Abstract

O bloqueio do receptor de andrógeno (AR) atividade é o principal objetivo das terapias para o câncer de próstata avançado (APC) . No entanto, a recaída com um mais agressivo, hormônio refratário CaP surge, que abriga restaurado atividade AR. Um mecanismo de tal reactivação ocorre através da aquisição de mutações AR que permitem a sua activação através de várias estruturas de esteróides e não esteróides. Assim, os compostos químicos naturais e que contribuem para a activação inadequada (independente de androgénios) do AR-se uma área de pesquisa intensa. Aqui, demonstramos que a genisteína, um fitoestrogénio soja liga-se tanto a selvagem e o Thr877Ala (T877A) tipos mutantes de AR competitivamente com androgénio, no entanto, exerce um efeito pleiotrópicos sobre a proliferação de células APC e actividade de AR de acordo com o estado mutacional do AR. A genisteína inibiu, de uma forma dependente da dose, a proliferação celular e a localização nuclear RA e expressão em LAPC-4 que têm células AR selvagem. No entanto, em células LNCaP que expressam o mutante T877A AR, genisteína induziu um efeito bifásico em que doses fisiológicas (0,5-5 umol /L) estimulou o crescimento celular e aumento da expressão de AR e a actividade de transcrição, e as doses mais elevadas induzidas efeitos inibitórios. Resultados semelhantes foram alcançados bifásicos em células PC-3 transfectadas com os mutantes Ar; T877A, W741C e H874Y. Estas descobertas sugerem que a genisteína, em concentrações fisiológicas, potencialmente actuar como um agonista de AR e activar o mutante que pode estar presente em CaP avançado após a terapia de ablação de androgénio

citação:. Mahmoud AM, Zhu t, PArray A, Siddique HR, Yang W, Saleem M, et al. (2013) Efeitos diferenciais de genisteína em células de câncer de próstata dependem do estado mutacional do receptor andrógeno. PLoS ONE 8 (10): e78479. doi: 10.1371 /journal.pone.0078479

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 01 de julho de 2013; Aceito: 12 de setembro de 2013; Publicação: 22 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mahmoud et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. 1. Grant No. GM 842 do Ministério do Ensino Superior egípcio. 2. NIH Grant No. CA 116195. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existe.

Introdução

o cancro da próstata (PCA) é o tumor maligno mais comum ea segunda causa de morte por câncer entre os homens nos Estados Unidos [1]. Nas populações asiáticas, a incidência de PCA é menor em relação aos que nos EUA e os países europeus [2]. A maioria dos estudos epidemiológicos têm mostrado uma associação entre o consumo alimentar de soja e redução do risco de CaP em asiáticos, por muitas das quais alimentos de soja são uma fonte primária de proteína [3-5]. Meta-análises de estudos epidemiológicos suportam um efeito protetor da soja [5,6]. de soja na dieta é rica em isoflavonas, incluindo os compostos de isoflavona genisteína e daidzeína principais, bem como os compostos menos abundantes, como gliciteína [7,8]. A genisteína é mais abundante a isoflavona e biologicamente activa na soja. As concentrações estáveis ​​genisteína estado no plasma de japoneses que consomem dietas ricas em soja são tão elevados como 2,4 mol /L, que é várias vezes superior do que a de os europeus [9,10].

Há um crescente corpo de evidências que a genisteína tem efeitos anticancerígenos da ACP [3,11]. Ele modula a expressão de alguns genes que controlam a sobrevivência celular, o ciclo celular e apoptose [12], inibe a actividade da tirosina-quinase [13], e NF-kB [14], regula as vias de Akt e MAPK de sinalização [15], e inibe angiogénese e metástase [16-21]. A genisteína também tem propriedades antioxidantes [22] e, em alguns

in vitro

estuda genisteína reduzida expressão e atividade transcricional do receptor de andrógeno (AR) [23-29].

PCA é uma doença andrógeno-dependentes e várias modalidades terapêuticas são dirigidas para ablação de androgénios para localmente avançado ou metastático CaP. A maioria dos pacientes que recebem terapias de ablação do andrógeno inicialmente mostram uma resposta clínica e bioquímica (diminuição dos níveis séricos de antígeno específico da próstata [PSA]). No entanto, praticamente todos os doentes com recaída de uma forma mais agressiva, hormona refractário (resistente à castração) do APC, que não necessita de androgénio circulante, mas depende ainda de AR funcional para o crescimento e a progressão. Existem vários mecanismos propostos para o interruptor molecular de CaP de uma evidência andrógeno-dependentes a um estado independente de androgénios, inclusive a sugerir que o crescimento do CaP mais recorrente é impulsionado por inapropriada ativação do AR [30-32]. AR actividade na ausência de androgénios testiculares pode ocorrer através de diversos mecanismos, incluindo a amplificação de AR, a desregulação de factores de crescimento ou citocinas, alteração de coactivadores, e a produção local de androgénios no interior da próstata [33-38]. Outro mecanismo é a aquisição de mutações que causam o AR do receptor, quer para ser hipersensíveis a baixas concentrações de androgénios ou para expandir a sua especificidade de ligando quando eles ocorrem no domínio de ligação ao ligando (LBD) [39,40]. Os últimos tipos de mutações activar o receptor para ser activado por uma grande variedade de esteróides, tais como estrogénios, progesterona, esteróides supra-renais, ou mesmo antiandrogénios [41,42]. Por exemplo, uma treonina para alanina mutação no codão 877 do AR (T877A) existem em mais de 12,5% de CaP refractário a hormonas e permite que a AR para ser activado por 17β-estradiol, progesterona, e alguns anti-androgénios [42]. Esta inadequado promíscuo ligação de ligantes não-andrógeno possivelmente contribui para a resistência do tratamento em pacientes com PCA avançada [43].

A genisteína tem uma estrutura-17β-estradiol como tem actividade estrogénica e em células de cancro da mama [44]. Embora em uma série de

in vitro

estuda genisteína subregulado transcrição AR e expressão da proteína PSA em células APC e inibiu seu crescimento [24,26,27], efeitos estimulantes também foram relatados [45-47]. No entanto, a maioria desses estudos tem algumas limitações metodológicas. Em primeiro lugar, as concentrações farmacológicas ou mesmo citotóxicos da genisteína que não reflectem o que pode ser conseguido por seres humanos que consomem soja têm sido utilizados em muitos destes estudos. Em segundo lugar, na maioria dos estudos que examinaram os efeitos da genisteína no APC, as células LNCaP foram utilizadas. Esta linha de células tem uma mutação T877A na LBD da AR, que se estende a sua especificidade de ligação, permitindo a activação por outros esteróides ou esteróides como moléculas [48]. Nós supomos que a genisteína com a sua estrutura de estradiol e de como pode ser um ligando potencial para este AR mutante, que potencialmente explica os efeitos estimulantes que têm sido obtidos utilizando células de LNCaP em alguns estudos. No entanto, não há estudos sobre os efeitos diferenciais da genisteína em fisiológica

contra

doses farmacológicas sobre as células APC com ARs tipo selvagem (WT-ARs) e células com ARs mutantes. No presente estudo, utilizamos duas linhas de células APC; LAPC-4 células que têm WT-ARs [49] e células LNCaP com ARs mutante T877A [48]. As células foram tratadas as células com uma ampla gama de doses de genisteína, incluindo concentrações fisiologicamente atingíveis, para determinar o papel da mutação T877A AR e a concentração de genisteína em genisteína efeitos sobre a proliferação celular, apoptose, e AR e a expressão do PSA.

Materiais e Métodos

Produtos químicos e reagentes

A genisteína e Casodex foram adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Metiltrienolona (R1881) foi adquirida da Perkin Elmer (Downers Grove, IL).

Cultura de linhas celulares de CaP

células LAPC-4 foram obtidos de Dr. R. Reiter via Dr. Karen Knudsen (UCLA), que foi originalmente desenvolvido pelo Dr. Charles Sawyers [49]. LNCaP e células PC-3 linhas foram obtidas da ATCC (Rockville, MD). As células foram mantidas em vermelho fenol livre meio RPMI com L-glutamina, suplementado com 10% FBS, 100 UI /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Os meios foram substituídos com meio RPMI contendo 10% de soro fetal de bovino carvão despojado 24 horas antes do tratamento de células com 1 mL /veículo mL de DMSO em que a genisteína foi dissolvido em concentrações de 0,5, 1, 5, 10, 25, e 50 mmol /L, com sem ou 100 nmol /L Casodex (Sigma, St. Louis, MO), e /ou de 1 nmol /L metiltrienolona (R1881) (Perkin Elmer, Downers Grove, IL).

Ensaio de Proliferação celular

a sobrevivência celular foi ensaiada utilizando o Cell Titer 96 AQ

ueous celular não radioactivo Ensaio de Proliferação (MTS) (Promega, Madison, WI). As células foram semeadas em placas de 96 poços (3.000 células /poço). Vinte mL de reagente MTS /100 uL meio foram adicionados e, em seguida, deixada durante 4 horas na incubadora húmida a 37 ° C. A absorção foi registrada em 570 nm usando leitor de microplacas (Synergy 2, Biotek, Highland Park, VT). A proliferação celular e a viabilidade das células, também foram medidos por contagem de hemocitómetro; As células foram plaqueadas em placas de cultura celular de 24 poços a 5000 células /poço em 1 ml de meio de cultura com FBS. Ao fim de 24, 48, e 72 h após o tratamento, as células foram colhidas por uma solução de tripsina. As contagens celulares foram realizadas em triplicado utilizando um hemocitómetro com azul de tripano (0,2%) de exclusão para identificar células viáveis. O número total de células viáveis ​​e tingem-coradas em cada experiência foram comparados com os dos correspondentes contagens de células de controlo não tratadas realizadas simultaneamente em três experiências independentes.

citotoxicidade celular ensaio

citotoxicidade celular foi ensaiada utilizando o Kit de Ensaio de Citotoxicidade Vybrant (G6PD Ensaio de libertação) (Invitrogen, Grand Island, NY). As células foram semeadas em placas de 96 poços (5000 células /cavidade) em um 50 uL meios. Após 48 horas de tratamento, 50 uL da mistura de resazurina /reacção pré-preparado 2X foram adicionados a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 30 minutos. A fluorescência foi gravado usando o leitor de fluorescência de microplacas que foi configurado com filtros de excitação e de emissão adequados para resorufina (excitação 530-560 nm, emissão 580-600 nm).

A transfecção de células PC-3

células PC-3, 5000 células /poço, foram transientemente transfectadas em placas de 24 cavidades com 0,5? g de WT-AR, T877A-AR, W741C-AR, H874Y-AR, ou pSG5 vector vazio utilizando Lipofectamina

TM LTX (Invitrogen Grand Island, NY). Os plasmídeos foram generosamente fornecidos pelo Dr. Karen Knudsen (Kimmel Cancer Center, da Universidade Thomas Jefferson, Filadélfia, PA). Oito horas após a transfecção, as células foram tratadas com veículo (etanol e /ou DMSO) ou genisteína.

Análise de citometria de fluxo

As células foram semeadas em frascos T-25 a uma concentração entre 5 x 10

5 – 10

6 células e tratou-se com genisteína durante 48 horas. As células tratadas foram recolhidas, lavadas em solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e coradas para Anexina V para avaliar a apoptose utilizando o /Dead Cell Kit apoptose Alexa Fluor 488 anexina V (Invitrogen). Para a análise do ciclo celular, as células foram fixadas com álcool etílico a 70% durante pelo menos 15 minutos e coradas com uma solução de iodeto de propídio (50 ug iodeto de propídio /ml, 0,1 mg /ml de RNase A, e 0,05% de Triton X-100). As células foram incubadas durante 40 minutos a 37 ° C e, em seguida, analisada utilizando o canal de fluxo ciano ADP três citómetro e software Summit3 (Beckman Coulter, Brea, CA).

Análise Western Blot

A proteína total foi isolado a partir de células tratadas e para a análise semiquantitativa de AR nuclear, extractos nucleares e citoplasmáticos foram isolados usando um kit de extracto nuclear (Activo Motif, Carlsbad, CA). A concentração de proteína foi medida a 595 nm com um leitor de microplacas usando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Vinte e cinco ug de proteína /pista foi resolvido por NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) e transferidas para membranas de PVDF. A imunotransferência foi incubada com anticorpos primários em diluições de 1: 500 diluído anticorpo policlonal de coelho para a AR (N-20), 1: anticorpo policlonal 500 cabra para o PSA (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou 1: 1000 de anticorpo monoclonal de ratinho para a fosfotirosina (4G10) (Invitrogen) durante a noite a 4 ° C. anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram utilizados (Promega). reagentes de detecção ECL blotting Ocidentais (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) foram usados ​​para identificar as bandas de proteína ligada ao anticorpo. p-tubulina e a Tata Binding Protein (TBP) (Cell Signaling, Danvers, MA) foram usados ​​como controlos de carga para a proteína total e a proteína nuclear, respectivamente. Software Image J foi utilizada para calcular a intensidade das bandas de AR e de PSA em relação ao gene de manutenção em três experiências independentes.

PCR em Tempo Real

O ARN total foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD). quantidades de ARN e qualidades foram determinados medindo a absorvância a 260 e 280 nm por espectrofotometria. Cinco ug de ARN total foram reversamente transcrito em ADNc utilizando SuperScript RT III (Invitrogen). AR e de ARNm de PSA foram determinados por expressão em tempo real de RT-PCR utilizando o protocolo padrão de SYBR verde de ensaio, e a um passo mais Real-Time PCR System foi usada (Applied Biosystems, Foster City, CA). primers específicos para cada gene foram concebidos. Para RA, o iniciador directo foi 5′-3’TTGTGTCAAAAGCGAAATGG-, e o iniciador inverso foi 5′-3’CAATGGGCAAAACATGGTC. Para PSA, a frente era 5′-3’CTTGTAGCCTCTCGTGGCAG, e o iniciador inverso foi 5′-3’GACCTTCATAGCATCCGTGAG-. Gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como controlo interno para normalizar os dados de expressão. GAPDH iniciador directo foi 5′-3’GCCTCAAGATCATCAGCAATGCCT, e o iniciador inverso foi 5′-3’TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT-. números de ciclo limiar (Ct) gerados pelo tempo real de RT-PCR foram utilizados para calcular a taxa de expressão normalizada dos genes alvo utilizando o método 2

-ΔΔCt (Livak). As reacções foram realizadas em triplicado, e os resultados mostram três experiências independentes.

Luciferase Assay

As células foram semeadas em placas de 24 poços, a uma densidade de 5000 células /poço, em meio padrão sem antibióticos . As células foram co-transfectadas transientemente com o plasmídeo de luciferase de PSA-promotor do pirilampo e

Renilla

vector de expressão de luciferase como um controlo para a eficiência de transfecção utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ambos os plasmídeos foram generosamente fornecidos pelo Dr. Larisa Nonn (UIC, Chicago, IL). Oito horas após a transfecção, as células foram tratadas com veículo (etanol e /ou DMSO) ou genisteína. Após 24 horas, as células foram recolhidas, e repórter e

Renilla

actividades de luciferase foram determinadas utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase Dual-(Promega).

Localization Estudos Nucleares

Células foram plaqueadas em lâminas com câmara de 16 poços (Lab-Tek slides do sistema de câmara, Nalge Nunc, Naperville, IL). Trinta minutos – 4 horas após o tratamento, as células foram lavadas 1x com PBS, fixadas com formaldeído a 4% /1xPBS durante 20 minutos e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 /1xPBS durante 10 minutos. As células foram incubadas primeiro com bloco de proteína livre de soro a 5% durante 60 minutos e, em seguida, com o anticorpo primário AR (N-20 a partir de Santa Cruz Biotechnology) a 1: 200 de diluição durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. No dia seguinte, as células foram lavadas e incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com FITC (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 hora, em seguida, incubados com 1: 500 Hoechst contracoloração durante 20 minutos no escuro. As lâminas foram examinadas ao microscópio invertido fluorescente (Eclipse TE 2000, a Nikon, Japão) equipado com uma câmera CCD refrigerado (fotométrica Cascade II, Tucson, AZ) sob o controle do software de imagem Metamorph (Molecular Devices, totalmente Vale, CA).

3 [H] -R1881Competitive Ensaio de Ligação

Esta análise foi feita utilizando o método descrito por Siddique et al. [50]. Resumidamente, as células LAPC4 e LNCaP foram semeadas em placas de 12 poços, em meio isento de vermelho de fenol, contendo 5% de carvão despojado de FBS durante 3 dias, após o que, os meios foram substituídos com meio isento de soro contendo 1 nM

3 [H] -R1881 com ou sem um excesso molar de 0.1-1,000 vezes de ligandos não marcados competidor (R1881, Casodex ou genisteína) durante 90 min a 37 ° C. As células foram lavadas com tampão de fosfato, e o ligado

3 [H] -R1881 foi extraído em etanol durante 30 minutos à temperatura ambiente e detectada por contagem de cintilação.

A genisteína vinculativo com AR in silico

A estrutura cristalina de raios-X do receptor de tipo selvagem andrógeno (código PDB 1I37) e mutante T877A (código PDB 1I38) em combinação com dihidrotestosterona (DHT) foram preparadas através da preparação proteína Assistente da construção genisteína Schrodinger Suíte 2011. foi preparado usando LigPrep [51]. campo de força OPLS2005 foi utilizado para a otimização geométrica, e as possíveis formas de ionização e tautoméricas foram criados para genisteína em pH 7,5 ± 0,5 usando EPIK [52]. acoplamento Molecular foi realizada com OURO v5.0.1 [53]. A esfera local de ligação foi definida com um raio de 10 Å em torno do ligando presente na estrutura cristalina, e 100 é executado de acoplamento foram realizadas para cada ligando. Os valores padrão foram utilizados para outros parâmetros do algoritmo genético. Todos os cálculos foram realizados com o âmbar 11 conjunto de programas [https://ambermd.org/], incluindo o campo ff99SB vigor para a proteína AR, o campo de força GAFF para o ligando, e MM /PBSA para calcular as energias livres de ligação [ ,,,0],54]. Cada complexo de proteína-ligando foi solvatado numa caixa octaédrica de moléculas de água que se estendem TIP3P 10 ° fora da proteína em todos os lados. Os electrostática foram tratados com o método Ewald partícula de malha [55]. As simulações utilizado um ponto de corte à base de resíduo de 8 Å, um passo de tempo de 2 fs e uma restrição de comprimentos de ligação envolvendo átomos de hidrogênio usando o algoritmo AGITAÇÃO. Os complexos solvatadas foram minimizados com 10000 passos de minimização do gradiente conjugado, equilibrada com MD a 300 K com 50ps de aquecimento e 50 ps de equilíbrio densidade com 2 kcal mol

-1-A

-2 restrições sobre o complexo e seguido por 500ps de equilíbrio de pressão constante com 0,5 mol kcal

-1-a

-2 restrições sobre o complexo no 300K. Após equilíbrio, 20 ns corrida de produção foi realizada para avaliar a convergência energia livre e as coordenadas foram extraídos a cada 2 ps. Root mean desvio quadrado (RMSD) análises foram realizadas utilizando o módulo ptraj do âmbar 11. MM /PBSA é um método bem estabelecido para calcular as energias livres de ligação [56]. A energia livre de ligação foi calculada utilizando um ciclo termodinâmico simples a partir da diferença de energia entre o complexo e os formulários independentes. Os valores da energia livre de ligação de cada composto foram calculados de acordo com a equação Δ

G

ligamento =

G

complexo –

G

receptor –

G

ligando. A energia livre de cada um deles foi estimada como a soma dos quatro termos

G

=

E

MM +

G

psolv +

L

npsolv –

TS

lnmode, onde E

MM é a energia mecânica molecular da molécula expressa como a soma da energia interna da molécula mais o electrostática e van der Waals, Gpsolv é a contribuição polar para a energia de solvatação da molécula, Gnpsolv é a energia de solvatação não polar, T é a temperatura absoluta, e S representa a entropia da molécula estimado por análise de modo normal. Os instantâneos para MM /PBSA foram tomadas a cada 20 ps dos últimos 2 ns MD corridas de produção, resultando em um total de cem instantâneos por corrida. análise em modo normal foi empregado para calcular a entropia vibracional, rotação e translação. Por causa do alto custo computacional eo desvio de entropia que é relativamente pequeno para conformações diferentes [57], só selecionados 12 instantâneos regularmente espaçados ao longo do último 2 ns trajetória da produção para cálculos de entropia.

Análise

Estatística

Os dados foram analisados ​​por meio de teste t de Student, ou one-way ANOVA seguido de um teste post-hoc como valores apropriados e p 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

fisiológicas concentrações de genisteína inibido LAPC-4 celular crescimento, mas crescimento estimulado de células LNCaP

Para determinar se a mutação T877A da AR influencia os efeitos da genisteína sobre a proliferação de células APC, aplicou-se duas abordagens: (a) utilizando linhas de células que naturalmente têm WT AR (células LAPC-4) ou Ar T877A mutante (células LNCaP) e (b) utilizando uma linha celular de AR-nula (PC-3 ) transfectadas transitoriamente com exógena AR mutante WT ou T877A, a fim de superar quaisquer discrepâncias biológicas de usar duas linhas de células diferentes. Além disso, a fim de evitar a variação dos níveis de expressão do AR entre células PC-3 transfectadas com diferentes construções de AR e células LNCaP, uma gama de concentrações de ADN (0.5-5μg) foi testado e a dose óptima que levou a um nível final expressão AR perto de que, em células LNCaP foi usada (0,5 ug).

CaP células foram tratadas com uma gama de concentrações de genisteína (0,5-50 pmol /L) durante 24 a 72 horas, após o que o crescimento celular e a viabilidade foi avaliada por um ensaio de proliferação celular de células MTS e contando com hemocitómetro tripano exclusão de azul. A genisteína inibiu a proliferação de células de LAPC-4 significativamente em todas as concentrações testadas numa forma relacionada com a dose (Figura 1A). Em contraste, as concentrações fisiológicas de 0,5, 1,0 e 5,0 nmol /L de genisteína estimulou a proliferação de células LNCaP de 13%, 35%, e 27% em relação aos controlos, respectivamente, enquanto que as concentrações mais elevadas de genisteína (25 e 50 umol /L) causou a inibição de proliferação em 38% e 50% (Figura 1B). Em células de LAPC-4, o tratamento com 1 nmol /L R1881 aboliu os efeitos inibidores da genisteína, excepto a uma concentração elevada (50μmol /L) (Figura 1C). Enquanto em células LNCaP, o tratamento combinado com genisteína dose baixa (1 pmol /L) e o androgénio sintético (1 nmol /L R1881) aditiva aumentou a proliferação de células de 134%, que foi mais do que a provocada por qualquer das genisteína ou androgénio sozinho (35% e 90% relativamente ao controlo, respectivamente) (Figura 1D). Hemocitómetro contando com exclusão de corante azul tripano mostrou um padrão semelhante ao obtido pelo ensaio de proliferação de MTS e falta de citotoxicidade (dados não apresentados).

Os dados representam a média ± SD (desvio padrão) de três experimentos cada um em triplicado. A e B: apresentação gráfica dos efeitos de diferentes concentrações de genisteína em LAPC-4 (A) e o crescimento de células LNCaP (B). C e D: O efeito do tratamento combinado com genisteína e R1881 em LAPC-4 (C) e a proliferação de células LNCaP (D). E: O efeito do tratamento com genisteína durante 24 horas sobre o crescimento de células PC-3 transfectadas ou não células PC-3 transfectadas com WT-AR ou a AR mutante T877A. OD; densidade ótica. * P 0,05, ** p . 0,01 para comparações com os grupos de controle

Às 10 mmol /L ou mais, o tratamento genisteína por 48 horas induziu uma significativa inibição da proliferação de células PC-3 que faltam AR expressão (Figura 1E). Curiosamente, as mesmas concentrações de genisteína induzida uma estimulação significativa da proliferação de células PC-3 que expressam o AR mutante T877A-(Figura 1E), consistente com os nossos resultados em células LNCaP que expressam endogenamente o mesmo AR mutante. Proliferação de células PC-3 transfectadas com WT-AR foi significativamente inibida a concentrações de 10 pmol /L ou mais (Figura 1E).

Em resumo (ver Tabela 1), as células que expressam WT CaP-AR quer endogenamente (LAPC-4 células) ou exógena (WT-AR transfectadas células PC-3) não apresentaram qualquer resposta estimuladora do crescimento de genisteína . No entanto, as células que expressam o CaP AR mutante, quer endogenamente (células LNCaP) ou exógena (PC-3 transfectadas células), mostrou um aumento significativo na proliferação celular em resposta a reduzir as concentrações micromolares de genisteína.

Genisteína (umol /L )

Crescimento celular

apoptose

AR localização nuclear

proteína AR e expressão de mRNA

proteína PSA e expressão de mRNA

luciferase PSA activity

LAPC-40.5↓↑↓↓↓↓1↓↑↓↓↓↓↓↓↓↓5↓↓N/AN/A↓↓↓↓↓↓↓↓10↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓25↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓LNCaP0.5↑↔↑↑↑↑1↑↑↔↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑5↑↑N/AN/A↑↑↑10↔↔↔↔↓↓↓25↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓Table . 1. Resumo dos efeitos globais de genisteína em células de LAPC-4 e LNCaP

As abreviaturas são como se segue: ↑ ligeiramente aumentada; ↑ ↑ moderadamente aumentada; ↑ ↑ ↑ marcadamente aumentada; ↔ nenhuma mudança, ↓ ligeiramente inibida; ↓ ↓ moderadamente inibida; ↓ ↓ ↓ marcadamente inibida. CSV Baixar CSV

baixas doses de genisteína induzida apoptose e paragem do ciclo celular em LAPC-4 células, mas não em células LNCaP

Nós comparamos células LAPC-4 e LNCaP para os efeitos de concentrações crescentes de tratamento genisteína durante 48 horas na apoptose e na progressão do ciclo celular, tanto avaliada por citometria de fluxo. A apoptose foi aumentada de uma maneira dependente da concentração em LAPC-4 células, a partir de uma dose tão baixa como 0,5 mol /L (Figuras 2A). Em contraste, as concentrações de genisteína entre 0,5 e 10 umol /L causou nenhuma mudança significativa na apoptose em células LNCaP; apoptose foi aumentada apenas em concentrações de 25 umol de genisteína /L ou mais elevada (Figuras 2B). Consistente com estes resultados, a genisteína causou um aumento de LAPC-4 células em sub-G1, em concentrações iguais ou superiores a 10 mmol /L, enquanto que isto foi observado em células LNCaP apenas no ou acima de 25 mmol /L (Tabela 2).

As células foram tratadas com genisteína (0,5- 50 umol /L) durante 48 h, em seguida, a apoptose foi analisada em células LNCaP LAPC-4 (a) e (B) por citometria de fluxo, após coloração com anexina-V apoptose kit de detecção. As células tratadas com genisteína durante 72 horas foram testados quanto a sinais de citotoxicidade utilizando o ensaio de libertação de lactato desidrogenase. Os resultados do gráfico representam a média ± DP de três experiências. * P 0,05, ** p 0,01, em comparação com os grupos de controle.

LAPC-4 células

células LNCaP

dose de genisteína

Sub G

G0 /G1

S

G2 /M

Sub G

G0 /G1 S

G2 /M

Control9.46 (3,8) 71,98 (5,1) 6,38 (3,3) 12,25 (2,8) 7,06 (1,5) 73,85 (2,5) 8,04 (2,1) 11,05 ( 2,8) 0,5 mmol /L 13,63 (1,5) 62,69 (9,4) 6,12 (4,9) 17,66 (2,6) 7,00 (1,5) 74,96 (5,4) 8,02 (2,9) 10,02 (4,6) 1,0 umol /L18.37 (6.2) 59,58 * ( 4.1) 4,18 (0,8) 17,78 (5,6) 4,44 * (0,9) 82,12 * (4,3) 9,09 (2,4) 4,42 * (2,4) 10 mmol /L25.1 ** (2,6) 52,3 ** (2,9) 3,30 (0,9) * 19,31 (2,8) 7,08 (1,5) 72,81 (4,8) 7,80 (1,8) 12,31 (2,6) 25 mmol /L34.2 ** (4,2) 40,8 ** (4,3) 3,84 (4,1) 21,19 * (3,5) 13,0 ** (2,5) ** 61,78 (3,2) 5,84 (2,1) 19,4 * (3,6) 50 mmol /L40.4 ** (0,8) 31,2 ** (3,0) 2,30 (0,9) 26,1 ** (2,0) 9,37 ** (1,6 ) 43.03 ** (3,4) 3,30 * (1,1) ** 34,3 (3,9) Tabela 2. Os efeitos da genisteína sobre a distribuição do ciclo celular de células de LAPC-4 e LNCaP.

as células marcadas com iodeto de propidio foram analisados ​​por meio de um fluxo citômetro. Os resultados na tabela representam a média ± DP de três experiências * p . 0,05, ** p 0,01, comparado com o grupo de controlo com veículo. Números entre parênteses são para os desvios-padrão. CSV Transferir CSV

Em relação à progressão do ciclo celular, 1μmol /L de genisteína reduziu significativamente as células LNCaP na sub-G1 e G2 /M e o aumento de células na fase G0 /G1 do ciclo celular (Tabela 2). Em contraste, em LAPC-4 células, baixas doses de genisteína induziu a paragem do crescimento evidente pela redução do número de células em G0 /G1 e acumulação de células em G2 /M, o que é característico de um bloco da fase S ou S /L

bloco de transição de 2 fases (Tabela 2). No entanto, em concentrações suprafisiológicas (25μmol /L e mais altos), a genisteína provoca uma G2 /M prisão e apoptose em ambas as linhas celulares, LAPC-4 células, sendo mais sensíveis do que as células LNCaP. Estes resultados são consistentes com o que reportado acima no ensaio de proliferação de células MTS. Para eliminar o efeito de citotoxicidade directa de genisteína, que, em seguida, realizado o ensaio de libertação de lactato-desidrogenase em ambas as células de LAPC-4 e LNCaP em toda a gama de doses de genisteína que têm sido utilizados. Não havia citotoxicidade detectável a qualquer dose de genisteína até 50 pmol /L durante 72 horas, nem em linhas celulares (Figura 2C).

O Estimulador Efeito da genisteína em células LNCaP foi mediada pela

Mutant AR

Nós examinamos se o mutante AR-T877A é necessário para genisteína para aumentar a proliferação de células LNCaP na ausência de andrógenos (Figura 3A). As células LNCaP foram incubadas com 1 umol de genisteína ou 1 nmol /L R1881 na ausência ou na presença de 100 nM do antagonista de AR, Casodex. Como mostrado na Figura 3A, Casodex sozinho não afectou o crescimento celular de LNCaP, mas aboliu o efeito estimulador de 1 nmol /L R1881 sobre a proliferação celular, consistente com o conceito de que Ar activação medeia a proliferação de células CaP (36,38). Adicionando 1μmol /L de genisteína com a proliferação das células LNCaP meios aumentada em 49% e este efeito também foi eliminado por 100 nM Casodex. Estes resultados indicam que o efeito estimulador de genisteína na proliferação das células LNCaP é mediada principalmente pela AR mutante T877A.

A: apresentação gráfica do efeito do tratamento combinado com R1881 (1 nmol /L) e Casodex (100 nmol /L), ou genisteína (1μmol /L) e Casodex (100 nmol /L) no crescimento celular de LNCaP medido pela ensaio MTS. Os resultados do gráfico representam a média ± DP de três experiências cada um em triplicado. * P 0,05, ** p 0,01, em comparação com os grupos tratados com R1881 ou genisteína, somente. B: Avaliação de genisteína-AR ligação

em

silico

. figura representativa mostrando mudanças de conformação do WT-AR e AR T877A mutante após o acoplamento molecular com genisteína

em

silico

usando o programa OURO modelagem v5.0.1. Diferentes domínios da AR são apresentados em várias cores. Inserir, genisteína ligado ao domínio de ligação ao ligando (LBD) de AR-receptor. As setas indicam as diferentes mudanças de conformação e movimentos de loop em WT-AR e T877A mutante AR em resposta a ancoragem genisteína. C: otimização geométricos e tautoméricos formas de genisteína criado em pH 7,5 ± 0,5 usando EPIK. O amarelo é para o WT-AR, eo verde é para o AR T877A mutante. D e E: Avaliação da genisteína-AR ligação usando

3 [R1881] ensaio de ligação competitiva. Histograma mostra a ligação de genisteína com AR em LAPC4 (WT-AR) e LNCaP (AR mutante) células como avaliado por ensaio de ligao competitiva baseado em células radiomarcado tal como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados do gráfico representam a média ± DP de três experiências. * P 0,05, ** p . 0,01, comparado com o controlo

A capacidade da genisteína para aumentar a proliferação de células LNCaP, mas não em LAPC-4 células, pode ser devido a diferente afinidade, através da qual genisteína liga ao AR mutante e o WT-AR. Para investigar esta hipótese, duas abordagens foram empregadas,

in silico

modelagem molecular e uma

3 [H] -R1881 ensaio de ligação competitiva.

In silico

modelagem mostraram que a genisteína se liga à cavidade de ligação AR sem sobreposição com o DHT local de ligação (Figuras 3B e 3C). * P * P * P