Abstract

fibroblastos associados ao câncer (FAC) são relatados para apoiar tumorigênese, estimulando a angiogênese, a proliferação de células cancerígenas e invasão em a maioria dos tumores sólidos. No entanto, os papéis da FAC no microambiente câncer de fígado não foram minuciosamente estudados. No nosso estudo anterior, isolado com sucesso FAC de carcinoma hepatocelular (HCC) (H-FAC) e mostrou-se que H-FAC suprimiu a activação de células NK e, deste modo criado condições favoráveis ​​para a progressão do carcinoma hepatocelular. Em nosso estudo, descobrimos que a proliferação de células MHCC97L e Hep3B foi significativamente promovida por tratamento com meio condicionado de H-FAC. análise patológica também revelou que H-FAC aumentou a proporção de Ki-67 células malignas (+) e os impediu de sofrer necrose. Além disso, a concentração de factor de crescimento de hepatócitos (HGF) citocina no meio condicionado de H-FAC foi maior do que o meio condicionado a partir de fibroblastos de pele normal (NSFs). Anti-HGF diminuiu significativamente a capacidade de promover a proliferação de H-FAC. Além disso, verificou-se que a abundância de H-FAC correlacionou positivamente com o tamanho do tumor. Estes resultados indicam que H-FAC são um fator importante para promover o crescimento do HCC

in vitro

e

in vivo

, e que HGF desempenha um papel fundamental na proliferação HCC induzida por H-FAC .

Citation: Jia CC, Wang TT, Liu W, Fu BS, Hua X, Wang GY, et al. (2013) Cancer-Associated fibroblastos de carcinoma hepatocelular promover a proliferação de células malignas por HGF secreção. PLoS ONE 8 (5): e63243. doi: 10.1371 /journal.pone.0063243

editor: Canção Guo Zheng, University of Southern California, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de novembro de 2012; Aceito: 01 de abril de 2013; Publicado em: 07 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por: Estado 973 Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2009CB522404), National Natural Science Foundation da China (NSFC-30972914, 81000936, 81172036, 81170451, 81170452), 985 Projetos (82.000-3.281.901), fundos de pesquisa fundamental para a Central universidades (10ykpy05), Projetos chave Estado sobre doenças infecciosas da China (2012ZX10002016-023, 2012ZX10002010-001-007), National Science Foundation Natural da província de Guangdong (10151008901000208), bem como projeto-chave de Ciências Médicas em Sun Yat-sen University ( 10YKJC03). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a influência marcante do estroma tumoral sobre o crescimento de células cancerosas malignas tem sido demonstrada e investigado com entusiasmo nesta era da terapia-alvo [1], [2]. Como um dos principais componentes do estroma tumoral, cada vez mais evidências tem mostrado que os fibroblastos associados ao cancro (FAC) são um modificador significativa da evolução do cancro [3], e que promovem a tumorigénese [4], a progressão [5], invasão [6] e chemoresistance [7] das células cancerosas por vários mecanismos. Isto é especialmente verdadeiro para o carcinoma hepatocelular (HCC) [8], [9], porque a maioria dos casos de HCC pode derivar de cirrose no fígado [10]. FAC são principalmente resistentes à quimioterapia e a radioterapia devido a uma pequena proporção de células que proliferam em contraste com as células malignas [11], o que torna FAC uma fonte potencial de progressão tumoral e recidiva [12]. A terapia direcionada a FAC tem mostrado eficácia anti-câncer promissor [6], o que reforçou ainda mais a necessidade de estudar a relação entre FAC e seus hospedeiros [13].

No entanto, pouco se sabe sobre as FAC em HCC (H-FAC). H-FAC foram isolados e caracterizados no nosso estudo anterior [8], que foi comparável ao estudo de Antonio [9] Mazzocca. Descobrimos que H-FAC células NK educados para adquirir um fenótipo desactivado e criar uma condição sem resposta em tumores [8]. Além disso, o estudo de Antonio [9] Mazzocca indicaram que o ácido lisofosfat�ico (LPA) acelera a progressão HCC através do recrutamento de fibroblastos peri-tumorais (PTFs) e promovendo a sua transdiferenciação em miofibroblastos. No entanto, esse estudo não determinou o impacto da FAC em células de câncer de fígado in vitro. O papel de H-FAC em HCC é desconhecido. Mais estudos são necessários para se obter a vista completa da conversa cruzada entre H-FAC e HCC no hospedeiro.

FAC são pensados ​​para ser activado, o qual é caracterizado pela expressão de actina do músculo liso α-(α -SMA), proteína de activação de fibroblastos (FAP), a proteína de superfície de fibroblastos (FSP), e vimentina [1] – [3]. Isto concede ativação FAC múltiplas funções na promoção do desenvolvimento do câncer, tais como facilitar a angiogênese, a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [14], chemoresistance [5], [7], disfunção do sistema imune local [6], [8], e ainda mais fundamentalmente, a proliferação de células malignas [1] – [3]. No entanto, a chave mecanismo molecular e via de sinal funcional envolvido nestes processos biológicos são mal compreendidos e longe de ser totalmente investigado.

No presente estudo, procurou-se elucidar o papel de H-FAC na promoção da proliferação celular HCC e o mecanismo subjacente.

Materiais e Métodos

pacientes e elegibilidade

Nós investigamos uma série consecutiva de 43 pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma hepatocelular, que foram admitidos para o Terceiro Affiliated Hospital de Sun Yat-sen University (Guangzhou, China) a partir de novembro de 2008 a agosto de 2011. os pacientes foram incluídos com os seguintes critérios de inclusão: (a) patologicamente confirmado como HCC, (b) age≥18, (c) tratados com a excisão radical para HCC, (d) a disponibilidade de dados de CT para a morfologia do tumor, (e) a falta de terapia antineoplásica, como quimioembolização transcatheter arterial (TACE), sorafenib, quimioterapia e radioterapia antes da cirurgia. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Terceiro Affiliated Hospital da Universidade Sun Yat-sen, Guangzhou, China. Um consentimento informado foi obtido de todos os pacientes no momento da admissão. Os espécimes embebidos em parafina e dados clínicos foram obtidos para cada paciente.

Isolamento de fibroblastos primários de espécimes HCC

amostras de tumor foram obtidas de doentes com HCC, amostras de fígado normais foram obtidas a partir de pacientes hemangioma hepático e as amostras prepúcio foram obtidos a partir de dadores saudáveis, da Terceira Affiliated Hospital de Sun Yat-sen University. O diagnóstico de HCC em todos os pacientes que foram submetidos a hepatolobectomy foi confirmada por testes patológicos e clínicos. As amostras foram anonimamente codificado em conformidade com as diretrizes éticas locais (como estipulado na Declaração de Helsinki) e consentimento informado por escrito foi obtido de pacientes e voluntários saudáveis. O trabalho foi realizado em estrita conformidade com o projeto de estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Hospital Terceiro Affiliated da Universidade Sun Yat-sen, em Guangzhou, China.

H-FAC foram isolados a partir da região cancerosa e fibroblastos não cancerosos (NFS) incluía três tipos de fibroblastos: fibroblastos peritumoral (PTFs) retiradas do tecido, pelo menos, 2 cm distal à margem externa da massa cancro, fibroblastos derivados de hemangioma benigno hepática como fibroblastos normais do fígado (NLFs) e fibroblastos obtidos a partir de prepúcio como fibroblastos de pele normal (NSFs). Os tecidos foram picadas e digerido no Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco-BRL, Grand Island, NY), 1 mg /mL de colagenase tipo I ( Sigma, St. Louis, MO) e 100 U /ml de hialuronidase (Sigma, St. Louis, MO) a 37 ° C durante 6 a 8 horas, lavadas duas vezes com PBS (Sigma, St. Louis, MO) e centrifugada a 450 g durante 8 minutos de cada vez. Foram finalmente ressuspensos em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 UI /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e depois cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 ambiente. tripsinização diferencial foi aplicada durante a sub-cultura para seleccionar o crescimento de fibroblastos. A percentagem de fibroblastos purificado foi de 95% após 2-3 passagens, a qual foi determinada por imunofluorescência, transferência de Western e citometria de fluxo utilizando anticorpos contra vimentina, citoqueratina, FAP, e α-SMA. Experiências subsequentes foram realizadas utilizando estas células dentro de 3-10 passagens.

Células e cultura de células

A linha de células de carcinoma hepatocelular Hep3B (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foi cultivada em Meio Essencial mínimo (MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado com penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml) e 10% de FBS. células MHCC-97L (97L; Instituto do cancro do fígado, Hospital Zhongshan, Universidade Fudan, de Xangai, China) foram mantidas em Dulbecco modificado por Eagle Medium (DMEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado com penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml), L-glutamina (300 ug /ml) e 10% de FBS. LO2 células (obtidas a partir de nosso laboratório armazenamento) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY) suplementado com penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml) e 10% de FBS. Todas as células foram passadas a uma razão de 1:4 a cada 4-5 dias.

Recolha de meio condicionado e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA)

Para a recolha do meio condicionado destas fibroblastos, células fibroblásticas foram plaqueadas em 75 cm

2 frascos, lavadas duas vezes com PBS 4 dias mais tarde, e incubadas durante 48 horas com DMEM isento de soro. Em seguida, o sobrenadante foi colhido, centrifugado a 3000 rpm durante 5 minutos, passados ​​através de um sistema de filtração Millipore 50 ml estéril com um polyvinylidenedifluoride membrana de 0,45 um e armazenada num frigorífico a -80 ° C para uso posterior.

Para medir citocinas solúveis no meio condicionado, 2 × 10

5 fibroblastos foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 24 horas, e o meio condicionado foi recolhido por ELISA. O mesmo método foi utilizado para se obter meio condicionado a partir de células LO2. Os níveis de factor de estroma humano derivado de células 1 (SDF-1), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), factor de crescimento transformante-beta (TGF-β) e factor de crescimento epidérmico (EGF) foram determinadas utilizando kits de ELISA humanas (R ; D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante.

imunotransferência

a proteína total foi extraído usando tampão RIPA depois os poços foram lavados, pelo menos, 3 vezes com tampão PBS. As proteínas foram separadas por 12% SDS-PAGE, imunotransf com um anticorpo contra α-SMA (Abcam, Cambridge, MA), FAP (Abcam, Cambridge, MA), vimentina (Abcam, Cambridge, MA) e β-actina (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) e depois visualizadas com o sistema de quimioluminescência aumentada (GE, Buckinghamshire, Reino Unido).

imunofluorescência (IF)

as células foram fixadas em metanol gelado (pelo 4 ° C durante 15 minutos), lavadas com PBS, bloqueadas com 3% de BSA, e incubadas com anticorpos primários durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram imunocoradas para α-SMA, FAP, vimentina, FSP (Sigma, St. Louis, MO) e citoqueratina (Dako, Carpinteria, CA). Os anticorpos secundários eram de cabra Alexa Fluor 488 de ratinho anti-IgG (H + L) e Alexa Fluor 546 IgG de cabra anti-ratinho (H + L) (Molecular Probes, Grand Island, NY). Os núcleos foram corados com Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO). As imagens foram vistas sob um microscópio de fluorescência (Leica DMI 4000B, Solms, Alemanha) e foram analisados ​​por software suíte de aplicativos Leica (versão 4.0).

Imunohistoquímica

Os tecidos foram fixados em 4% paraformaldeído (PFA; Sigma, St. Louis, MO), embebidos em parafina e cortada em secções de 4 um de espessura. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada, a recuperação de antigénio foi realizada, e as lâminas foram coradas com anticorpos primários contra Ki-67 (Abcam, Cambridge, MA), α-SMA e CD31 (Abcam, Cambridge, MA), que foram utilizados nas diluições indicado pelo fabricante. Reacções imunológicas foram detectados pela Envision HRP Sistema Dako Cytomation-(Dako, Glostrup, Dinamarca), e as secções foram contrastadas com hematoxilina (Sigma, St. Louis, MO). Os controlos negativos só foram coradas com o anticorpo secundário.

H-FAC foram identificados por α-SMA imunorreactividade. A população de H-FAC foi classificada em padrões de alta intensidade ou baixa intensidade de coloração de acordo com critérios previamente descritos [14].

A proliferação celular ensaio

células de carcinoma hepatocelular (células 97L) foram semeadas numa densidade de 2 × 10

3 células, em triplicado, numa placa de 96 poços (Corning Life Sciences, Lowell, MA). adicionou-se meio condicionado contendo FBS a 10% a partir das amostras de fibroblastos ou a partir de células LO2 e trocado por 4 a 5 dias, e DMEM suplementado com 10% de FBS foi utilizado como controlo. A proliferação celular foi medida utilizando o Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Rockville, MD) de acordo com o protocolo do fabricante.

In vivo

efeito de H-FAC no crescimento do tumor

Um modelo de xenoenxerto de cancro do fígado foi estabelecida com sucesso para avaliar o efeito de H-FAC no crescimento do tumor no presente estudo. macho de quatro a seis semanas de idade camundongos BALB /c nus foram adquiridos de Wei Tong Li Hua Company (Pequim, China) e mantidos em gaiolas ventiladas pressurizados do Instituto de Pesquisa de Vacinas de Sun Yat-sen University. As células 97L (5 × 10

6) sozinho como controlo ou misturados com qualquer FAC (5 × 10

6) ou NFS (5 × 10

6) foram suspensos em um tubo de 0,5 ml e injectado por via subcutânea (sc) em ratinhos nus. Os tamanhos dos tumores foram medidos com rotineiramente Vernier Compassos a cada 3 dias, e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a seguinte fórmula: π /6 x diâmetro maior x diâmetro menor)

2. Os dados foram apresentados como um gráfico do volume de tumor médio em função do tempo em dias. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Yat-sen University Sun e foram aprovados pelo comitê de ética animal da Affiliated Hospital Terceiro (Permit Number: 0021942).

a análise estatística

os dados foram apresentados como a média ± SEM, e o teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença entre dois grupos.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos. diferenças significativas para os dados contínuos nas características clínicas entre dois grupos (H-FAC alta intensidade vs. H-FAC baixa intensidade) foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney.

Resultados

O isolamento, a cultura e caracterização de H-FAC

H-FAC foram isoladas a partir de tecidos de tumor primário e cultivadas de acordo com os métodos descritos no nosso estudo anterior [8]. H-FAC mostraram expressão de alto nível de α-SMA, FAP, FSP, vimentina e fibronectina de acordo com a análise de imunofluorescência (Fig. 1A), a qual foi confirmada por Western blot (Fig. 1B). Além disso, como a função de chave de H-FAC e fibroblastos activados, expressão α-SMA foi detectada em tecidos de tumor primário, utilizando imuno-histoquímica para confirmar a presença de H-FAC em amostras de tumor. expressão de CD31 foi avaliada para excluir a presença de células endoteliais vasculares, que co-expressa α-SMA e CD31. Os resultados demonstram que a H-FAC foram mais abundantes nos tecidos tumorais em comparação com peri-tumoral e tecido normal do fígado (Fig. 1C).

(A) A expressão de α-SMA, FAP, FSP, vimentina, fibronectina e citoqueratina nos quatro tipos de fibroblastos purificadas cultivadas durante 3-10 passagens foi determinada por coloração imunofluorescente. Todos os quatro tipos de fibroblastos mostrou elevada expressão dos marcadores mesenquimais FSP, vimentina e fibronectina. NLFs, H-FAC, FPT e NLFs exibido expressão elevada de α-SMA, o que sugere que existem estes fibroblastos num estado activado em condições de cultura de células. No entanto, outro FAP activação marca foi altamente expresso em H-FAC e PTFs mas não em NSFs e NLFs. (B) Western blotting mostrou diferenças em α-SMA e expressão FAP entre os quatro fibroblastos. Consistente com os resultados da coloração de imunofluorescência, H-FAC, FPT e NLFs exibido expressão elevada de α-SMA. FAP foi altamente expresso em H-FAC e PTFs mas não em NSFs e NLFs. (C) A distribuição de H-FAC identificados por CD31 α-SMA (+) (-) expressão em cada amostra a partir de regiões normais do fígado maligna, peri-tumoral e foi detectado através de imuno-histoquímica em secções patológicas de série. expressão α-SMA foi detectado para confirmar a presença de H-FAC. Além disso, a expressão de CD31 foi avaliada para excluir a presença de células endoteliais vasculares, que co-expressa α-SMA e CD31. H-FAC foram mais abundantes no tecido do tumor, em comparação com peri-tumoral e tecido hepático normal.

No entanto, PTFs expressa um nível semelhante de α-SMA, FAP, FSP, vimentina e fibronectina a H -CAFs

in vitro

(Fig. 1A), o qual foi adicionalmente confirmada por Western blot (Fig. 1B). NLFs exibida uma expressão significativamente mais baixa do FAP em comparação com H-FAC

In vitro

, e não houve diferença significativa nos outros biomarcadores (Fig. 1A e Fig. 1B). A expressão de α-SMA e FAP foi extremamente baixa em NSFs em contraste com H-FAC, o que foi demonstrado por imunofluorescência e Western blot (Fig. 1A e Fig. 1B).

H-FAC promoveu a proliferação de células de carcinoma hepatocelular tanto

in vivo

e

in vitro

CCK-8 testes demonstraram que a proliferação de células 97L e Hep3B foi significativamente aumentada por tratamento com meio condicionado de NLFs , PTFs e H-FAC em comparação com meio condicionado de NSFs ou o grupo de controle

in vitro

. Estes resultados sugerem que a H-FAC possuem um efeito pró-proliferativa em células de carcinoma hepatocelular (Fig. 2A e Fig. 2B).

(A e B) células 97L (A) e células Hep3B (B) foram cultivadas no meio condicionado de diferentes fibroblastos e a proliferação de células malignas foi ensaiada por análise de CCK-8. NLFs, FPT e H-FAC aumentou significativamente a proliferação celular HCC em relação ao NSFs e o grupo de controlo. (C e D) Um modelo de xenoenxerto /c nu ratinho BALB com base na co-injecção de células de carcinoma hepatocelular com ou sem dois tipos de fibroblastos (NSFs ou H-FAC) foi utilizado para investigar o

In vivo

interacção entre células H-FAC e CHC. Os volumes de tumor dos nodos de tumores gerados pela co-injecção de células de carcinoma hepatocelular e H-FAC foram consistentemente significativamente maior do que aqueles que são formados por células de carcinoma hepatocelular sem co-injecção de H-FAC. NSFs não aumentaram significativamente o crescimento do tumor em relação ao controlo. Além disso, os fibroblastos não gerar tumores quando injectadas isoladamente. (C) as amostras de tumor bruta, no final da experiência são mostrados. Maiores tumores HCC são formadas quando as células de carcinoma hepatocelular são co-injectados com H-FAC (n = 5 por grupo) (D). (*

P Art 0,05; **

P Art 0,01).

Para avaliar a contribuição de H-FAC e NSFs em termos de tumor crescimento

in vivo

, um sistema de xenoenxerto de cancro do fígado foi estabelecida como descrito na secção Métodos. Ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com células de carcinoma hepatocelular, células de fibroblasto, ou com células de fibroblastos e células de carcinoma hepatocelular. O crescimento do tumor registado para um máximo de 28 dias após a injecção das células. a medição do tamanho do tumor mostrou que a implantação de H-FAC ou NSFs puros não resultou na formação de tumores. Além disso, a co-injecção de H-FAC contribuiu para a geração de tumores maiores (HCC + H-FAC

vs

HCC,

P

. 0,05, n = 5) em contraste com a co-injecção de NSFs, que não aumentou a formação de massas de tumor ou crescimento (HCC + NSFs

vs

HCC,

P

. 0,05, n = 5). (Figura 2C e a Fig. 2D).

Além disso, esta capacidade de promoção foi confirmada pela percentagem de células de tumor-Ki-67 positivas em nódulos tumorais. O Ki-67 (+) abundância reflete diretamente a fração crescente de tecidos tumorais. Como esperado, os tumores formados por HCC e H-FAC exibido expressão Ki-67 forte e densa, enquanto os outros dois grupos mostrou moderada e espalhados Ki-67 de coloração (fig. 3A). Curiosamente, uma alta incidência de células Ki-67-positivas foi encontrada em torno de fibroblastos dentro de secções seriadas, particularmente em regiões com necrose massiva, que sugeriu ainda mais o papel de promoção de fibroblastos sobre a sobrevivência de células de tumor (Fig. 3B).

(a) Ki-67 de expressão em células de carcinoma hepatocelular foi substancialmente mais elevada nos nódulos tumorais formados pela co-injecção de células 97L e H-FAC, que estava em contraste com os resultados de tumores formados pela co-injecção de 97L e NSFs ou células 97L sozinho. células (B) Ki-67-positivas eram abundantes α-SMA (+) CD31 próximo (-) fibroblastos dentro de secções de tumor em série. Em amostras que foram imunocoradas com dupla α-SMA (cor vermelha, linha preta) e CD31 (cor castanha, linha vermelha), CD31 não foi expressa em células α-SMA positivos (painel superior). Quando dupla imunocoradas com α-SMA (cor vermelha) e Ki-67 (cor marrom), uma alta incidência de células tumorais com Ki-67 (cor marrom, linha vermelha) foi observada encontrados na vizinhança de H-FAC com α SMA positivo coloração (cor vermelha, linha preta) (painel inferior). (C) A necrose foi massivamente reduzida nos nódulos tumorais gerados pela co-injecção de fibroblastos (+ NSFs ou + H-FAC), em comparação com tumores formados por injecção de células 97L sozinho (controlo). Foi observada expressão (D) α-SMA em todos os xenoenxertos de tumores, incluindo os nódulos tumorais formados sem fibroblastos co-injeção (grupo controle).

Este crescimento nó tumor reforçada pode ser não só reforçada pela proliferação promoção, mas também suportada evitando necrose. A necrose ocorreu nos nódulos tumorais dos três grupos quando o diâmetro do nó aumentada até um certo nível. Curiosamente, regiões necróticas no interior das secções em série foram muito menores nas massas tumorais desenvolvidos com fibroblastos (Fig. 3C). Além disso, as células tumorais remanescentes nas regiões necróticas foram distribuídos em torno de fibroblastos que expressam α-SMA, que indicou fortemente o papel de sobrevivência de fibroblastos de células malignas (Fig. 3B).

Além disso, um fenómeno interessante foi observado em nosso experimento. H-FAC foram também observadas nos gânglios tumor formado por apenas as células de carcinoma hepatocelular, o que sugeriu que as células tumorais podem induzir certas células com origem desconhecida para se transformar em FAC (Fig. 3D).

HGF está envolvida no aumento da proliferação de células de carcinoma hepatocelular

foi altamente indicado que H-FAC pode comunicar-se com células de carcinoma hepatocelular através de modos parácrinos porque H-CAF meio condicionado promoveu a proliferação de células de carcinoma hepatocelular. Portanto, os factores de crescimento e quimiocinas podem ser os principais mediadores fibroblastos através da qual comunicam com as células cancerosas. Medimos os níveis de quatro citoquinas previamente relatados, SDF-1 [15], HGF [16], TGF-β [1], [3] e EGF, no meio condicionado de H-FAC. O teste ELISA mostrou que a concentração de HGF no meio condicionado de H-FAC era o mais elevado entre os quatro tipos de fibroblastos. FPTs também demonstrou um elevado nível de secreção de HGF, com nenhuma diferença significativa em comparação com H-FAC. HGF secretada por NLFs diminuiu significativamente em comparação com H-FAC e apresentou uma tendência decrescente em comparação com PTFs. Além disso, NSFs não segregam HGF. Estes resultados indicam que a secreção de HGF foi correlacionada com o tipo fibroblasto. No entanto, esta tendência semelhante não foi observada nas concentrações de SDF-1, TGF-β ou EGF secretado pelas diferentes fibroblastos (Fig. 4A).

(A) O nível de SDF-1, HGF, TGF-β e EGF no meio condicionado derivado a partir de H-FAC foi determinada por ELISA. H-FAC e PTFs secretado HGF em níveis significativamente mais elevados do que NLFs, enquanto NSFs secretado quase nenhum HGF detectável. No entanto, NSFs secretada um nível mais elevado de SDF1 do que os outros três tipos de fibroblastos. TGF-β e a secreção de EGF foram semelhantes para os quatro tipos de fibroblastos. proliferação (B) celular aumentada após a exposição a diferentes concentrações de HGF, tal como demonstrado por testes de CCK-8. HGF promoveu a proliferação de células CHC em todos os níveis de concentração. (C) O aumento da proliferação de células de carcinoma hepatocelular como mediada por meio de H-CAF condicionado foi significativamente antagonizada por HGF anticorpo neutralizante. Além disso, anti-HGF não interfere com a proliferação das células 97L. (*

P Art 0,05; **

P Art 0,01).

Foi interessante que a tendência da produção de HGF foi consistente com a de crescimento do volume do tumor, o que levou à hipótese de que o HGF teve um papel mediador em proliferação HCC facilitada por H-FAC (Fig. 2D e Fig. 4A). Por conseguinte, o HGF foi analisada com CCK-8 testes para determinar o seu potencial proliferativo. Os resultados foram positivos para todos os grupos em diferentes concentrações de HGF (Fig. 4B). Além disso, anti-HGF foi administrado para antagonizar o efeito de H-CAF meio condicionado de células de carcinoma hepatocelular e reduziu significativamente a proliferação (Fig. 4C). Além disso, o HGF não foi detectada no meio condicionado de células 97L, que exclui o HGF autócrina via estimulante de células CHC. Este achado foi ainda evidenciado pelo facto de que o anti-HGF não interfere com a proliferação das células 97L (Fig. 4C). No entanto, a proliferação não foi completamente eliminada, o que implicava que o HGF não é a única citoquina envolvida no mecanismo molecular da proliferação de células malignas mediada por H-FAC.

HGF H-CAF-secretado induzida a proliferação de células CHC

Além disso, analisou-se o nível de HGF no meio condicionado de H-FAC, hepatócitos normais (LO2) e células de carcinoma hepatocelular (97L) e Hep3B por ELISA para excluir a possibilidade de um mecanismo autócrino de HGF. Os nossos resultados mostram uma grande diferença na secreção de HGF entre H-FAC e células derivadas do fígado, independentemente da natureza maligna. Além disso, o HGF não foi detectada no meio condicionado LO2 (Fig. S1A). Para examinar o papel específico de H-FAC em progressão HCC Além disso, comparou-se a capacidade de promover a proliferação de H-FAC para que LO2 de células. Nossos resultados mostram que H-FAC teve um efeito significativamente mais forte na proliferação HCC do que as células LO2. Todos os nossos resultados sugerem que a proliferação celular HCC não é provocada de um modo autócrino (Fig. S1B). Assim, nossos dados sugerem que a proliferação HCC é promovido de forma parácrina por HGF secretado pela H-FAC.

activação patológica é uma das principais características do H-FAC

Semelhanças foram encontrados em o reforço fenótipo e proliferação entre NLFs, PTFs e H-FAC (Fig. 1A, Fig. 1B, Fig. 2A e Fig 2B) em

in vitro

experimentos, incluindo expressão de α-SMA. No entanto, os fibroblastos derivados de regiões de tecido de tumor, tecido peri-tumoral e tecidos normais do fígado expresso diferentes níveis de α-SMA, o marcador específico para a activação de fibroblastos. Esta inconsistência no resultado pode ser causado pelo fato de que os fibroblastos se transformar a partir de um fenótipo estática, pericyte semelhante a um fenótipo ativado semelhante a miofibroblastos depois de alguns dias de cultura

in vitro

. Em comparação com um estudo anterior, fibroblastos normais foram ativados após 1 semana de cultura

in vitro

, que foi caracterizado por expressão α-SMA (Fig.1A e Fig. 1B). Assim, era lógico supor que PTFs e NLFs eram estáticas em tumores e ativado durante a cultura. Além disso, H-FAC foram relativamente activados em tumores. Consistente com esta hipótese, o presente estudo mostrou que PTFs e NLFs eram “pericyte como”, enquanto H-FAC eram “miofibroblastos como” quando eles foram originalmente isoladas a partir de amostras de tumor (Fig. 5A). Para testar esta hipótese ainda mais, a imunofluorescência foi usada para detectar a expressão α-SMA entre os diferentes tipos de fibroblastos foram incubadas durante 24 horas após o isolamento do tecido original. Como mostrado na Figura 5B, H-FAC foram em uma fase activa, conforme indicado pela expressão α-SMA, enquanto FPT e NLFs apresentou um fenótipo de repouso, como demonstrado por coloração com α-SMA negativo, indicando que a activação patológica pode ser a principal razão para a diferença entre fibroblastos normais e H-FAC.

(a) imagens de microscópio de H-FAC, PTFs e NSFs incubadas por 24 horas. Quando originalmente isolado das amostras tumorais, PTFs e NLFs apresentaram um fenótipo estática, pericyte-like, enquanto H-FAC abrigava um fenótipo ativado semelhante a miofibroblastos. (B) A expressão de α-SMA, FAP, FSP e fibronectina em H-FAC, FPT e NSFs incubadas durante 24 horas foi determinada por coloração de imunofluorescência. α-SMA expressão era consideravelmente maior em H-FAC e relativamente inexistente nos outros tipos de fibroblastos quando analisadas imediatamente após a colheita de amostras tumorais. Esta diferença sugere a natureza patologicamente activado de H-FAC ea natureza relativamente estática dos outros fibroblastos dentro dos tecidos originais.

A presença de H-FAC correlaciona-se positivamente com o tamanho do tumor

Para determinar a importância clínica de H-FAC no contexto do crescimento do tumor, foi investigada a presença de H-FAC nas amostras tumorais obtidas a partir de 43 pacientes por α-SMA imunorreactividade. Os nossos resultados mostram que os vinte e sete amostras de doentes exibiram um elevado nível de coloração por H-FAC, ao passo que as amostras restantes dezasseis apresentados com um baixo nível de coloração por H-FAC (Fig. 6A). Notavelmente, a agregação de H-FAC foi significativamente associado com tamanho maior do tumor (Fig. 6B e Tabela S1), o que sugere uma correlação positiva entre a abundância relativa de H-FAC e o crescimento do tumor no nível clínico.

(A) A abundância de H-FAC foi dicotomizada em dois níveis, de alta densidade e de baixa densidade. (B) Os volumes dos tumores do grupo de alta densidade (n = 27) foram significativamente maiores do que os volumes dos tumores do grupo de baixa densidade (n = 16,

P

= 0,006).

Discussão

o carcinoma hepatocelular (HCC) é a quinta forma mais prevalente de câncer e a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer, respondendo por 90% de todos os casos de cancro primário do fígado. O papel do microambiente do tumor durante a carcinogénese tem sido largamente estudada como um sistema dinâmico orquestrada pelas células inflamatórias, incluindo as células cancerígenas. O microambiente do HCC é composta por fibroblastos, invadir células inflamatórias, células endoteliais (ECs), pericitos adjacentes ao ECS e componentes extensa matriz extracelular (MEC). fibroblastos associados a carcinoma (FAC) são um dos componentes mais importantes do microambiente HCC. No nosso estudo anterior, isolado com sucesso fibroblastos específicos associados a carcinoma de HCC (H-FAC) a partir de tecidos de carcinoma hepatocelular primário e provou que a H-FAC suprimiu a activação de células NK e criado um escudo imunossupressora favorável para as células de carcinoma hepatocelular.