Abstract

A fusão do gene TMPRSS2-ERG é encontrada em aproximadamente metade de todos os cancros da próstata. O significado funcional e prognóstico de TMPRSS2-ERG é, no entanto, não é totalmente compreendido. Com base em uma coorte de espera vigilante histórico, foi identificada uma associação entre TMPRSS2-ERG, avaliada como coloração imunológica positiva, e menor sobrevida dos pacientes com câncer de próstata. Expressão de ERG também foi associada com marcadores clínicos tais como o estágio do tumor avançado, alta pontuação de Gleason, presença de marcadores de metástases e de células de tumor de prognóstico, como alta Ki67, pEGFR e pAkt. Novel associações entre TMPRSS2-ERG e alterações no estroma do tumor, por exemplo, o aumento da densidade vascular, hialuronano e PDGFRβ e diminuiu Caveolina-1, todos conhecida por estar associada com uma doença agressiva, foram encontrados. O presente estudo sugere que o gene de fusão TMPRSS2-ERG está associada com um fenótipo mais agressiva do cancro da próstata, suportado por mudanças no estroma tumoral

citação:. Hägglöf C, P Hammarsten, Strömvall K, L Egevad, Josefsson Um, Stattin P, et al. (2014) TMPRSS2-ERG Expressão Prevê Prostate Cancer Survival and Associates com estroma Biomarkers. PLoS ONE 9 (2): e86824. doi: 10.1371 /journal.pone.0086824

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 27 de setembro de 2013; Aceito: 15 de dezembro de 2013; Publicação: 05 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hägglöf et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O sueco Conselho de Pesquisa e Cancer Society sueco apoiou o trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fusão de genes recorrente entre o TMPRSS2 gene regulado por andrógeno e os membros da família do factor de transcrição ETS, mais comumente ERG, estão presentes em cerca de 50% dos casos de câncer de próstata [1]. A presença deste gene de fusão é um acontecimento crítico no desenvolvimento de cancro da próstata [2] – [4]. a expressão transgénica do gene de fusão no entanto, apenas resulta em lesões de PIN e alterações genéticas adicionais, tais como a perda de PTEN e activação da via PI3K, são necessários para provocar o cancro [5] – [8]. Os estudos experimentais sobre-expressam ou reprimir o gene de fusão sugerem que promove a capacidade de invasão de células tumorais e a proliferação de células [1]. Numerosos estudos avaliaram a associação de TMPRSS2-ERG e os resultados dos pacientes com câncer de próstata com resultados variados [1]. Uma análise cohort- e meta- grande recente no entanto indica que o status do gene de fusão não é um importante preditor de mortalidade por câncer de próstata ou de recorrência em pacientes tratados com prostatectomia radical [9]. Para nosso conhecimento, somente dois estudos examinaram o status de fusão genes em relação ao curso natural da doença em uma coorte espera vigilante. Em ambos os estudos presença da fusão TMPRSS2-ERG foi associada a um risco aumentado de morte por cancro da próstata [10], [11].

estado do gene de fusão é geralmente determinado por hibridação in situ fluorescente (FISH). Positivo epitelial ERG coloração imunológico, utilizando um anticorpo recentemente desenvolvido, é no entanto altamente correlacionados (sensibilidade 95,7% e 96,5% de especificidade) para a presença do gene de fusão TMPRSS2-ERG [12] – [15], sugerindo que a coloração imune pode ser uma forma prática para determinar a presença do gene de fusão TMPRSS2-ERG.

estudos recentes sugerem que a agressividade do tumor está relacionado com alterações no microambiente tumoral [16]. Em tumores de próstata do estroma é alterada em relação à agressividade do tumor [17]. Durante a progressão do tumor da próstata, células epiteliais de cancro envia sinais para o estroma circundante, o que, assim, adaptar-se às necessidades de crescimento do tumor. As células do estroma do tumor, por sua vez envia sinais de factores de crescimento para o epitélio [17]. Quando as células de cancro da próstata diferentes são incubadas em conjunto com fibroblastos normais, eles induzem alterações entre os fibroblastos que são do tumor da linha de células específica [18]. Se isso ocorrer, também

in vivo

poderia sugerir que o gene de fusão positivos e negativos tumores podem mostrar diferenças no estroma tumoral. Isto tem, no entanto, o nosso conhecimento nunca foi examinado. Se este era o caso que poderia nos ajudar a identificar os sinais em grande parte desconhecidos que determina o desenvolvimento de um estroma tumoral associado com doença agressiva.

Neste estudo, portanto, analisou uma coorte histórica de cancros da próstata RTU-diagnosticados gestão por vigilante espera pelo ERG imunocoloração, a fim de explorar a possibilidade de coloração ERG foi associada com outras características do tumor e resultado a longo prazo e, em especial se for associado com diferenças na morfologia estroma tumoral.

Resultados

expressão heterogênea de TMPRSS2-ERG no tecido da amostra a partir de diferentes focos tumorais

Para esclarecer o papel de TMPRSS2-ERG no câncer de próstata, um material contendo TMA de pacientes com cancro da próstata 350 das quais 256 foram tratados com a espera vigilante, foi analisada com ERG imuno-histoquímica (IHC). A TMA continha 5-8 amostras de tecido tumoral e 4 amostras de tecido não-maligno de diferentes locais na próstata do mesmo paciente. tumor nuclear ERG coloração foi observada em 34% dos pacientes. Como mostrado anteriormente, a expressão do ERG por vezes variar quando se comparam diferentes focos do tumor do mesmo doente. ERG coloração heterogénea foi observada em 18% dos pacientes. Em algumas pacientes (6%) do ERG expressão citoplasmática foi encontrado no tecido não maligno epitelial. Em todos os pacientes células endoteliais coradas positivo para ERG e isso serviu como um controlo positivo interno.

TMPRSS2-ERG está associada com marcadores prognósticos

histológica

A relação de expressão TMPRSS2-ERG para já estabelecidos e marcadores prognósticos clínicos foram analisados. Expressão de ERG em pelo menos um núcleo do tumor foi significativamente correlacionada positivamente com o estágio do tumor avançado, alta pontuação de Gleason e presença de metástase. Além disso, a expressão do ERG foi também associado com marcadores de células epiteliais de tumor, tais como a proliferação celular elevada (Ki67) [19], pAKT [20] e expressão pEGFR [21], todos conhecidos por estar relacionado com mau resultado (Tabela 1 e 2) . Estas experiências sugerem que TMPRSS2-ERG está relacionada a fatores conhecidos para indicar mau prognóstico para pacientes de câncer de próstata.

TMPRSS2-ERG se correlaciona com a sobrevida específica por câncer

Para avaliar o significado clínico da TMPRSS2-ERG nesta coorte de pacientes acompanhados com a espera vigilante, foi realizada análise de sobrevivência com a Kaplan-Meier. A análise mostrou que os pacientes com tumores que expressam ERG apresentaram uma sobrevida significativamente reduzida em comparação com pacientes com tumores sem ERG coloração (Figura 1 A). Além disso, os tumores que expressam ERG em pacientes com Gleason 6 ou 7 tumores tinham significativamente mais curta sobrevivência específico do cancro do que aqueles com tumores sem expressão de ERG (Figura 1 B). A diferença na sobrevida entre os grupos com tumores que expressam ERG também foi visto em pacientes com Gleason score 8-10 tumores (Figura 1 C). Os tumores que expressam ERG foi associado com um aumento do risco relativo para a morte específico do cancro da próstata numa análise de regressão de Cox univariada (Tabela 3). Na análise de regressão multivariada de Cox incluindo o marcador estabelecida prognóstico marcar Gleason e estágio do tumor local, presença de TMPRSS2-ERG no tumor foi significativamente associada com mau prognóstico e deu informação prognóstica adicional (Tabela 4).

Os pacientes são separados em dois grupos em função da presença da expressão do ERG (linha a tracejado) ou na ausência de expressão do ERG (linha a cheio) em todos os doentes (a), os pacientes com Gleason 6 (B), e pacientes com Gleason 8-10 (C).

Quando os pacientes foram analisados ​​em 3 grupos, ERG-, ERG + e ERG heterogênea (h) em Kaplan-Meier, ERG- teve o prognóstico mais favorável, melhor do que ergh e ERG +, que tinham prognóstico semelhante (dados não mostrados).

TMPRSS2-ERG está associada a alterações do estroma

O TMA foram anteriormente empregue para identificar um número de marcadores de prognóstico. fatores estromais no câncer de próstata que previamente identificados como associados à sobrevida de pacientes com câncer de próstata neste TMA são PDGFRβ [22], ácido hialurônico [23], (Scherdin et al, não publicado) do receptor de andrógeno Caveolina-1 [24], mastócitos [ ,,,0],25] e von Willebrand factor de [19]. Curiosamente, TMPRSS2-ERG foi encontrado para ser associado a todos estes factores, excepto as células AR e mastócitos. Nestes estudos relatam que a expressão elevada do estroma de PDGFRβ e hialuronano, tanto no estroma do tumor e no estroma do tecido não maligno circundante, foi associada a um resultado fraco de doentes de cancro da próstata. Além disso, a densidade de vasos elevada (medida como expressão do factor de von Willebrand) e a diminuição da expressão do estroma tumoral de Caveolina-1 estava relacionada com mau prognóstico. TMPRSS2-ERG foi encontrado para associar com esses fatores de maneira prevendo um mau resultado do paciente (expressão do estroma tumoral elevada de PDGFRβ, ácido hialurônico, fator de von Willebrand e baixa expressão do estroma de Caveolina-1) (Tabela 5 e 6). Estes resultados indicam que a presença de TMPRSS2-ERG está relacionado com fenótipos estromais associadas com mau prognóstico de pacientes com câncer de próstata.

Discussão

No presente estudo, TMPRSS2-ERG foi encontrado para ser associado com um número de parâmetros clínicos, incluindo a sobrevivência, em um grupo de pacientes com gestão espera vigilante. Além disso, as associações entre o status do gene de fusão e genes estromais que foram previamente identificados como biomarcadores com informações de prognóstico no câncer de próstata também foram identificados.

biomarcadores para diagnosticar câncer de próstata e prever o resultado do câncer de próstata não têm suficiente especificidade e sensibilidade e gera problemas com o tratamento excessivo e overdetection [26]. Novos e melhores marcadores prognósticos para classificar os pacientes que necessitam de tratamento do câncer de próstata é urgentemente garantido. A utilidade de TMPRSS2-ERG como um marcador de prognóstico para o câncer de próstata tem sido fortemente estudada com resultados diferentes. No entanto, é cada vez mais claro que, em pacientes tratados com prostatectomia radical, TMPRSS2-ERG fusion não tem um grande impacto sobre o resultado do paciente [9]. Nomeadamente todos os estudos, examinando o resultado após a espera vigilante (a causa natural da doença) achar que TMPRSS2-ERG está associada a um mau resultado. O câncer de próstata é geralmente multifocal e em cerca de 30% dos homens com câncer de próstata suas próstatas abrigar dois tumores positivos e negativos de genes de fusão de genes de fusão [27], [28]. Em tais casos é geralmente o foco positivo gene de fusão que forma metástases nos nódulos linfáticos e no presente estudo foi associado com a presença de metástases ósseas no momento do diagnóstico [27]. Hipoteticamente, a presença do gene de fusão dá um cancro mais agressivo apenas quando os pacientes são deixados sem tratamento, possivelmente, uma vez que o tumor necessita de tempo para adquirir alterações genéticas adicionais, tais como a perda de PTEN [7], para ser capaz de formar metástases macroscópicas.

materiais de tecido geradas com a RTU pode conter uma sobre-representação de tumores zona de transição e uma vez que os cancros da próstata provenientes da zona de transição são conhecidos por serem biologicamente diferente da zona periférica os tumores isso poderia influenciar o efeito do ERG sobre-expressão [29], [30 ]. A menor freqüência de TMPRSS2-ERG no presente estudo (34%), em comparação com cerca de 50% em coortes de prostatectomia radical também pode ser explicado pela coorte paciente (o gene de fusão é menos frequente em tumores zona de transição) e está em linha com o que outros materiais visto em TURP [9].

a verificação de que a expressão do gene de fusão-TMPRSS2-ERG em células epiteliais está relacionada com alterações estromais é nova e interessante. O microambiente do tumor, o que é moldada pela comunicação bidirecional entre células epiteliais de câncer e seu estroma circundante, está envolvida em todas as fases de progressão do cancro, contém informações de prognóstico e afetam a resposta ao tratamento [31] – [33]. Curiosamente, e em conformidade com as presentes descobertas em cancro da próstata, cancro da mama diferentes subtipos, com base na sua expressão de estrogénio e progesterona HER2-receptores no epitélio, dá origem a células do estroma com diferentes padrões de expressão de genes e capacidade variável para suportar migração de células de cancro [34]. Todas as alterações estromais que foram encontrados para associar a expressão epitelial do ERG estão relacionadas com o cancro mais agressivo. Low estromal Caveolina-1 correlaciona com a sobrevida livre de recidiva reduzida em pacientes com câncer de próstata e ativação da Akt [35]. Da mesma forma, o aumento dos níveis de PDGFRβ e ácido hialurônico em estroma tumor da próstata e circundantes associados estroma não malignas com mau prognóstico de pacientes com câncer de próstata e injeção de ácido hialurônico na próstata aumentar o crescimento do câncer de próstata em um modelo de rato ortotópico [22], [23]. A angiogénese é crítico para a progressão do cancro da próstata, e a presença do gene de fusão foi associado com o aumento da densidade vascular. Para investigar mais profundamente se e de que forma as células que expressam o gene de fusão TMPRSS2-ERG é capaz de alterar o microambiente tumoral e torná-lo mais hospitaleiro para as células tumorais, acrescentaria informações importantes sobre como TMPRSS2-ERG contribui para a biologia do cancro da próstata. Notavelmente, há também mudanças no estroma tumoral relacionada com a agressividade do tumor (por exemplo, diminuição do número de expressão do receptor e mastócitos andrógenos), que são aparentemente sem relação com epiteliais estatuto ERG. As células que transportam o gene de fusão são conhecidas por terem um padrão de expressão de genes específicos [36] e pode ser possível encontrar factores-chave, que altera o estroma num tumor promovendo maneira, um efeito que, aparentemente aumenta a agressividade de tumores de todos os graus de Gleason.

Conclusões

Nesta coorte, TMPRSS2-ERG foi encontrado para associar com um número de parâmetros clínicos, incluindo a sobrevivência, relacionados com mau resultado. Isto confirma os resultados anteriores mostram que a presença do gene de fusão dá uma doença mais agressivo em pacientes não tratada. associações Além disso, este estudo identificou entre as mudanças do estroma, TMPRSS2-ERG e previamente identificados como biomarcadores que predizem um pior prognóstico de pacientes com câncer de próstata. Isto pode indicar que o fenótipo mais agressivo que surge com a presença de TMPRSS2-ERG, pelo menos em parte é causado por alterações no estroma do tumor.

Materiais e Métodos

Tissue microarrays

as amostras de tecidos foram coletadas de pacientes que foram submetidos à ressecção transuretral da próstata (RTU) no hospital em Västerås, Suécia, entre 1975 e 1991. o câncer de próstata foi detectado por análise histológica. idade média no momento do diagnóstico foi de 74 anos (intervalo 51-95 anos). Informações relativas presença de hiperplasia benigna da próstata não estava disponível. As amostras de tecido foram fixadas em formalina, embebidos em parafina e reclassificação de acordo com o sistema de Gleason por um patologista em consonância com as recomendações ISUP [37]. As amostras de tecido foram utilizadas para a construção de um tecido de micro matriz (TMA) utilizando um instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EUA). As extremidades dos fragmentos de tecido foram evitados para evitar os efeitos de produtos químicos e dispositivos cirúrgicos utilizados durante o procedimento de ressecção transuretral da próstata. A TMA: s continha 5-8 amostras de tecido de tumor que representa tanto o primário e secundário de Gleason e 4 amostras de tecido não-maligno de cada paciente. Os pacientes não receberam terapia anti-câncer antes RTU. cintilografia óssea foi conseguida após o diagnóstico para a detecção de metástases. 350 pacientes foram incluídos no estudo, dos quais 256 pacientes foram acompanhados com a espera vigilante após RTU. Na sintomas de pacientes com metástases receberam tratamento paliativo com a ablação do andrógeno e em uma terapia de radiação alguns casos ou terapia com estrógeno, de acordo com as tradições de terapia na Suécia durante esse tempo. Além disso, 94 doentes que foram tratados com o tratamento paliativo imediatamente após o diagnóstico foram incluídos na análise. Os pacientes tratados não foram incluídos na análise de sobrevivência. A sobrevida global mediana para o grupo de pacientes seguido com espera vigilante foi de 5,9 anos. 80 das amostras de tecidos foram classificadas como Gleason score 4-5, 71 pacientes como marcar Gleason 6, 44 pacientes tiveram escore de Gleason 7 e 61 pacientes Gleason score 8-10. 1 paciente (0,4%) com escore de Gleason 7 e 8 pacientes (3,1%) com escore de Gleason 8-10 tinha metástases ósseas no momento do diagnóstico. Em agosto de 2003, 26 pacientes (10,2%) ainda estavam vivos, 65 pacientes (25,4%) tinham morrido de câncer de próstata e 165 pacientes (64,5%) tinham morrido por outras causas.

Fatores de potencial significado prognóstico, tais como pontuação de Gleason, o volume do tumor, estágio do tumor, célula tumoral expressão Ki67, pAKT e Perg, bem como fatores estromais, como receptor de andrógeno, mastócitos, PDGFRβ, ácido hialurônico, Caveolina-1 e fator de von Willebrand já tinham sido analisados ​​no material e poderia ser utilizado no presente estudo (para referências ver acima).

Ética declaração

o material foi coletado de acordo com os regulamentos suecos numa altura em que o consentimento informado não era necessária. O comitê de ética de pesquisa da Umeå University Hospital (Ethical Review Board Regional em Umeå) aprovou o estudo e dispensou a necessidade de consentimento.

Imunohistoquímica

As secções de tecido foram desparafinados e reidratadas em xileno, 99 % de etanol, 96% de etanol, 70% de etanol (3 x 5 min em muito passo), e, em seguida, lavado em água destilada. O antigénio foi recuperado em Tris /EDTA (pH 9), durante 1 h numa panela de pressão. As secções foram, em seguida, deixou-se arrefecer durante 5 minutos num banho de água antes de ser lavado em primeiro lugar água destilada e depois TBS durante 20 min. O resto do processo de imuno-histoquímica foi realizada num instrumento intelliPATH FLX (Biocare médica, Concord, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. ERG anticorpo (CM421A, Biocare Médico) foi diluída em Renoir vermelho (01:50). Mach 3 do rato HRP-polímero (Biocare Médico) foi usada para a detecção. Na análise de correlação as amostras foram pontuadas como positivas para TMPRSS2-ERG se a fluorescência foi detectada em pelo menos um dos núcleos de tumor.

Estatísticas

Correlações entre variáveis ​​nominais e as variáveis ​​contínuas eram analisadas utilizando o teste de correlação tau b da Kendall. Os dados utilizados na análise de correlação foi coletada no momento do diagnóstico de câncer de próstata. Os pacientes incluídos na sobrevivência analisa com a regressão de Kaplan-Meier e Cox foram seguidas com a espera vigilante. A duração da sobrevida livre de eventos (EFS) é definido como o tempo desde a RTU até a data de morte por câncer de próstata, a morte de outras causas, ou se nenhuma morte ocorreu, até a data do último seguimento. Diferenças nos resultados entre os grupos foram testadas com o teste de log-rank. A relevância prognóstica de TMPRSS2-ERG imunorreatividade foi examinado por análise de regressão Cox sozinho e em conjunto com escore de Gleason e estágio do tumor e local. O nível de significância estatística foi definido como

P Art 0,05 (frente e verso). A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 21.0.0 para Mac OS X (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Agradecimentos

Os autores agradecem Pernilla Andersson e Birgitta Ekblom no Departamento de Biociências de Medicina da Universidade Umeå para a assistência técnica hábil.