Abstract

Fundo

É controverso se microRNA-126 é um supressor tumoral ou oncogênicos miRNA. Mais experimentos são necessários para determinar se microRNA-126 está associada com o risco de câncer de pulmão de células não-pequenas e prognóstico.

Métodos

Sobre-expressão de microRNA-126 foi realizado para avaliar a invasão celular e crescimento do tumor no cancro do pulmão de células não pequenas linhas de células (NSCLC) e modelo de xenoenxerto de ratinho nu. experimentos de ganho de função e ensaios de luciferase foram realizados para revelar a relação entre microRNA-126 e percurso do sinal de PI3K-Akt em células A549. Foram analisadas as associações da expressão microRNA-126 entre as variantes genéticas dentro de microRNA-126 e informações clínicas, incluindo tabagismo, sexo, idade e tipo histológico e do estágio do tumor.

Resultados

Over -expression de microARN-126 em linhas celulares de NSCLC diminuição da proliferação celular in vitro e o crescimento do tumor no modelo de ratinho nu de xenoenxerto. E microARN-126 reprimiu a actividade de PI3K-Akt por segmentação sítios de ligação na região 3 ‘não traduzida do ARNm PI3KR2. O nível de expressão de microRNA-126 foi diminuída em linhas de NSCLC e tecidos tumorais. Os pacientes com baixa expressão microRNA-126 teve tempo significativamente pior sobrevivência do que aqueles com alta microRNA-126 de expressão (meios de tempo de sobrevivência (mês): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140, ​​

P

= 0,005). No entanto, não houve diferença significativa nos genótipos e alelos frequências da variante microRNA-126 (G A, rs4636297) entre os casos e controles (

P

= 0,366). Além disso, não houve associação entre rs4636297 SNP e tempo de sobrevida em pacientes com NSCLC (

P

= 0,992). E microRNA-126 expressão não apresentaram diferença significativa entre os três grupos de genótipos (

P

= 0,972).

Conclusões

Nossos dados indicam que microRNA-126 é um tumor- gene supressor em NSCLC e baixa expressão microRNA-126 é um fator prognóstico desfavorável em pacientes com NSCLC. No entanto, o mecanismo de regulação de microARN-126 continua a ser elucidado em diferentes tecidos normais e malignos. Portanto, são necessárias mais pesquisas para explorar as funções supressoras de tumor de microRNA-126 em NSCLC

Citation:. Yang J, Lan H, Huang X, Liu B, Tong Y (2012) MicroRNA-126 Inibe celular Tumor crescimento e sua expressão Nível correlaciona-se com pior sobrevida em não-pequenas células do pulmão pacientes com câncer. PLoS ONE 7 (8): e42978. doi: 10.1371 /journal.pone.0042978

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 07 de fevereiro de 2012; Aceito: 16 de julho de 2012; Publicação: 10 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (número de concessão 30.800.633) ea província de Sichuan Ciência e Tecnologia Fundação de Jovens (número de concessão 09ZQ026-034). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) continua a ser a principal causa de mortes relacionadas ao câncer no mundo, bem como na China [1]. Um grande número de genes envolvem em NSCLC tumorigênese, como

p53

,

Rb

, e

Ras

[2]. Um estudo mostra que a 98 de 186 microARNs estão em regiões genómicas ou associados ao cancro em locais frágeis [3]. Por exemplo, o miR-99a, deixou-7, o miR-125b-2 estão localizados em regiões sem deleção homozigótica genes supressores tumorais conhecidos de cancro do pulmão [3]. Vários microRNAs estão localizados perto de regiões de ponto de interrupção, incluindo miR-142 a 50 nucleótidos do t (8, 17) pausa envolvendo o cromossomo 17 e MYC [3]. Isto indica que microARNs pode desempenhar um papel crucial na tumorigénese e progressão do cancro [3]. Além disso, a expressão microARN perfis revela assinaturas características para diversos tipos de tumor e é um biomarcador de classificação de tumores, prognóstico, e os resultados terapêuticos [4] – [8].

MicroRNA-126 é mapeado para 9q34.3 cromossoma dentro do fator de crescimento epidérmico codificação de gene de acolhimento like-7 (

EGFL-7

). MicroRNA-126 é altamente expresso em tecidos de pulmão e coração, mas também expressa em níveis mais baixos no cérebro, fígado, rim e [9]. Os níveis de expressão elevados de expressão microRNA-126 é identificada nas células endoteliais, que tem um papel importante na regulação da angiogénese e a integridade dos vasos sanguíneos através da inibição da via VEGF. Knockdown de microARN-126 resultou em perda da integridade vascular e hemorragia durante o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra de [10] – [13]. Além disso, alguns estudos revelaram que microARN-126 reprimida a apoptose de células de leucemia mielóide aguda e melhorada a capacidade de formação de colónias de células progenitoras de medula óssea de ratinho através de segmentação polo-cinase como 2 (

PLK2

) [14]. Pelo contrário, outros estudos mostraram que microRNA-126 é muitas vezes referido gene supressor do tumor em vários cancros [15] – [21]. No cancro gástrico, a sobre-expressão de microARN-126 aumentou significativamente o crescimento de células dependentes de ancoragem, e independente de ancoragem, visando

SOX2

[16]. No cancro do cólon, microARN-126 suprime o crescimento de células tumorais por segmentação fosfatidilinositol 3-cinase beta subunidade reguladora (p85β) [19]. Alguns estudos também mostram que o microRNA-126 pode inibir a invasão e proliferação regulando

Crk

,

VEGF

, e

EGFL7

em NSCLC [15], [21], [ ,,,0],22]. Assim, as evidências atuais parecem apoiar uma estreita relação entre o crescimento do tumor microRNA-126 e. Além disso, em comparação com os pacientes que não respondem ao tratamento de primeira linha com capecitabina e oxaliplatina, o nível de expressão de microRNA-126 foi significativamente maior nos pacientes que responderam ao tratamento com a capecitabina e oxaliplatina [23]. Além disso, a proporção de microARN-126 /microARN-152 permitiu a detecção de cancro da bexiga urotelial (BCA) a partir de urina a uma especificidade de 82% e uma sensibilidade de 72% [24]. Com base nos relatórios anteriores, microRNA-126 pode ter valor possível preditiva e de diagnóstico para o câncer.

É controverso se microRNA-126 é um supressor tumoral ou oncogênicos miRNA. E o mecanismo de regulação de microRNA-126 continua a ser elucidado em diferentes tecidos normais e malignas [25]. Atualmente, mais experimentos são necessários para determinar se microRNA-126 está associado com não-pequenas risco de câncer de pulmão de células e prognóstico. Neste estudo, nós exploramos o papel de microRNA-126 em NSCLC e demonstrar que é um gene supressor de tumor e seu nível de expressão se correlaciona com pior sobrevida em pacientes com NSCLC.

Resultados

MicroRNA- 126 Inibe celular Invasion ensaio e Tumor Crescimento

Foi realizado um ensaio de invasão celular no A549 e SK-MES-1 células com vector pE-Mir126 ou pE-CMV vector de transfecção. Em comparação com o grupo de controlo, sobre-expressão de microARN-126 invasão celular auditivos, que é constituída com relatórios anteriores (Figura 1A). A proliferação celular foi reduzida em 47,91% (

P

= 0,0006) e 36,36% (

P

= 0,0018), quando as células respectivamente A549 e SK-MES-1 foram respectivamente tratados com microRNA-126 a sobre-expressão de 72 horas (Figura 1B). Para explorar ainda mais o efeito de microRNA-126 no crescimento do tumor, foi investigada a capacidade de microRNA-126 para suprimir o crescimento tumoral

in vivo

por injecção intratumoral de PE-Mir126 vector em A549 e SK-MES-1 xenotransplantes modelos de ratinhos nus. Como mostrado na Figura 1C, o crescimento de tumores foi observado a partir de 1 a 25 dias após a última injecção. O peso médio do tumor nos ratos tratados com PE-Mir126 vector no dia 25 após a última injecção foi de apenas cerca de uma metade do peso de tumor nos ratinhos tratados com PBS sozinho ou vector sozinho PE-CMV (Figura 1D). Todo o crescimento de tumores nos ratos tratados com PE-Mir126 vector foram significativamente suprimida em comparação com aqueles em ratos PBS-tratados e PE-Mir126 vector tratados.

(A) overe-xpression de microRNA-126 inibe a invasão celular em células A549 e SK-MES-1. Comparado com o grupo controle, a sobre-expressão de microRNA-126 invasão celular impaires. (B) MicroRNA-126 afecta a proliferação celular em células A549 e SK-MES-1. A proliferação celular foi drasticamente diminuída depois as células foram tratadas com microRNA-126 sobre-expressão de 72 horas. (C) A curva de crescimento do tumor

in vivo

por injecção intratumoral com microRNA-126. O crescimento de tumores foi observado a partir de 1 a 25 dias após a última injecção. (D) MicroRNA-126 inibe o crescimento de células A549 e células SK-MES-1 in vivo. O tumor média, apenas cerca de uma metade do peso tumores nos ratos tratados com PBS ou vector PE-CMV sozinho.

MicroRNA-126 inibe a proliferação celular do tumor, embora PI3K-Akt em NSCLC

para explorar o mecanismo molecular de microRNA-126 efeito anti-proliferativo em NSCLC, foram utilizados dois programas de acesso aberto (TargetScan e miRBase) para prever alvos de microRNA-126. Os locais de ligação previstos no 3’UTR de

PIK3R2

para microARN-126 são mostrados na Figura 2A. O ensaio repórter da luciferase indicaram que a actividade do repórter contendo o 3 ‘UTR de

gene PIK3R2

foi diminuída após a co-transfecção com PE-Mir126 vector (100,67 ± 4,51 5,86 ± vs.31.33,

P

0,0001), enquanto que a actividade de mutagénese dirigida ao local do repórter contendo o 3 ‘UTR de

gene PIK3R2

não foi obviamente alterada (104,00 ± 8,54 vs 98,33 ± 10,12,

P

= 0,484) (Figura 2B). Além disso, a análise por Western blot revelou que a expressão de PIK3R2 foi prejudicada por tratamento com vector de PE-Mir126 em A549 (0,97 ± 0,14 ± 0,07 vs.0.31, P = 0,002) e SK-MES-1, células (0,94 ± 0,13 vs. 0,45 ± 0,08,

P

= 0,005) (Figura 2C). Além disso, a transfecção do vector de PE-Mir126 em vez de PE-CMV vector reprimida significativamente Akt fosforilação sem alterar os níveis de expressão de proteína total de Akt (células A549, 0,89 ± 0,10 ± 0,04 vs.0.41, P = 0,002. SK-MES-1 células 0,88 ± 0,08 vs.0.47 ± 0,05

P

= 0,002) (Figura 2C).

(a) putativo microRNA-126 segmentação do site na 3’UTR de PIK3R2. A mutação foi gerado na sequência da 3’UTR PIK3R2 no local complementares para a região da semente de microARN-126 tal como indicado. (B) local de ligação MicroRNA-126 na 3’UTR de PIK3R2 foi avaliada usando o ensaio de repórter luciferase. A actividade de luciferase foi detectado por um luminómetro após a co-transfecção durante 48 horas. A actividade da luciferase de cada amostra foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. (C) MicroRNA-126 suprime a expressão PIK3R2 e fosforilação de Akt em células A549 e SK-MES-1. A proteína total foi isolado a partir de células tratadas com o vector PE-Mir126 ou PE-CMV vector durante 48 horas. PIK3R2 expressão e fosforilação de Akt foram analisadas por transferência de Western utilizando o anticorpo para P85β e fosfo-Akt (Ser473). (D) Os níveis de expressão e fosforilação de Akt PIK3R2 em tecidos NSCLC. Barra de escala, 10