Abstract

células epiteliais neoplásicas gerar os tipos mais agressivos de câncer, como os localizados na pulmão, da mama, do cólon, da próstata e do ovário. Durante a estágios avançados de cancro da próstata, células epiteliais estão associados ao aparecimento de tumores independente de androgénios, um fenótipo apoptótico-resistente que, em última análise overgrows e promove eventos metastáticos. Temos anteriormente identificada electrofisiologicamente e caracterizaram um novo Ca

2 + canal -permeable activadas durante a apoptose na linha celular de cancro epitelial de próstata independente de androgénios, LNCaP. Além disso, nós relatamos pela primeira vez, a clonagem e caracterização desta molécula tipo canal chamado apoptose regulada de proteínas 2 (Arp2) associado a um influxo letal de Ca

2 + em

Xenopus

oócitos. No presente estudo, as células LNCaP e células de ovário de hamster chinês (CHO) da linha celular transfectada com

arp2-

ADNc são induzidas a sofrer apoptose, mostrando um impacto importante sobre a viabilidade celular e activação das caspases 3 e 7, quando comparado com privadas de soro e células cultivadas ionomicina células tratadas. A localização subcelular de Arp2 em células CHO que sofrem apoptose foi estudada usando microscopia confocal. Embora a apoptose progride, Arp2 inicialmente localizada na região peri-nuclear de células migra com o tempo para a região da membrana de plasma. Com base nos nossos resultados e os de nossos estudos anteriores, o facto de Arp2 constitui um novo canal de catião é suportado. Portanto, torna-se Arp2 um alvo valioso para modular o fluxo e concentração de cálcio no citoplasma de células cancerosas epiteliais que mostram um fenótipo apoptótico resistente durante o aparecimento de um evento de apoptose

citação:. Mas-Oliva J., Navarro e -Vidal, Tapia-Vieyra JV (2014) Arp2, uma nova proteína pró-apoptóticos expressa em células epiteliais do cancro da próstata LNCaP e epitelial Ovário CHO células transformadas. PLoS ONE 9 (1): e86089. doi: 10.1371 /journal.pone.0086089

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 15 Março, 2013; Aceito: 11 de dezembro de 2013; Publicação: 22 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mas-Oliva et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por CONACyT (Grant 141.588) e DGAPA-UNAM (Grant IN-205711/2) atribuído a Jaime Mas-Oliva. Enrique Navarro-Vidal foi apoiado por bolsas do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, (CONACyT) (251040). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os carcinomas que têm a sua origem nas células epiteliais são o tipo mais comum de câncer em adultos e fazer até 80-90% de todos os cancros, incluindo aqueles localizados no pulmão, mama, próstata, ovário e cólon. As células epiteliais entre outras localizações, linha cavidades internas e formam o revestimento dos tecidos glandulares. A próstata é composta principalmente de células epiteliais e células do estroma intersticial que se comunicam entre si e de controlo, não só o desenvolvimento normal da glândula, mas também o início do crescimento neoplásico [1]. O câncer de próstata é um dos cânceres não-cutâneos mais frequentemente diagnosticados. As fases iniciais de progressão do cancro da próstata dependem andrógenos que aumentam a proliferação e inibir a apoptose. Portanto, a terapia de privação de androgénio tem sido o maior curso do tratamento no cancro da próstata recorrente e metastático. células da próstata epiteliais que são principalmente luminal incluir uma mistura de vários tipos de células, incluindo células basais e neuroendócrinos [2], [3], enquanto as células do estroma adjacentes, constituídos por uma mistura de fibroblastos, nervos e células do músculo liso [2], [ ,,,0],4], [5], intervir no desenvolvimento de células cancerosas epiteliais e afectar a sua resposta a hormonas [6]. Durante o processo de carcinogénese, embora o número de células neuroendócrinas aumenta nas fases mais avançadas de cancro da próstata, células epiteliais representam o principal tipo de células tumorais são na maior medida responsável pela proliferação de células-androgénio insensível [7]. Estas células apresentam um fenótipo apoptose-resistentes, não sofrem apoptose em resposta a estímulos fisiológicos [8], [9] e, portanto, não respondem a agentes quimioterápicos convencionais [10] – [13].

Enquanto isso, câncer epitelial de ovário, foi encontrada a ser o sexto tipo de câncer mais comum em mulheres com as maiores taxas sendo observado em países do norte da europa e nos EUA, ao passo que as menores taxas são encontradas no mundo em desenvolvimento. Devido ao facto de patogénese do cancro de ovário epitelial é mal compreendida, detecção precoce tem sido principalmente vencida e nova abordagens terapêuticas escassos. Dado que as células de cancro do ovário epiteliais também foram encontrados para exibir um fenótipo apoptose-resistentes devido à sobre-expressão de genes anti-apoptóticos tais como Bcl-2, Bcl-XL e Survivina [14], a descoberta e activação de novas vias pró-apoptóticos tem sido uma abordagem importante para controlar a proliferação e o crescimento deste tipo de célula transformado [15]

apoptose, um tipo de morte celular programada [16] -. [20], tem sido mostrado para ser de importância crítica em homeostase celular, desenvolvimento embrionário e várias doenças, tais como cancro [21], [22]. A apoptose é activada por mecanismos específicos do tipo de células [16], [22], e ocorre em várias fases [19], [21], [23], [24]. A primeira etapa está relacionada com a estímulos internos ou externos, ao passo que a segunda inclui mecanismos de transdução de sinal. A terceira fase é constituída por mecanismos de execução que envolvem a actividade proteolítica das caspases, uma base bioquímica para o fenótipo apoptótico [25] – [28], e, por fim, a quarta etapa, que corresponde a condensação da cromatina nuclear, a fragmentação nuclear e a fagocitose de corpos apoptóticos por macrófagos ou células [24], [29] vizinhos. Em geral, um aumento sustentado da [Ca

2 +] i foi mostrado para activar uma série de mecanismos citotóxicos associados a apoptose em tipos de células diferentes [30], [31]. Uma vez que a apoptose tem sido proposto para ser um mecanismo que regula o crescimento do tumor, a modulação da activação de mecanismos de apoptose, por conseguinte, tem sido considerado como um alvo valioso para controlar a proliferação e crescimento de células cancerosas epiteliais [32] – [36]. A este respeito, dependendo da condição da membrana plasmática de células transformadas e a quantidade de cálcio extracelular que entra no citoplasma, um bom equilíbrio é conseguido entre o aparecimento de um evento de apoptose e /ou a activação de uma via de morte necrótica [37 ], [38]

Em resposta a dois indutores diferentes de apoptose.; ionomicina e privação de soro, temos mostrado previamente com base nos achados eletrofisiológicos, a ativação de um Ca

2 + canal de cátion permeável, não selectiva em células epiteliais da próstata LNCaP [15]. Para investigar ainda mais estes resultados, uma série de Ca

2 + canais -permeable expressos durante a apoptose foram analisados ​​[15], [39] – [41]. Durante o curso desses estudos, dois cDNAs,

ARP1

e

Arp2, correspondentes a duas moléculas sintetizadas durante a apoptose induzida por privação de soro, foram clonados. Quando

Arp2

ARNm foi injectada

oócitos Xenopus laevis

, Arp2 expressão foi induzida seguida de um influxo de Ca

2 + através da membrana celular e a indução de apoptose [40].

Tendo em conta que a maioria das células epiteliais compartilham características organização do tecido, bem como mecanismos envolvidos na tumorig�ese [42], o presente estudo mostra que

Arp2

cDNA transfecção realizada utilizando as células cancerosas da próstata epiteliais originais (a linha celular de LNCaP) a partir do qual o canal de cálcio pró-apoptótica foi descrito, promove a morte celular por meio de um processo apoptótico quando a viabilidade celular e activação de caspases são medidos. A fim de tornar evidente que os mecanismos de iniciação e de habilitações apoptóticos são compartilhados por diversas células epiteliais, o nosso estudo foi estendido para a transfecção com

Arp2

cDNA de células de ovário transformado epiteliais (linha de células CHO). Os resultados apresentados no presente estudo apoiam as conclusões anteriores e realizar-se a noção de que Arp2, um novo canal de cálcio colocado na membrana plasmática das células durante um evento que pode comprometer a viabilidade celular e conduziria a apoptose, pode ser considerado como um novo e valioso alvo para controlar o crescimento dos tipos de células de cancro epiteliais mais agressivos.

Materiais e Métodos

Materiais

a linha de células de cancro da próstata insensível-androgénio humano, LNCaP, eo linha de células de ovário de hamster chinês, CHO (

Cricetulus griseus

), foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA), onde são regularmente verificada por meio de testes genotípicas e fenotípicas. linhas de células LNCaP original recebido a partir de ATCC incluídas células-andrógenos insensível sensível ao androgénio e. Durante o decurso da sua utilização ao longo dos anos, eles apresentam respostas diferenciadas para o crescimento, dependendo da presença ou ausência de análogos de androgénio. Todos os reagentes para meios de cultura celular foram obtidos a partir de Gibco BRL (Gaithersburg, MD, EUA). Os vectores que foram usados ​​incluíram: pcDNA3.1 /V5-His-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA ), e o vector pEGFP-N1 (Clontech, mountain View, CA, EUA). Lipofectamina e Fura-2 /AM foram recebidos a partir da Invitrogen /Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, EUA). Bis-acrilamida, Nonidet-P40, brometo de etídio, aprotinina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), benzamidina, dimetil sulfóxido (DMSO), ionomicina e ditiotreitol (DTT) foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO, EUA). R

Tth polimerase de ADN XL foi obtido a partir Sistemas Roche Molecular (Branchburg, NJ, EUA), e dNTPs de desoxirribonucleótidos foram obtidos de Boehringer Mannheim GmbH-(Mannheim, Alemanha).

construção de plasmídeo para Arp2 expressão

para a amplificação de

Arp2

ADNc, 20 picomolar de um iniciador de sentido directo (5′-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3 ‘) e um iniciador anti-sentido degenerados que corresponde a uma região conservada da família de Trp proteínas (5’-TGY-TCK-MGC-AAA-CCA-YTT-YTC-3 ‘) foram usadas [40], [43] – [45]. As reacções de PCR incluiu também 10 ng /mL linearizado de plasmídeo pCR-TOPO-4Blunt Arp2, 10 × tampão, 25 mM MgCl

2, e dNTP 10 mM. Foram realizados os seguintes ciclos: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 45 s, 65 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 2 minutos, e um ciclo final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram separados e visualizados em 1% w /v de géis de agarose contendo brometo de etídio, e as bandas foram excisadas e purificadas utilizando um sistema de extracção de gel Concerto (Gibco, Gaithersburg Maryland). Os produtos de PCR foram clonados no vector de 3,1 /V5-His-TOPO pcDNA em seguida propagado em

E. coli

DH5a células competentes (American Type Culture Collection, Manassas VA, EUA). O plasmídeo obtido foi denominado pcDNA3.1 Arp2 V5-His. O cDNA que codifica para a proteína verde fluorescente melhorada (

eGFP

) foi então inserido entre o

Xhol

e

Xbal

locais do pcDNA3.1 Arp2 V5-His plasmídeo, gerando deste modo o pcDNA3.1 Arp2 eGFP-V5-His plasmídeo.

cultura celular e transfecções para expressão transitória

andrógeno-insensível células LNCaP e células CHO foram cultivadas em meio RPMI 1640 e DMEM /F -12 médio, respectivamente. Estes meios de cultura também foram suplementadas com 10% v /v de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 0,2% w /v de bicarbonato de sódio, e 1% v /v de penicilina-estreptomicina. As culturas foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO

2 até que as células atingiram 60-70% de confluência. A apoptose foi induzida por células com meio de cultura privada de FBS durante diferentes períodos de tempo de incubação. Ionomicina foi preparado como soluções reserva 5 mM em DMSO. Ionomicina a uma concentração final de 10 uM foi aplicado a CHO e células LNCaP culturas e incubaram-se durante diferentes períodos de tempo. Ambas as linhas celulares foram transfectadas com pcDNA3.1 Arp2 V5-His (eficiências de transfecção: TE /LNCaP 32%; TE /CHO 46%) e pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

plasmídeos (TE /LNCaP 43%; TE /CHO 54%) para induzir expressão transitória de Arp2-V5 e V5 β-galactosidase, respectivamente. Para a normalização de ensaios de viabilidade celular, também ambas as linhas de células foram transfectadas com o plasmídeo pcDNA3.1 V5-His (sem

Arp2

ADNc) (TE /LNCaP 68%; TE /CHO 80%). as células CHO foram transfectadas com pEGFP-N1 (TE 82%) e pcDNA3.1-eGFP Arp2 V5-His plasmídeos (TE 50%) para se obter eGFP e expressão Arp2-EGFP, respectivamente. As transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 tal como descrito no pcDNA3.1 /V5-His TOPO TA Kit de Expressão de inserção a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA).

[Ca

2+] i medições em toda As suspensões de células usando Fura-2

andrógeno-insensível células LNCaP e células CHO cultivadas como descrito anteriormente, foram retirados discos de cultura usando tampão de colheita contendo 10 mM HEPES-tamponado com solução salina a 0,9% mais 0,05 de EDTA, pH 7,4 de acordo com a Hirst, et al. [46]. As células são colocadas em suspensão, e com base no mesmo método sedimentadas a 500 ×

g numa centrífuga

baixa velocidade durante 3-5 min e lavadas duas vezes com tampão HEPES de Krebs contendo Na 140 mM de

+, 4,7 mM K

+, Mg 1,3 mM

2 +, Cl 125 mM

-, HCO 25 mM

3, 1,2 mM H

2 PO?

4, 1,2 mM SO

4

2-, glucose 10 mM, EGTA 0,1 mM e HEPES 10 mM, pH 7,4. Os sobrenadantes foram removidos e os sedimentos ressuspensos com tampão de Krebs HEPES. Um Fura-2 /AM (3 uM) tempo de carregamento de 30 min foi levada a cabo usando tampão de Krebs HEPES a 37 ° C no escuro. Após este processo estiver concluído, as células foram sedimentadas a 500 ×

g

, ressuspensas em tampão HEPES de Krebs e ainda incubadas durante 20 min à temperatura ambiente para permitir a desesterificação de Fura-2 /AM.

Após o tratamento, as células foram duas vezes sedimentado em 500 ×

g Compra de 3 min e ressuspensas em Krebs HEPES-Ca

2 + tampão (EGTA omitindo e adicional de Ca 2,5 mM

2 + ). Fura-2 /AM foi preparado como uma solução-mãe (1 mM) por dissolução em dimetilsulfóxido e alíquotas (10 ul) armazenados a -20 ° C até ser necessário.

As suspensões de células foram mantidas em gelo e para cada experiência colocado em cuvetes de quartzo e incubou-se durante 2 min a 37 ° C antes das medições teve lugar. Um espectrofluorímetro SLM-Aminco (Rochester, NY), usando-se uma razão de excitação de 340/380 valores de emissão de fluorescência fura-2 nm e o máximo a 510 nm. A calibração de fluorescência foi realizada pela adição de 0,1% de Triton X-100 para produzir células de lise libertando Fura-2 para o Ca

2+ ou meio contendo EGTA. valores máximos e mínimos de fluorescência foram substituídos na Grynkiewicz, Poenie equação Tsien para calcular [Ca

2 +] i [47].

análise de Western blot

A expressão transitória de Arp2 e β-Gal foi conseguida em células LNCaP e células CHO por transfecção com

Arp2

cDNA e

lacZ

cDNA, respectivamente. Estas proteínas foram expressas como proteínas de fusão com o epitopo V5 no terminal carboxilo de cada (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram cultivadas durante 16, 24, 48, e 72 h, em seguida, colhidas e lisadas com o tampão seguinte: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 1 ug /mL de aprotinina, 1 mM PMSF , e benzamidina 5 mM. quantificação da proteína foi realizada utilizando um método de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA), e 20 ug de proteína total foram sujeitas a electroforese em géis de 10% SDS-PAGE. As proteínas foram subsequentemente electrotransferidas para 0,45 membranas de nitrocelulose (Trans-Blot de transferência médio Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), depois bloqueadas durante 1 h a 37 ° C com uma solução de “saturação” [solução salina tamponada com Tris (TBS) ( pH 7,6), Tris-HCl a 20 (pH 7,4), NaCl 100 mM, 0,1% v /v de Tween-20, e 2,5% w /v de leite desnatado]. anticorpo monoclonal anti-V5 primária (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi diluída na mesma solução de saturação (1:5000) e incubada com as membranas durante 12 h a 4 ° C. Depois as membranas foram lavadas três vezes com saturando solução a 37 ° C (15 min cada lavagem), as membranas foram incubadas a 37 ° C durante 2 h com o anticorpo secundário anti-rato (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) diluídos em solução de saturação ( 1:5000). Membranas foram então lavadas com TBS /0,1% v /v de Tween-20 três vezes durante 15 min a 37 ° C, seguido de uma quarta lavagem com TBS, a 37 ° C. O carregamento igual foi verificado por incubação das membranas com anticorpo anti-actina β (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Visualização de ligação do anticorpo foi conseguida usando um quimiluminescência aumentada (ECL) kit de detecção (Pierce, Rockford, IL, EUA) e exposição de membranas para filmes radiográficos (Kodak, Rochester, NY, EUA).

3- ( 4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT)

As células não tratadas foram mantidas em meio de cultura suplementado com soro (controlo negativo), enquanto que as células apoptóticas foram obtidos por soro privação (controlo positivo). As células (2 x 10

4 /poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços e mantidas em cultura durante 16, 24, 48, e 72 h. Em seguida, 30 uL da solução de MTT (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA) foi adicionado a cada poço para uma concentração final de 0,5 mg /mL de reagente. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 h para permitir que o crescimento de cristais de formazano, que foram subsequentemente solubilizadas com a adição de tampão de lise [SDS a 20%, 50% de N, N-dimetilformamida (pH 3,7)]. As placas foram incubadas durante 12 h, e os valores de absorvância foram medidas a 570 nm utilizando um leitor de microplacas. A viabilidade das células transfectadas com o plasmídeo pcDNA3.1-V5-His foi considerado para a normalização dos resultados de viabilidade de pcDNA3.1 Arp2 V5-His células transfectadas. Cada experiência foi repetida três vezes (n). -Atada dois do estudante

t-

teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças em matéria de controlos. Os dados são expressos como média ± SEM e X

P 0,05

foi considerado significativo. Símbolos indicam:

#

p Art 0,05, *

p Art 0,01,

¶

p Art 0,001

azul tripano a viabilidade celular ensaio

células LNCaP foram incubadas durante 16, 24, 48, 72, 96, e 120 horas, enquanto que as células CHO foram incubadas durante 16, 24, 48, e 72 h. As células foram coradas com 0,1% de corante azul v /v de tripano, em seguida, colocados em câmaras de Neubauer. Um total de 300 células foram contados para cada amostra usando um microscópio óptico de campo brilhante Motic. A viabilidade das células transfectadas com o plasmídeo pcDNA3.1-V5-His foi considerada para a normalização de pcDNA3.1 Arp2 V5-His células transfectadas. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes (n). -Atada dois do estudante

t-

teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças em matéria de controlos. Os dados são expressos como média ± SEM e X

P 0,05

foi considerado significativo. Símbolos indicam:

#

p Art 0,05, *

p Art 0,01,

¶

p Art 0,001

medições da actividade de caspases 3 e 7

células

CHO e LNCaP (3 × 10

5 /poço) foram semeadas e cultivadas durante 16, 24, 48 e 72 h. As células foram lavadas com PBS, colhidas e submetidas a quatro ciclos de congelamento-descongelamento em um tampão de lise (HEPES 10 mM (pH 7,0), 40 mM b-glicerofosfato, 50 mM de NaCl, 2 mM MgCl

2). As amostras foram centrifugadas durante 30 min a 15 800

X

g. A concentração de proteína para os sobrenadantes recolhidos foram determinados utilizando o método BCA (Pierce, Rockford, IL). As amostras (proteína total, 20 ug) foram diluídos em tampão de ensaio (HEPES 50 mM, sacarose a 10%, CHAPS a 0,1%, DTT a 10 mM) a um volume final de 1000 uL. O tampão de ensaio também foi suplementado com Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (Z-DEVD-AFC), um substrato fluorogénico de caspases 3 e 7, e as amostras foram incubadas durante 10 min a 30 ° C. A fluorescência foi medida de acordo com um protocolo de Molecular Probes utilizando um espectrómetro de luminescência. O comprimento de onda de excitação foi de 365 nm e o comprimento de onda de emissão foi de 505 nm. O comprimento de onda de absorvância máxima verificou-se ser 488 nm. A fluorescência foi medida em amostras em branco extracto isento de células, a fim de detectar a relação sinal-ruído das amostras. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes (n). -Atada dois do estudante

t-

teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças em matéria de controlos. Os dados são expressos como média ± SEM e X

P

0,05 foi considerado como significativo. Símbolos indicam:

#

p Art 0,05, *

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¶

p Art 0,001

a microscopia confocal e microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC)

As imagens confocais foram obtidas utilizando um 1000 de laser sistema de varredura confocal espectral Fluoview FV (Olympus Corporation, Tóquio, Japão) ligado /interface com uma Olympus IX81 invertido microscópio de luz com 10 × e 40 × objetivos de imersão em óleo. EGFP foi excitada a 488 nm, utilizando uma linha de crípton /árgon laser e fluorescência emitida detectada entre 515 nm e 540 nm, utilizando um filtro passa-banda. operação Laser foi realizada em baixa potência (97-99% de atenuação), que reduziu substancialmente a fotodegradação e photodamage aos espécimes. As imagens de microscopia DIC foram obtidas usando um microscópio Olympus IX81 e um condensador IX2-LWUCD com 10 × 40 × e objectivos. Confocal e DIC imagens foram visualizados, processados ​​e convertidos em TIFF formatado imagens usando o software 6.1 FV10-ASW (Olympus).

Resultados

expressão Arp2 e viabilidade celular em células LNCaP

Western blot mostram a expressão de Arp2-V5 em células LNCaP primeiro observado 16 horas após a transfecção, com os mais altos níveis de expressão detectada 72 h pós-transfecção (Figura 1A). Este ensaio mostra bandas com pesos moleculares inferiores a um para a proteína de fusão Arp2-V5 (54 kDa) detectado 24, 48, e 72 h pós-transfecção. Estas bandas são mais provavelmente relacionada com produtos de degradação de Arp2-V5 gerados durante a apoptose.

(A) Western blots detectada expressão de β-gal-V5 (112 kDa) e Arp2-V5 (54 kDa), no total, Os lisados ​​celulares. (B) a viabilidade celular Normalizada% de controlos foi avaliada utilizando ensaios de MTT com 2 × 10

4 células cultivadas na ausência de soro ou transfectadas com

Arp2

ADNc. Viabilidade destes dois grupos de tratamento foram ensaiadas a 16, 24, 48, e 72 h pontos temporais. (C) a viabilidade celular Normalizada% de controlos ensaiada utilizando um método de exclusão de azul de tripano. As células foram cultivadas na ausência de soro ou transfectada com

ADNc Arp2

e ensaiadas a 16, 24, 48, 72, 96, e 120 h pontos temporais. Os valores médios são apresentados (n = 3, X ± SEM),

#

p Art 0,05, *

p Art 0,01,

¶

p

. 0,001 comparado com os grupos de controlo

Normalizada viabilidade celular% de controlos de células de LNCaP em cultura na ausência de soro, bem como células LNCaP transfectadas com

Arp2

ADNc , foi medida usando ensaios MTT. A viabilidade celular foi observado para diminuir acentuadamente após 16 h, e uma diminuição adicional foi observada às 72 horas (Figura 1B). Uma diminuição ~63% na viabilidade das células foi observada em

Arp2

ADNc células transfectadas em 72 h, o que é superior em comparação com uma diminuição de ~ 23% da viabilidade de células de LNCaP em cultura na ausência de soro. Portanto, é muito provável que as células LNCaP andrógeno não-sensível, na ausência de soro de activar mecanismos apoptóticos tardiamente no que diz respeito a

Arp2

ADNc células transfectadas. Normalizado viabilidade celular% de controlos foi também avaliada usando o método de exclusão de azul de tripano. Uma ligeira diminuição na viabilidade foi detectada dentro das primeiras 24 h para ambas as condições experimentais (Figura 1C). A viabilidade celular diminuiu ainda mais para soro privados e

Arp2

células transfectadas com cDNA até 120 h, com uma diminuição de ~44% e ~42% da viabilidade celular, respectivamente.

expressão Arp2 e a viabilidade das células em células CHO

Western blot mostram a expressão de Arp2-V5 em células CHO detectado pela primeira vez em 16 h após transfecção, atingindo os níveis mais elevados 72 h pós-transfecção. Degradação de Arp2-V5 (54 kDa) mostrada por uma banda de peso molecular mais baixo detectado entre 48 e 72 h após a transfecção, sugere que o evento apoptótica também está a ocorrer neste tipo de células da mesma maneira como anteriormente mostrado para células LNCaP (figura 2A). É interessante notar que o atraso no aparecimento destes produtos de degradação quando as células CHO são comparados com células LNCaP, pode estar relacionada com o facto de que as células CHO constituem um excelente modelo para a expressão de proteínas heterólogo uma vez que a degradação da proteína é mantida a um mínimo.

(a) Western blots detectada expressão de β-gal-V5 (112 kDa) e Arp2-V5 (54 kDa) em lisados ​​de células totais. (B) a viabilidade celular Normalizada% de controlos foi avaliada utilizando ensaios de MTT com 2 × 10

4 células cultivadas na ausência de soro ou transfectadas com

Arp2

ADNc. Viabilidade destes dois grupos de tratamento foram ensaiadas a 16, 24, 48, e 72 h pontos temporais. (C) de células Normalizada viabilidade% dos controlos foi avaliada usando um método de exclusão de azul de tripano. As células foram cultivadas na ausência de soro ou transfectada com

ADNc Arp2

e ensaiadas a 16, 24, 48, e 72 h pontos temporais. Os valores médios são apresentados (n = 3, X ± SEM),

#

p Art 0,05, *

p Art 0,01,

¶

p

. 0.001, em comparação com grupos de controle

durante ensaios de viabilidade celular empregando redução do MTT, foi observada uma diminuição constante na viabilidade de células CHO entre 16 he 72 h de cultura. Às 72 horas, a viabilidade diminuiu ~44% para as células privadas de soro, enquanto que a viabilidade de

Arp2

células transfectadas com ADNc diminuiu ~51% (Figura 2B). Tripano ensaios de viabilidade celular azul não mostram alterações significativas em células CHO observado até 48 h após a privação de soro. No entanto, uma redução drástica na viabilidade foi detectada após incubação de 72 h, sugerindo que até este momento do evento apoptótica começou a afectar a integridade da membrana plasmática. Para

Arp2

células cDNA-transfectadas, foi observada uma diminuição gradual da viabilidade entre 16 e 72 h pós-transfecção. As percentagens de células viáveis ​​para ambos os grupos, às 72 horas eram muito semelhantes, com ~51% de viabilidade observada para as células privadas de soro e ~53% de viabilidade observados para

Arp2

células cDNA-transfectadas (Figura 2C). Por conseguinte, semelhante à de células LNCaP, o índice de morte celular em células CHO parece ser dependente do nível de expressão Arp2-V5. É interessante salientar que, no caso de

Arp2

ADNc células transfectadas em relação ao soro células necessitadas, diferenças obtidas entre os dois ensaios utilizados para avaliar a viabilidade celular são prováveis ​​relativas ao facto de que as vias metabólicas importantes associada a uma sobrecarga de cálcio intracelular e a perda da integridade organelo intracelular são afetados principalmente, antes da membrana celular torna-se danificado.

Fura-2 medida da citosólico livre Ca

2 + em células LNCaP e CHO

uma vez que a utilização de Fura-2 para medir alterações de cálcio intracelular utilizando suspensões de células inteiras tem sido um dos procedimentos mais bem sucedidos concebidas para esta finalidade, as suspensões de células LNCaP e CHO foram carregadas com fura-2 e [Ca

2 +] i medido. Como mostrado na Tabela 1, Fura-2 células de controlo carregados expostos a ionomicina (10 uM) na presença de um tampão contendo cálcio, produzido num curto período de tempo que um aumento na [Ca

2+] i. Curiosamente, LNCaP e CHO

Arp2

células -transfected também mostrou um aumento na [Ca

2 +] i demonstrando uma permeabilidade ao cálcio melhorado em comparação a controlar as linhas celulares. Embora as células incubadas na ausência de soro fetal de bovino foram também testados, a fuga de fura-2 células carregadas era importante e, portanto, diferenças entre experiências demasiado grandes para serem incluídos neste conjunto de resultados.

progressão Apoptose e ativação de caspases 3 e 7 em células CHO e LNCaP

As caspases 3 e 7 classificadas como caspases efetoras são ativadas por caspases 8 e 9 (também conhecidos como iniciadores). As caspases 3 e 7, também foram exibidas para contribuir durante a apoptose para a repartição de substratos, tais como proteínas, ácidos nucleicos e lípidos. A Figura 3 mostra os níveis de actividade detectados para as caspases 3 e 7. A linha de base representa a actividade de caspases em células não tratadas (controlo), uma vez que o processamento de amostras levou cerca de 30 minutos e um certo grau de activação da enzima é sempre detectado. Os dados são expressos como valores percentuais relativamente ao controlo positivo. Para as células CHO privadas de soro, foi detectada uma ativação gradual de caspases 3 e 7 entre 24 e 48 horas, com os mais altos níveis de ativação encontrado após 72 h e activação taxas de 75% acima dos controlos. Enquanto

Arp2

células CHO transfectadas com ADNc ou ionomicina (10 uM) de células CHO tratadas exibiram um aumento gradual da activação de caspase, o aumento observado entre as 24 e 72 h após a transfecção ou ionomicina tratamento foi menor do que os resultados obtidos com células CHO incubadas na ausência de soro nos mesmos pontos de tempo (Figura 3A). Curiosamente, a activação de caspases em células LNCaP cultivadas na ausência de soro,

Arp2

células transfectadas com ADNc, ou ionomicina células tratadas, mostraram o mesmo nível de activação, os resultados que se correlacionam bem com os dados de viabilidade acima. Estes resultados suportam o facto de novo que as células LNCaP parecem ser mais resistentes ao aparecimento de um evento de apoptose do que as células CHO (Figura 3B).

actividade de caspase foi determinada utilizando um ensaio fluorimétrico empregando Z-DEVD-AFC como um substrato. células CHO (A) cultivadas na ausência de soro, transfectada com

ADNc Arp2

ou incubadas com 10 pM de ionomicina ensaiadas a 16, 24, 48 e 72 h pontos temporais. células (B) LNCaP crescidas na ausência de soro, transfectadas com

Arp2

ADNc (72 h) ou incubadas com 10 pM de ionomicina ensaiadas a 16, 24, 48 e 72 h pontos temporais. Os valores médios são apresentados (n = 3, X ± SEM),

#

p Art 0,05, *

p Art 0,01,

¶

p

. 0.001 em comparação com grupos de controle

localização subcelular

para visualizar a localização subcelular de Arp2, a expressão de uma proteína de fusão eGFP-marcado com Arp2 na linha de células CHO através de transfecção com

Arp2 Restaurant –

egfp

cDNA e

egfp

cDNA (controle) foi estudada em 24 h pós-transfecção utilizando uma lente objetiva de 10 ×. Em comparação com E

GFP

ADNc transfectadas células CHO de controlo (Figura 4A),

Arp2-EGFP

ADNc células transfectadas exibiram um sinal fluorescente localizada em torno da membrana nuclear (Figura 4C). Os mesmos campos foram analisadas utilizando microscopia de DIC (Figura 4, B e D).