4E). Curiosamente, mostrámos que NCM460 células epiteliais do cólon expresso baixo nível de VDAC-1 (Figura 4F). No entanto, quando sobre-expresso VDAC-1 em células NCM460 (FIG 4F), tornou-se essas células vulneráveis a erastin (Figura 4G). Portanto, estes resultados confirmam ainda que VDAC-1 é um factor determinante da actividade do erastin.
estavelmente células HT-29 ou células epiteliais do cólon NCM460 expressando vector vazio (pSUPER-puro “, Vec”) ou VDAC-1 ADNc ( “VDAC-1”) foram tratados com erastin concebido para o período de aplicada, VDAC-1 expressão, a sobrevivência celular e apoptose foram testados por ensaio Western blot (a e F), o ensaio de MTT (B e L) e ADN histona ensaio ELISA (C), respectivamente; produção de ROS (D) e de JC-10 intensidade (E) também foram analisadas. Para cada ensaio, n = 4. Os dados apresentados foram média ± DP. As experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes obtidos. VDAC-1 foi quantificada a expressão (F) * p 0,05 vs grupo de células “Ctrl” Vec (B-E).
# p 0,05 vs grupo erastin de células “Vec” (B-E). “Trans” significa controle de transfecção (D e E).
3.5. administração Erastin suprime HT-29 de crescimento de xenotransplante em SCID camundongos
O
in vivo
atividade por erastin também foi testado. ratinhos SCID HT-29 de modelo de xenoenxerto foi aplicado. Os semanais de crescimento do tumor resulta da curva na Fig 5A demonstraram que a injecção intraperitoneal erastin drasticamente inibida HT-29 de crescimento de xenoenxertos em murganhos SCID. Erastin do
in vivo
atividade foi novamente dependente da concentração. Erastin a 30 mg /kg foi claramente mais potente do que 10 mg /kg na supressão HT-29 xenoenxertos (Fig 5A). Deve notar-se que o peso corporal nos ratinhos não foi significativamente diferente entre cada grupo (Fig 5B). Nem nós notar qualquer sinal de aparentes toxicidades nesses camundongos. Estes resultados indicaram que estes animais foram bem tolerados para os regimes erastin aqui. Além disso, o crescimento do tumor por dia, calculado como mm
3 /dia, foi diminuída com a administração erastin (Figura 5C). No final das experiências, os pesos de xenoenxertos administrado-erastin também foram muito mais baixas do que a de ratos de controlo do veículo (Fig 5D). Estes resultados mostraram que a administração erastin inibe o crescimento HT-29 tumor
in vivo
.
HT-29 com tumor SCID foram intraperitonealmente administrada com erastin (10/30 mg /kg de peso corporal ou ” BW “, diariamente, durante 4 semanas) ou controlo de veículo (solução salina), os volumes dos tumores (a) e os pesos corporais ratinhos (B) foram registados semanalmente durante cinco semanas; crescimento diário do tumor também foi calculado (C). No fim das experiências, todos os xenoenxertos foram isolados e ponderado (D). Para cada ensaio, n = 10. Os dados apresentados foram média ± DP. As experiências foram repetidas duas vezes com resultados semelhantes obtidos. * P 0,05 vs. grupo de “veículo”.
# p 0,05 vs. grupo de erastin a 10 mg /kg de peso corporal.
Discussão
No presente estudo, demonstramos que erastin exerceu efeito citotóxico potente contra várias células de câncer colorretal humanos possivelmente através de indução de estresse oxidativo e caspase-9 apoptose celular dependente. abertura PTPm foi observado em células cancerosas tratadas com erastin, o que foi evidenciado pela VDAC-1 e associação CYP-D, despolarização e liberação de citocromo mitocondrial C. inibidores de caspase, o eliminador de ROS MnTBAP, e bloqueadores de MPTP (sanglifehrin A, ciclosporina A e ácido bongkrékico), bem como knockdown shRNA-mediada de VDAC-1, todos os citotoxicidade induzida por erastin significativamente atenuada e a apoptose em células de cancro colorrectal. Por outro lado, a sobre-expressão de VDAC1 potenciou a citotoxicidade do erastin. Com base nestes resultados, nós propomos que se liga a erastin VDAC1 para interromper a função mitocondrial normal, causando a abertura PTPm, e, eventualmente, conduzindo à activação da apoptose dependente da caspase-9-em células de cancro colorrectal.
Deve notar-se que erastin não foi citotóxico para as células epiteliais do cólon NCM460. Nós também não conseguiu detectar qualquer caspase-9 activação nem PTPm disfunção significativa em células NCM460 tratados com erastin. Uma razão possível poderia ser que estas células epiteliais não-cancerosas expressam níveis muito baixos de VDAC (-1), por conseguinte, as células não foram alvejadas por erastin (ver Figura 4). Por uma questão de facto, quando sobre-expresso exogenamente VDAC-1 em células NCM460, estas células, como células cancerosas, tornou-se vulnerável a erastin (ver Figura 4). Outra possibilidade é que as células cancerosas são todas as células de crescimento rápido, que possivelmente exigem elevado nível de cadeia respiratória mitocondrial para produzir ATP. Estas células podem ser mais sensíveis ao VDAC ou perturbação PTPm. O fato de que erastin tem como alvo apenas as células cancerosas indica que poderia ser um candidato ideal para o tratamento anti-cancro.
Apesar de vários estudos têm investigado o potencial atividade anti-cancro por erastin
in vitro
[ ,,,0],14,16,33], o
in vivo
evidências ainda estão faltando. No presente estudo, mostrou que a injecção intraperitoneal de doses em erastin bem tolerada (10 ou 30 mg /kg, diariamente) HT-29 de crescimento de xenoenxerto drasticamente inibida em ratinhos SCID. Importante, o
in vivo
erastin regimes não afetou pesos ratos, nem induzir quaisquer toxicidades significativas para os animais experimentais. Estes resultados pré-clínicos sugerem que erastin poderia ser um agente anti-cancro colorectal promissor.
Conclusões
Em resumo, erastin perturba PTPm e induz a morte apoptótica de células de câncer colorretal. Erastin pode ser investigado como um agente anti-cancro colorectal romance.