Abstract

único gene polimorfismos de nucleotídeo (SNPs) têm sido extensivamente estudado em associação com o desenvolvimento e prognóstico de vários malignidades. No entanto, não foi examinado o papel potencial de polimorfismos genéticos de haste do cancro de células (CSC) genes marcadores com relação ao risco de câncer. Foi realizado um estudo de caso-controle, envolvendo um total de 1000 indivíduos (doentes com cancro do pulmão 500 e 500 controles sem câncer pareados por idade) de nordeste da China. o risco de câncer de pulmão foi analisada em um modelo de regressão logística em associação com genótipos de quatro pulmonares genes CSC marcador (CD133, ALDH1,

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e EpCAM). Usando a análise univariada, o

Musashi-1 | rs2522137 genótipo GG foi encontrado para ser associado com uma maior incidência de câncer de pulmão em comparação com o genótipo TT. Não foram observadas associações significativas para as variantes do gene de CD133, ALDH1, ou EpCAM. Na análise multivariada,

Musashi-1 | rs2522137 ainda estava significativamente associada com o câncer de pulmão quando os fatores ambientais e de estilo de vida foram incorporadas no modelo, incluindo IMC mais baixo; história familiar de câncer; diagnóstico prévio de doença pulmonar obstrutiva crônica, pneumonia ou tuberculose pulmonar; exposição ocupacional a pesticidas; exposição ocupacional a gasolina ou óleo diesel; os hábitos tabágicos; e exposição a emissões de cozinha pesados. O valor da área sob a curva característica operacional do receptor (ROC) (AUC) foi de 0,7686. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar uma associação entre um

Musashi-1 | genótipo e pulmão risco de câncer. Além disso, o modelo de previsão neste estudo pode ser útil para determinar os indivíduos com alto risco de câncer de pulmão

Citation:. Wang X, Hu J-F, Tan Y, Cui J, Wang G, Mrsny RJ, et al. (2014) Cancer Stem Cell marcador

Musashi-1 | rs2522137 genótipo está associado a um risco aumentado de câncer de pulmão. PLoS ONE 9 (5): e95915. doi: 10.1371 /journal.pone.0095915

editor: Olga Y. Gorlova, Geisel School of Medicine, em Dartmouth College, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Dezembro, 2013; Aceito: 01 de abril de 2014; Publicado em: 02 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Natural Science Foundation dos subsídios China (81071920, 81372835), Jilin Provincial da Ciência e Tecnologia Departamento de Grant (201201023), o Projeto de Clinical Key do Ministério da Saúde da República Popular da China Grant (2001133), Institutos Nacionais de concessão de Saúde (1R43CA103553-01), California Institute of concessão Medicina regenerativa (CIRM) (RT2-01942), Grant Collaboration Jilin International (20.120.720), a National Science Foundation Natural da concessão China (81.272.294) e a concessão de Projeto Key do Ministério da Educação 311015 chinês). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais comumente diagnosticado e a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo [1]. O tabagismo é considerado como um importante fator de risco para câncer de pulmão. No entanto, apenas 10-15% dos fumantes desenvolvem câncer de pulmão, sugerindo que a variação individual na susceptibilidade genética ao câncer de pulmão na população em geral podem desempenhar um papel. cancro de células estaminais (CSCs) são uma pequena minoria das células numa população heterogénea de tumor que conduz ao crescimento do tumor e têm sido associados com a resistência à quimioterapia e radiação de terapias [2] – [4]. Tem sido demonstrado que os CSCs pulmonares desempenham um papel importante na iniciação do tumor [5], [6]. As CDCs também partilham algumas semelhanças com as células estaminais normais, incluindo a auto-renovação e diferenciação, para além da sua capacidade de condução do tumor potente [7] – [10]. CSCs são caracterizadas pela expressão de marcadores moleculares específicos que desempenham um papel importante na promoção de células-tronco auto-renovação e manutenção [11].

expressão aberrante de marcadores CSC está associado com o início e desenvolvimento de câncer de pulmão, incluindo cluster de diferenciação 133 (CD133), proteína 1 Musashi RNA de ligação (

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), aldeído desidrogenase 1 (ALDH1), epiteliais molécula de adesão celular (EpCAM) Moloney vírus da leucemia murina, B-específica de células um local de integração (IMC-1), factor de ligação Octarner 4 (Oct-4), e glicina-desidrogenase (GLDC) [12] – [20]. CD133, inicialmente descrita como um antígeno de superfície específico para as células-tronco hematopoiéticas humanas [21], [22], está actualmente a ser usado como um marcador de isolamento de CSCs de cancro do pulmão [23].

Musashi-1 |, uma proteína de ligação a ARN, é expresso em várias células estaminais epiteliais e desempenha um papel importante na regulação da manutenção e diferenciação de células estaminais /células progenitoras [24] – [26].

Musashi-1 | está sobre-expressos em vários tecidos tumorais, incluindo o cancro do pulmão [17], gliomas [27], adenomas intestinais [28], [29] e hepatomas [30], sugerindo uma correlação com oncogénico desenvolvimento. ALDH1 é amplamente considerado como um marcador de superfície de CSCs em câncer de pulmão [31] – [33]. cancro positivo para as células-tronco pulmonar ALDH-têm como telómeros mais longos do que as células não-CSC [34]. EpCAM, uma glicoproteína transmembranar de tipo I de ~ 40 kDa, é sobre-expresso numa variedade de tumores epiteliais, incluindo cancro do pulmão [18] – [20]. EpCAM está envolvido na adesão intercelular e interage com a E-caderina para induzir a adesão de células [35]. A sobre-expressão de EpCAM está ligada directamente à estimulação do ciclo celular e proliferação por upregulating c-myc e ciclina A /E [36]. Inibição de EpCAM por ARN inibitório pequena diminui a proliferação celular, migração e invasão [37]

Em conjunto, estas observações foram correlacionados função aberrante das moléculas marcadoras CSC com características celulares: de cancro. Hiperproliferação e comportamentos metastáticas. Enquanto SNPs têm sido extensivamente estudadas para a sua associação com o risco e prognóstico de cancros, pouco se sabe sobre o papel potencial dos SNPs em genes marcadores CSC com relação ao câncer. Neste estudo, nós examinamos a associação de risco de câncer de pulmão na população chinesa com polimorfismos dos genes marcadores CSC bem estabelecidos CD133, ALDH1,

Musashi-1 Comprar e EpCAM. Um modelo de previsão foi construído usando SNPs marcador CSC e factores epidemiológicos; os resultados fornecem um novo método para prever os indivíduos com risco aumentado de desenvolver câncer de pulmão.

Métodos

População do estudo

Foi realizado um estudo, de caso-controle de base hospitalar envolvendo um total de 1000 indivíduos do nordeste da China (cidade de Changchun, província de Jilin). Todos os pacientes eram residentes locais de Han descida, constituído por 500 pacientes com diagnóstico clínico de câncer de pulmão e 500 controles sem câncer. Os pacientes tinham câncer de pulmão primário histologicamente confirmado, sem história de câncer anterior, não receberam radioterapia, quimioterapia ou outra terapia anti-câncer. Os controles foram selecionados aleatoriamente indivíduos normais que recebem exames físicos de rotina no mesmo hospital. Coincidindo caso foi realizado com base na idade, sexo e local de residência. O estudo foi aprovado pelo Comitê de o primeiro hospital da Universidade de Medicina de Jilin de Ética, e conduzida de acordo com a Declaração de Princípios de Helsínquia. Todos os indivíduos foram fornecidos consentimento informado por escrito.

Os critérios de diagnóstico e coleta de dados

A entrevista padronizada foi realizada por entrevistadores treinados no hospital ou nas casas dos indivíduos participantes. Informações sobre detalhes sócio-demográficas, história médica, história familiar, estilo de vida e diagnóstico de câncer foi registrado. informações fator de risco e linfócitos do sangue periférico foram coletadas no momento do diagnóstico para pacientes com câncer ou no dia da entrevista para os controles.

CSC selecção polimorfismo do gene marcador

Nós usamos uma abordagem gene candidato [ ,,,0],38] – [40] para seleccionar SNPs para este estudo. Quatro genes CSC marcador bem estabelecidos (CD133, ALDH1,

Musashi-1 Comprar e EpCAM) foram selecionados no desenho do estudo. Expressão destes quatro proteínas havia sido relatado como um marcador para identificar CSCs pulmão [41], [42]

Três critérios pré-definidos foram utilizados para a seleção CSC SNP:. (A) menor freqüência do alelo (MAF) ≥5 % na população HapMap CHB; website (b) SNPinfo (https://snpinfo.niehs.nih.gov) para seleção SNP gene CSC candidato e publicações (c) mostrando correlações clínicas com risco de câncer /resultado ou recorrência. Usando esses critérios, cinco SNPs candidatos CSC foram escolhidos em nossa análise do modelo: Rs2286455 na CD133 gene, rs1342024 e rs13959 no gene ALDH1, rs2522137 no

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gene, e rs17036526 no gene EpCAM ( Tabela 1). Com base na informação literatura, foram excluídos os polimorfismos previamente implicados na DPOC ou câncer de pulmão. Além disso, nós não seleccionar SNPs em genes que codificam para proteínas envolvidas nas vias de controlo do ciclo celular, resposta oxidante, apoptose e inflamação das vias aéreas. Finalmente, temos evitado SNPs conhecidos por ter tanto efeitos funcionais em ensaios in vitro, ou não eram sinônimo ou em regiões reguladoras.

A genotipagem e controle de qualidade

O DNA genômico foi isolado a partir de linfócitos do sangue periférico. MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA) foi utilizado para genotipar marcadores CSC utilizando espectrometria de massa alelo específico MALDI-TOF. Primers e reações multiplex foram projetados usando o site RealSNP.com. A concordância entre as 3 amostras de ADN de controlo genómicos presentes em duplicado foi de 100%. Dos SNPs com dados de genotipagem, as tarifas das chamadas amostra foram mais de 95%.

A análise estatística

O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) foi testado por um melhor ajuste qui-quadrado (χ

2) teste que comparou freqüências genotípicas com freqüências genotípicas observadas nos controles sem câncer esperado. O modelo também foi utilizado para determinar a presença do genótipo diferenças significativas na distribuição dos alelos e assim como SNP frequência entre o cancro do pulmão clinicamente diagnosticada e controlos. Um modelo de regressão logística foi utilizada para identificar fatores de risco independentes para o câncer de pulmão. O método da razão de verossimilhança passo a passo para a frente foi empregado para variáveis ​​de tela na seleção de modelos, onde o ponto de corte para variáveis ​​no modelo foi de 0,05 eo de corte para variáveis ​​fora do modelo foi de 0,10; um modelo ideal com critério mínimo de informação de Akaike foi selecionado. Todas as variáveis ​​categóricas foram definidos como variáveis ​​dummy, e a primeira categoria de cada variável foi selecionada como linha de base. A capacidade de classificação do modelo foi avaliada através da área sob a curva ROC (ROC) (AUC), e o ponto operacional ideal (OPP) foi dado depois. Todas as análises foram realizadas utilizando o software v19.0 SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Todos os valores P foram em frente e verso, e P-valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Distribuição de genótipo e suas características em populações e controlo do cancro

Foram recrutados 500 casos de câncer de pulmão e 500 de câncer de controles livres entre 2010 e 2012. a Tabela 2 mostra a distribuição ea frequência dos fatores de risco específicos de estudo entre pacientes e controles de câncer.

Associação de CSC marcador SNPs de genes com o risco de câncer de pulmão em análise univariada

O primeiro avaliou o risco de câncer de pulmão por meio de análise univariada. Entre SNPs gene marcador CSC selecionados, o

Musashi-1 | rs2522137 genótipo GG tinha uma tendência a uma maior incidência de câncer de pulmão do que o genótipo GG rs2522137, tanto modelo recessivo (P = 0,004) e aditivo modelo. No entanto, não houve diferenças significativas foram observadas para SNPs em outros genes marcadores CSC em dominante, recessivo, aditivo, ou modelos multiplicativos (Tabela 3).

Associação de SNPs com o risco de câncer de pulmão em análise multivariada

Em seguida, avaliamos fatores de risco independentes de câncer de pulmão por meio de análise multivariada. Ao incorporar parâmetros ambientais e de estilo de vida, descobrimos que no modelo recessivo,

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rs2522137 ainda estava significativamente associada com o câncer de pulmão. Estes parâmetros ambientais e de estilo de vida incluídos menor IMC, história familiar de câncer, diagnóstico prévio de DPOC, pneumonia ou tuberculose pulmonar, a exposição ocupacional a pesticidas, exposição ocupacional a gasolina ou diesel, mais pesado tabagismo e exposição a emissão de cozinhar mais pesado (Tabela 4). Estes dados sugerem que o

Musashi-1 | rs2522137 genótipo GG é um fator de risco genético significativo para câncer de pulmão.

ROC análise

A capacidade classificação da multivariada modelo foi ainda avaliada através da área sob a curva ROC (AUC) e o ponto operacional ideal (OPP). A Figura 1 mostra a curva ROC derivado do nosso modelo; AUC foi calculada como 0,7686. Além disso, o OPP foi obtido, quando o corte foi fixado em 0,47. As taxas estimadas de falsos positivos, verdadeiros taxas positivas, e índice de Youden foram determinados como sendo 0,28, 0,72, e 0,44, respectivamente.

O ROC AUC foi 0,7686. A linha recta representada a curva ROC esperado apenas pelo acaso.

Correlação entre SNPs e tipo de câncer de pulmão

Finalmente, nós olhamos para as correlações entre CSC SNPs e tipo de câncer de pulmão (de células escamosas , adenocarcinoma, células pequenas), juntamente com a idade de início e sexo de câncer de pulmão. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre estes CSC SNPs e idade ou sexo no início do cancro do pulmão (Tabelas 5). Na análise estratificada-patologia, no entanto, rs2286455 SNP CD133 foi significativamente correlacionado com o tipo de cancro do pulmão (P = 0,048) (Tabela 6). Não foram observadas diferenças entre os SNPs restantes sendo considerado com o tipo de câncer de pulmão.

Discussão

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) têm sido extensivamente examinada em praticamente todos os tipos de câncer em um esforço para identificar herdou genes de susceptibilidade ao câncer e sua interação com fatores ambientais. células-tronco cancerosas (CSCs) desempenham um papel importante na iniciação do tumor, metástases e recidiva. Examinamos a correlação potencial entre SNPs presentes em CSCs ea probabilidade de câncer de pulmão. Isto é particularmente importante uma vez que os SNPs em genes que dirigem o CSC pode proporcionar uma ligação genética de cancros que são particularmente difíceis de tratar. Enquanto terapias do cancro típicos podem eliminar a maior parte da massa do tumor, uma pequena população de CSCs com o potencial para repovoar o tumor pode permanecer [5]. É geralmente aceite que os CSCs são caracterizados pela expressão única de moléculas da superfície celular chamados genes marcadores CSC. marcadores CSC desempenhar um papel importante na manutenção de auto-renovação e resistência a activação da via da apoptose nestas células. Neste estudo, foram obtidas informações para apoiar a hipótese de que o resultado clínico em pacientes com câncer de pulmão pode ser influenciada por variações genéticas de genes marcadores CSC.

O impacto potencial de polimorfismos do gene marcador de CSC na suscetibilidade ao câncer de pulmão não foi explorada anteriormente. Neste estudo nós levamos a vantagem de uma abordagem gene candidato orientado a hipótese [38] – [40] para identificar SNPs potencialmente funcionais associados com o cancro do pulmão histologicamente validado. Em contraste com todo o genoma-associação (GWA) e Quantitative Trait loco (QTL) se aproxima, a abordagem do gene candidato é econômico e tem bastante elevado poder estatístico [38]. Estamos focados em quatro genes marcadores CSC que foram usados ​​para isolar CSCs: CD133, ALDH1, EpCAM, e

Musashi-1 | [41], [42]. Usando a abordagem do gene candidato, foi selecionado um painel de SNPs nestes loci gene CSC a partir de sites de SNP e literatura peer-reviewed. SNPs identificados para ter alta freqüência do alelo foram genotipados em 500 casos de câncer de pulmão, juntamente com 500 controles pareados por idade. Os resultados identificaram a

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como um fator de risco independente para o câncer de pulmão. Também é interessante notar que o

Musashi-1 | rs2522137 genótipo ainda foi associado com o risco de câncer de pulmão em um modelo de regressão multivariada que considerou vários fatores ambientais e de estilo de vida. Tomados em conjunto, este estudo fornece a primeira evidência de correlacionar a

Musashi-1 | rs2522137 SNP variante com câncer de pulmão.

Actualmente, sabemos muito pouco sobre os mecanismos moleculares de execução pelo

polimorfismos Musashi-1 | rs2522137 pode contribuir para o desenvolvimento do cancro do pulmão.

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é uma proteína de ligação de RNA evolutivamente conservada que tem profundas implicações em processos celulares, tais como manutenção de célula-tronco, desenvolvimento do sistema nervoso, e tumorigênese.

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é altamente expressa em muitos tipos de câncer, enquanto que em tecidos normais, a sua expressão é restrita apenas às células-tronco. É agora claro que esta proteína de ligação a ARN está envolvida na divisão celular assimétrica e é necessário para a manutenção de células estaminais identidade [43] – [45]. Curiosamente,

Musashi-1 | ARNm transcrito contém uma longa região não traduzida 3′-1811-pb (3′-UTR). A 3′-UTR dos transcritos de mRNA normalmente enterra o site alvo para microRNA regulamentar (miRNA). SNPs no extremo 3 ‘UTRs foram mostrados para ter efeitos funcionais sobre o controlo da estabilidade do ARNm e /ou a eficiência de tradução através da regulação da miARN. A ligação de miARNs para a extremidade 3 ‘UTRs pode desempenhar um papel geral importante na expressão do gene.

A 3’UTR do madura

Musashi-1 | mRNA é potencialmente importante de vários supressor tumoral miRNAs, incluindo miR-34a, -101, -128, -137 e -138 [46]. Além disso, o

Musashi-1 | mRNA 3′-UTR contém várias sequências dades e U-ricos que são direcionados por uma proteína de ligação de RNA evolutivamente conservada Hur [47]. Hur é um membro do HU /elav (visão anormal letal embrionário) familiar, que é altamente expresso em tecido do tumor e aumenta a tumorigénese através da interacção com um subconjunto dos ARNm que codificam as proteínas na regulação da proliferação celular, sobrevivência celular, angiogénese, invasão , e metástase [48], [49]. Usando o site da SNPinfo (https://snpinfo.niehs.nih.gov/), descobrimos que o

Musashi-1 | 3′-UTR também enterra locais alvo potenciais para miRNAs hsa-miR-1275, HSA -miR-1285, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-486-3p, hsa-miR-612 e miR-HSA-625. Vale a pena notar que o

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rs2522137 está localizado dentro destes miRNA e sítios de ligação Hur. Futuros estudos são necessários para delinear se as variantes rs2522137 pode afetar a ligação destes miRNAs reguladoras e proteínas Hur. Presumivelmente, a

Musashi-1 | rs2522137 variante GG pode interferir com a ligação de miRNAs e fator de Hur, aumentando assim a estabilidade da

Musashi-1 | mRNA. Se for verdade, este mecanismo poderia servir de base para as variações genéticas

Musashi-1 | rs2522137 variante para manter as células-tronco de câncer de pulmão auto-renovação.

SNPs representam hereditárias que ocorrem durante a vida de um Individual. É bem sabido que fatores de risco não-genéticos, como idade, história de doença pulmonar, e tabagismo também são muito importantes e podem ser combinados para desenvolver modelos baseados no risco de câncer. Robert et al [50], [51] sugeriram que SNPs precisa ser combinada com outras variáveis ​​de risco para identificar indivíduos que são mais suscetíveis a desenvolver câncer de pulmão. Do mesmo modo, o modelo de risco Liverpool Projecto pulmonar melhora a sua capacidade preditiva de cancro do pulmão através da adição de um marcador de SNP (rs663048) no gene SEZ6L [52], [53]. Neste estudo, identificaram uma correlação entre o cancro do pulmão e um SNP específica dentro de um gene marcador de CSC. fatores ambientais e de estilo de vida incluídos nesta análise, como a exposição ocupacional a pesticidas, exposição ocupacional a gasolina /diesel diagnóstico prévio de tuberculose pulmonar, e emissão de cozinhar, fornecer uma correlação relativa semelhante a uma população de controle pareados por idade.

em resumo, este estudo revelou um aumento significativo do risco de câncer de pulmão para o marcador CSC

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rs2522137-GG comparação com -TT e -TG SNPs em uma população chinesa. O ROC AUC do nosso modelo foi 0,7686, indicando o potencial para identificar indivíduos de alto risco na população chinesa, concentrando-se em informações que podem ser facilmente obtidos no contexto dos cuidados primários. Finalmente, este modelo de previsão de risco de câncer de pulmão discriminação entre indivíduos de alto e de baixo risco. Mais estudos são necessários em maiores coortes de casos e controles não selecionados para validar e extensão ainda mais estas observações iniciais.

Reconhecimentos

Agradecemos Li Deng de assistência técnica para a coleta de amostras e preparação, bem como Lina Jin e Hua Ele por sua ajuda em dados e análise estatística.