Abstract

Objectivo

para mapear de forma abrangente o estado de metilação do locais CpG dentro da região longa de controle do HPV16 (LCR) em células de câncer de HPV-positivos, e para continuar a explorar os efeitos do estado de metilação de HPV16 LCR na bioatividade celular e expressão E6 e E7. Além disso, para analisar o estado de metilação do LCR em pacientes HPV-positivos carcinoma de células escamosas da orofaringe (OPSCC).

métodos e materiais

Os padrões de metilação de HPV16 LCR em UM-SCC47, CaSki e células SiHa e espécimes OPSCC HPV16-positiive foram detectados por sequenciação de bissulfito-PCR e clonagem TA. Para as células tratadas com 5-aza-2′-desoxicitidina e E6 e E7 knockdown, MTS e coloração com azul de tripano, anexina-V e coloração com 7-AAD, e iodeto de prodidium foram usadas para avaliar o crescimento celular e a proliferação celular, apoptose celular, e paragem do ciclo celular, respectivamente. expressão E6 e E7 mRNA e proteína foram analisados ​​por quantitativa PCR em tempo real e imunohistoquímica, respectivamente.

Resultados

status de hipermetilação do LCR na UM-SCC47 (79,8%) e células CaSki ( foram observados 90,0%) e unmethylation estado da LCR em células SiHa (0%). Após desmetilação, as células com diferentes níveis de metilação responderam de forma diferente durante o crescimento, a apoptose, e a paragem do ciclo celular, bem como em termos da sua expressão E6 e E7. Em pacientes OPSCC HPV16-positiva, as taxas de metilação foi de 9,5% na região inteira LCR, 13,9% no 5′-LCR, 6,0% como promotor de E6 e 9,5% no promotor de p97, e a hipermetilação do promotor de p97 foi encontrado em um subconjunto de casos (20,0%, 2/10).

Conclusões

o nosso estudo revelou dois níveis de metilação diferentes da LCR em células cancerosas HPV16-positivos e pacientes OPSCC, o que pode representar diferentes mecanismos de carcinogênese de células cancerígenas HPV-positivos. Desmetilantes os meCpGs em HPV16 LCR pode ser um alvo potencial para um subgrupo de pacientes HPV16 positiva com cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas

Citation:. Zhang C, Deng Z, X Pan, Uehara T, Suzuki M, Xie M (2015) Efeitos da metilação Estatuto dos Sites CpG dentro da longo Região Controle HPV16 em HPV16-positiva Head and Neck Cancer Cells. PLoS ONE 10 (10): e0141245. doi: 10.1371 /journal.pone.0141245

editor: Scott M. Langevin, da Universidade de Cincinnati College of Medicine, United States |

Recebido: 05 de maio de 2015; Aceito: 05 de outubro de 2015; Publicação: 28 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China, (81372477 a MX); (https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/), a Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (KAKENHI 26.462.610 para MS e KAKENHI 26.462.611 para ZD); (https://www.jsps.go.jp/english/), o Fundo de Investigação Especializada para o Programa de Doutorado do Ensino Superior, China (20114433110001 de MX); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm), a Fundação de Ciência Natural da província de Guangdong, China (2014A030310411 para ZD); (https://www.gdstc.gov. cn /eng /mission.html) e uma subvenção do Centro de Tecnologia de Desenvolvimento das Ciências e do Ministério da Educação da China (20134433120021 para ZD); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a infecção persistente por papilomavírus humano de alto risco (HPV) foi estabelecido como um fator etiológico, além de consumo excessivo de tabaco e álcool para a cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) [1-4]. Isso se aplica a carcinoma de células escamosas da orofaringe (OPSCC), em particular; 50-70% dos pacientes OPSCC estão infectados com HPV16 [2-7]. E6 e E7 são os dois principais oncoproteínas virais responsáveis ​​pela manutenção da transformação maligna mediada por HPV através das suas interacções com várias proteínas celulares importantes, tais como p53 e pRb [8,9]. proteína E2 podem contribuir para vários processos biológicos, incluindo a transcrição viral e da replicação do ADN virai [10-13], e induzem a paragem do crescimento e apoptose celular, através dos seus efeitos sobre a expressão de E6 e E7 e outras proteínas virais [14-16]. Todas estas actividades são de E2 dependente da sua capacidade para se ligar ao genoma do DNA viral, especialmente o promotor precoce p97 em locais específicos de ligação de E2 (E2BSs) localizada dentro da região de controlo longa (LCR) do genoma de HPV [15,17] . O potenciador, localizado na extremidade 5 ‘do promotor de p97, também contribui para a regulação de expressão de E6 e E7 [12].

Estudos anteriores demonstraram a integração do genoma virai no genoma do hospedeiro é frequentemente associada com a interrupção do gene E2, levando à expressão descontrolada de E6 e E7 oncoproteínas [15,18,19], Wilson et al encontraram enriquecimento significativo de potenciais locais de integração dentro da região E2, sugerindo que E2 foi também uma localização comum de perturbação na integração no genoma do hospedeiro para CECP [19]. No entanto, uma série de estudos demonstrou que muitos carcinomas malignos associados ao HPV falta integradas cópias do genoma viral ou incluem genomas virais acompanhados de genomas virais integrados epissomais. Mesmo se alguns genomas virais são totalmente integrados, o gene E2 podem ser múltiplas cópias intactas e do genoma de HPV são retidas em matrizes em tandem, também chamado “concatemeros”, tais como a linha de células CaSki infectados com HPV16 [20]. Assim, têm sido feitas tentativas para compreender outros mecanismos, incluindo a metilação ou sequência variações no LCR, que regulam a expressão de E6 e E7 [7,21,22].

metilação do DNA refere-se à transferência de um grupo metilo de resíduos de citosina que normalmente leva à silenciamento gênico por qualquer inibição fisicamente a ligação de factores de transcrição ou estrutura da cromatina remodelação [15,23]. O estado de metilação do genoma de HPV16, que contém 15 locais dinucleótido CpG no LCR, em linhas celulares de cancro cervical e amostras clínicas, foi analisado, mas os papéis de HPV metilação do genoma na carcinogénese permanecem incertos [24-29]. O aumento da metilação do genoma do HPV foi encontrado de forma consistente na maioria dos locais no carcinoma do colo do útero ou de alto grau de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) em comparação com baixo grau CIN [24,25]. A metilação do genoma de HPV tem emergido como um biomarcador para a progressão do cancro no cancro cervical [15,24,30,31]. Além disso, alguns pesquisadores relataram que o status de hipometilação de células CaSki induzida por um inibidor de metilação do DNA reduziu a viabilidade celular, mas não afetou a bioactividade em células HeLa contendo uma totalmente não metilado HPV-18 genoma [27], que nos inspirou a explorar os potenciais efeitos novos do estado de metilação HPV nos cancros HPV-positivos.

Até o momento, no entanto, não há informações sobre os efeitos da variação metilação e seu mecanismo de regulação em células de CECP. Além disso, uma vez que metilado CpG (meCpG) é potencialmente reversível, desmetilar os meCpGs do genoma de HPV pode ser um alvo valioso para a terapia do cancro. Para preencher esta lacuna no conhecimento, utilizamos as células CECP pela primeira vez para mapear de forma abrangente o estado de metilação dos locais CpG dentro do LCR, e para continuar a explorar os efeitos da demetilação HPV16 LCR em bioatividade celular e E6 e E7 expressão. Além disso, muito poucos estudos examinaram amostras de CECP e seus resultados são inconsistentes [19,32,33]; Portanto, mostrou o estado de metilação do LCR em doentes OPSCC HPV-positivos.

Materiais e Métodos

cultura celular e 5-aza-2′-desoxicitidina tratamento (5-aza-DC)

A linha de células de CECP uM-SCC47, que foi desenvolvido a partir de um paciente com câncer de língua laterais [34] (um presente do professor Thomas E. Carey, da Universidade de Michigan), e as linhas celulares de cancro do colo do útero CaSki ( ECACC, Salisbury, Reino Unido) e SiHa (ATCC, Tóquio, Japão) foram caracterizados neste estudo (Tabela 1). Um genoma de HPV16 foi detectada integrado nas linhas celulares de UM-SCC47, CaSki e SiHa, as quais contêm 15, 600, e 1-2 cópias do genoma de HPV16, respectivamente [35,36]. As células foram cultivadas em RPMI1640 (para UM-SCC47 e CaSki) ou EMEM (por SiHa) contendo soro fetal bovino a 10% e 100 UI /mL de penicilina /estreptomicina. O reagente de desmetilação 5-aza-DC (Sigma, St. Louis, MO) foi dissolvido em DMSO a 50 mM e armazenada em alíquotas a -80 ° C até à sua utilização. Exponencialmente as células em crescimento foram tratadas com 5-aza-DC em diferentes concentrações (0,1-5 jiM) para 72-120 h. O meio de cultura contendo recém-preparado 5-aza-dc foi substituída a cada 24 h.

espécimes clínicos

Os tecidos tumorais foram coletadas de pacientes atendidos no Departamento de Otorrinolaringologia, Cabeça e Neck Surgery, University of Ryukyus entre Dezembro de 2008 e Maio de 2011. o comitê de ética da Universidade do Ryukyus especificamente aprovou este estudo e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. infecção por HPV 16 foi determinada por amplificação por PCR e sequenciação conforme relatado anteriormente [5,37]. Espécimes de 10 pacientes OPSCC representativos com infecção HPV16 foram investigados neste estudo (Tabela 2).

modificação bissulfito, amplificação por PCR, clonagem TA, e sequenciamento de DNA

extração de DNA a partir de células e amostras de tecidos foi realizada utilizando um Kit de purificação Gentra tecidual (Qiagen, Valencia, CA) tal como anteriormente relatado [5], em seguida, o ADN (1-2? g) foi convertido bissulfito-usando um EpiTect

® plus kit de bissulfito (QIAGEN, Valência, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

o DNA modificado foi amplificado em 3 produtos de amplificação por PCR (BSP) ensaios primer-sequenciação bissulfito e denominado BSP-1, 2-BSP, e BSP-3 (S1 Mesa). Para algumas amostras de tecido que foram negativos na amplificação por PCR utilizando o iniciador UM-SCC47 e define BSP-1 ou BSP-2, adotamos a cartilha define BSP-5 e BSP-6 em vez (S1 Tabela). A BSP foi realizada num volume de 25 uL contendo 0,2 mM de cada um dos 4 dNTPs, MgCl 2 mM de

2, 10 pmol de cada iniciador, 1,25 unidades de AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), e 300 ng de ADN com bissulfito-modificado. As condições BSP foram de 95 ° C durante 5 min, seguido de 45 ciclos a 95 ° C durante 1 min, 54 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 2 minutos, com uma extensão final a 72 ° C durante 7 min. Como relatado anteriormente [5], produtos de PCR foram purificados através de um assistente

® SV Gel e PCR Sistema Clean-Up (Promega, Madison, WI) e depois clonados no pCR ™ 4-TOPO

® vector (Invitrogen , Carlsbad, CA) para sequenciação. Para cada amplicon, pelo menos 6 clones individuais foram sequenciados utilizando um ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

metilação específicas de PCR

Nested PCR foi realizada para analisar o estado geral de metilação da variação de LCR e metilação após o tratamento desmetilação. Os iniciadores utilizados para PCR estão apresentados na Tabela S1, e os seus produtos de cobertura 7 /locais não metilados (M /U) de CpG metilados no 5′-LCR e região potenciador. DNA bissulfito-modificado foi primeiro amplificado por PCR com o conjunto de primers BSP-6. A BSP foi realizada num volume de 25 uL contendo 0,2 mM de cada um dos 4 dNTPs, MgCl 2 mM de

2, 10 pmol de cada iniciador, 1,25 unidades de AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems), e 100 ng bissulfito-modificado ADN. As condições BSP foram de 95 ° C durante 5 min, seguido de 25 ciclos a 95 ° C durante 60 s, 54 ° C durante 60 s, e 72 ° C durante 2 minutos, com uma extensão final a 72 ° C durante 7 min. Em seguida, o produto do primeiro ciclo de PCR foi submetido a uma segunda ronda de amplificação utilizando conjuntos de iniciadores de PCR específicos de metilação (Tabela S1), assim sequências metilados e não metilados pode ser amplificada separadamente. A PCR foi realizada num volume de 20 uL contendo 0,2 mM de cada um dos 4 dNTPs, MgCl 2 mM de

2, 10 pmol de cada iniciador, 1,0 unidades de AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems), e 3 produtos ul do primeira rodada de BSP. As condições de PCR foram 95 ° C durante 5 min, seguido de 25 ciclos de 95 ° C durante 40 s, 58 ° C durante 40 s, e 72 ° C durante 1 minuto, com uma extensão final a 72 ° C durante 7 min.

Knockdown de E6 e E7

Silencer

® Select siRNA segmentação HPV16 E6 e E7 (5′-GUA UGG AAC AAC AUU AGA A-3 ‘), Silencer

® siRNA alvejando GAPDH (controlo positivo), e mexidos siRNA (controlo negativo) foram obtidos a partir da Ambion (Life Technologies Japão, Tokyo, Japão). Para siARN transfecção, as células foram semeadas em placas de 6 poços (1,0 × 10

5 células /poço). Após a recuperação durante a noite, as células foram transfectadas individualmente com 60 nM de ARNsi utilizando Lipofectamina um RNAiMax

® Reagent (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram sujeitas a extracção de ARN total em 72 h após a transfecção, e a inibição do crescimento, a apoptose, e a paragem do ciclo celular foram analisados ​​às 96 h após a transfecção.

A detecção da proliferação e apoptose, e análise do ciclo celular

Para detectar a inibição do crescimento após o tratamento desmetilação, as células foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços (1.500 células /poço). Após a recuperação durante a noite, as células foram tratadas continuamente com recém-preparado 5-aza-dc do dia 1 ao dia proliferação 7. celular em momentos diferentes foi medida usando um CellTiter 96

® Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação (MTS; Promega , Madison, WI) e a absorvância (OD 490 nm) foi medida utilizando um microreader (SH-1000; Wakenyaku, Quioto, Japão). Depois de knockdown de E6 e E7, que principalmente focados sobre a inibição da proliferação em 96 h. Assim, utilizou-se a exclusão de tripano azul para a inibição do crescimento celular após siARN. As células foram semeadas em triplicado em placas de 6 poços (1,0 × 10

5 células /poço). Após 96 h após transfecção de siRNAs, as células foram destacadas e coradas com solução de azul de tripano a 0,4%, e a taxa de inibição do crescimento pode ser determinada por contagem e comparando células de corante-exclusivo entre os grupos transfectados com mexidos siRNA ou siRNA alvejando E6 ou E7 . Além disso, as células mortas após perda de E6 e E7 podem ser comparadas entre os diferentes grupos

Para avaliar a taxa de apoptose, anexina-V e coloração com 7-AAD. (Goiaba nexina reagente; Millipore, Hayward, CA) foi examinado por citometria de fluxo (goiaba EasyCyte Além disso Citómetro de fluxo; Millipore). As células foram semeadas em placas de 6 poços (1,0 x 10

5 células /poço). Após a recuperação durante a noite, as células foram tratadas com 5-aza-DC ou transfectadas com ARNsi como descrito acima. De acordo com as instruções do fabricante, o registo de anexina-V-PE e 7-AAD foi apresentado no xey eixos do citograma, respectivamente. células-Anexina-V positiva representados graficamente nos quadrantes inferiores e superiores do direita foram avaliados quanto mais cedo células apoptóticas e /apoptótica tarde as células mortas, respectivamente.

análise do ciclo celular foi levada a cabo usando coloração com iodeto de propídio para determinar o teor de ADN . As células foram tratadas com 5-aza-DC ou transfectadas com ARNsi como descrito acima. Depois de recolher o meio de cultura, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e isoladas. As células destacadas e flutuantes no meio de cultura e PBS foram recolhidos por centrifugação. Depois de deitar fora o sobrenadante e fixação das células com etanol arrefecido em gelo, as células foram coradas com o reagente de ciclo celular de goiaba e os dados foram adquiridos utilizando uma goiaba EasyCyte Além disso citómetro de fluxo. Modfit LT ™ software 4.0 (Verity Software House, Topsham, ME) foi utilizado para analisar os resultados do ciclo celular.

Quantitative PCR em tempo real

Para detectar a expressão E6 e E7 após 5-aza -dc tratamento ou E6 e E7 knockdown, o RNA total foi extraído a partir das células e convertido em ADNc, conforme relatado anteriormente [36]. β-actina foi adotado como um controlo interno; β-actina, E6, E7 e foram amplificados usando o ABI Prism 7300 Sistema de Detecção de Sequência (Applied Biosystems) e TaqMan

® PCR Mistura de PCR II (Roche Molecular Systems, Foster City, CA) tal como descrito anteriormente [32,36] . As expressões relativas de E6 e E7 foram calculados como E6 /β-actina e E7 /β-actina.

A imunocitoquímica

As células foram semeadas em placas de 6 poços com lamelas esterilizadas à parte inferior do poço e tratadas com 5-aza-DC como descrito acima. Depois as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente, as lamelas foram bloqueadas com 3% H

2O

2 durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, as lamelas foram submetidas a incubação durante a noite a 4 ° C com um anticorpo primário anti-HPV16-E6 (C1P5, 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) ou anticorpo-E7 anti-HPV16 (ED17, 1: 100 ; Santa Cruz Biotechnology). As células foram lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano de cabra anti-ratinho secundário (MTM Laboratories AG, Heidelberg, Alemanha) durante 30 min à temperatura ambiente. As secções foram então cor-desenvolvido em 3-3′-diaminobenzidina por 3 min e contrastadas com hematoxilina.

A análise estatística

As comparações dos dois grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student ou não testes paramétricos. A diferença de frequências entre os dois grupos foi analisada utilizando χ da Pearson

2 ou teste exato de Fisher. As associações entre o estado de metilação e carga viral e taxa de E2 /E6 foram analisados ​​por correlação de Spearman. Um valor P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e todas as análises foram realizadas com SPSS v12.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

Diferentes padrões de metilação LCR em HPV16- linhas celulares de cancro positivos

Um total de 15 locais de CpG localizados dentro do LCR do genoma de HPV16, que é rica em elementos reguladores, foram investigados neste estudo (Figura 1A e Figura S1). Uma vez que este foi o primeiro exame do LCR de células de UM-SCC47, que adquiriu a sequência LCR por PCR utilizando conjuntos de iniciadores 3, isto é, a LCR-1, -2, e -3, como mostrado na Tabela S1. Uma vez que duas sequências de nucleótidos (nt) e nt7435 mutações (nt31) alterou a presença dos locais de CpG (Figura 1B e 1C, e S1 fig), apenas 13 locais CpG foram avaliadas em células de UM-SCC47 (S1 FIG). Neste estudo, as células de UM-SCC47 e CaSki mostrou hipermetilação no LCR (79,8% e 90,0%, respectivamente) (Fig 2A e 2B). O sítio CpG (nt7862) localizado dentro E2BS-2 foi relativamente hypomethylated (37,5% em Um-SCC47 e 12,5% em CaSki), ao passo que os locais de CpG dentro da E2BSs excepto nt7862 foram hipermetilado em Um-SCC47 (97,9%) e CaSki (100%) as células. Em contraste, todos os locais de CpG dentro da LCR em células SiHa não metilado eram (0/120) (Figura 2C). Assim, as células SiHa poderia ser utilizado como um controlo negativo para uma investigação mais aprofundada da desmetilação de locais meCpG.

a) a estrutura do LCR de HPV16 e a localização dos locais de CpG. Transcription factor de sítios de ligação são também mostrados. B, C mutações) nucleótido na nt7435 (G → A) e (C nt31 → T) de células de UM-SCC47 afectada a presença dos locais de CpG.

Oito clones individuais foram sequenciados para identificar a presença e mudança de cada dinucleótido CpG metilada, antes e após desmetilação induzida por 0,5 uM de 5-aza-DC durante 96 h em a) UM-SCC47, B) células CaSki, e C) SiHa. Os círculos a cheio representam CpGs metilados (meCpGs), os círculos abertos representam CpG não metilados, e os asteriscos representam a ausência dos locais de CpG. D) A metilação de CpG em locais de tecidos. Para cada local de CpG, 6 clones foram sequenciados para identificar a presença e frequência de clones meCpG. As percentagens de clones meCpG está indicado pela barra vertical esquerda. Na parte inferior da figura, as posições dos locais de CpG são marcadas.

5-Aza-dc induz hipometilação CpG dentro do LCR em células UM-SCC47 e CaSki

Como um forte reagente de desmetilação, 5-aza-dc tem demonstrado efeitos terapêuticos em doenças malignas hematológicas e alguns tumores sólidos, incluindo HNSCC [38]. No presente estudo, o tratamento com 0,5 ^ M de 5-aza-DC durante 96 h mostrou a potência óptima desmetilação (0,1-5 uM testado) (Fig S2).

0,5 uM Após o tratamento com 5-aza-DC, a taxas de meCpGs no LCR em células de UM-SCC47 e CaSki foram significativamente diminuiu para 19,2% (20/104; P 0,001) e 29,2% (35/120; P 0,001), respectivamente, enquanto nenhuma alteração foi encontrada em células SiHa (0%, 0/120) (Figura 2). Interessantemente, em células de UM-SCC47 tratados com 5-aza-DC, não foram apenas os meCpGs na região do promotor desmetilado significativamente mais do que no 5′-LCR e região potenciador (P = 0,038), mas também dentro meCpGs E2BSs tinham significativamente desmetilação maior variação (P = 0,025).

LCR desmetilação diminui expressão E6 e E7 em células CaSki UM-SCC47 e

Após tratamento desmetilação com 0,5 ^ M de 5-aza-DC durante 96 h, a expressão de E6 e E7 de ARNm foi significativamente diminuído em Um-SCC47 (P = 0,021 e P = 0,008, respectivamente) e células CaSki (P = 0,017 e P = 0,023, respectivamente), mas não em células SiHa (Fig 3A e 3B ). Além disso, foram detectadas proteínas E6 e E7 em células de UM-SCC47 CaSki e por imunocitoquímica. proteínas E6 e E7 foram localizadas no citosol e núcleo de células de UM-SCC47 e CaSki, e a percentagem de células coradas e na intensidade de coloração foram significativamente menores após desmetilação (Figura 3C e 3D).

A desmetilação do locais de CpG induzido por 0,5 uM 5-aza-DC durante 96 h diminuiu E6 e E7 de expressão, que foi detectado por transcrição reversa PCR a) e quantitativa PCR em tempo real B); E6 e E7 foram claramente diminuída em células de UM-SCC47 e CaSki, mas não houve nenhuma alteração evidente em células SiHa. Os valores (média ± DP) foram obtidos a partir de pelo menos 3 experiências independentes. C) e D E6) proteína E7 após desmetilação dos locais de CpG foi detectada por imunocitoquímica; E6 e E7 oncoproteínas foram distribuídas no citoplasma e núcleo das células UM-SCC47 e CaSki com uma forte intensidade de coloração (× 100, bar = 100 mm), e ambas as percentagens e intensidade de células coradas foram claramente diminuiu após desmetilação (× 100 , bar = 100 mm).

a hipometilação de HPV16 LCR reduz a proliferação celular, aumenta a apoptose, e induz a paragem do ciclo celular em UM-SCC47 e células CaSki

Para examinar se a desmetilação de HPV16 a LCR por 5-aza-DC afecta a bioactividade celular, analisou-se a proliferação, a apoptose, e a paragem do ciclo celular. O crescimento e as propriedades físicas de todas as linhas de células 3 não estavam obviamente mudado nos 2 dias após o tratamento com 5-aza-DC. No entanto, 4 dias após o tratamento, o crescimento de células CaSki UM-SCC47 e foi quase completamente inibida (Figura 4A), que estava de acordo com a duração de tratamento óptima e a subsequente perda de expressão de E6 e E7. Também foi observada inibição do crescimento de células SiHa resultantes de tratamento com 5-aza-DC, que pode ser associado com a citotoxicidade de 5-aza-DC induzida pela incorporação acumulado no ADN celular [39]; No entanto, o efeito foi modesto em comparação com células CaSki e de UM-SCC47 (Fig 4A).

A) após desmetilação dos locais de CpG, o crescimento celular foi fortemente inibida em células de UM-SCC47 e CaSki, mas não em células SiHa. B) E6 e E7 de expressão foi significativamente reduzida após transfecção siRNA. C o crescimento celular) foi inibida em 96 horas após E6 e E7 knockdown. Todos os dados são médias ± SEM de 3 experiências independentes em A) e C), e meios ± SD de 3 ensaios independentes em B).

As células apoptóticas foram quantificadas por coloração com anexina-V-PE e citometria de fluxo. Com desmetilação de meCpGs por tratamento com 5-aza-DC, as taxas de apoptose de células CaSki UM-SCC47 e foram significativamente aumentada (P = 0,026 e P = 0,001, respectivamente). Além disso, 5-aza-DC aumentou o número de células de UM-SCC47 e CaSki presos durante a fase S (P = 0,048 e P = 0,003, respectivamente) e fase G2 /M (P = 0,002 e P = 0,044, respectivamente) (Fig 5). Em contraste, em células SiHa, que têm um único genoma de HPV não metilado, não há alterações significativas na apoptose ou paragem do ciclo celular em S e G2 /M fases foram observados (Figura 5).

A) após desmetilação do locais de CpG, o número de células apoptóticas aumentou significativamente em células de UM-SCC47 e CaSki, mas não em células SiHa. B) Após desmetilação dos locais de CpG, o número de células paradas durante ambas as fases G2 /M e S aumentaram em células CaSki UM-SCC47 e, mas não em células SiHa. Todos os dados são médias ± SEM de 3 experiências independentes.

mudanças celular de bioactividade após o tratamento desmetilação estão associados com a perda de expressão de E6 e E7

De modo a determinar se as alterações de bioactividade após o tratamento com 5-aza-CC estavam associados com a perda de expressão de E6 e E7 causada por desmetilação, que as transfectadas com 3 linhas de células de siRNA para derrubar E6 e E7 (Figura 4B). Após 96 h após a transfecção, o crescimento de UM-SCC47, CaSki, SiHa e células foi inibida (P = 0,044, P = 0,006 e P = 0,022, respectivamente) (Figura 4C); Além disso, a apoptose (P = 0,026, P = 0,050 e P = 0,016, respectivamente) e /paragem G2 M fase (P = 0,027, P = 0,035 e P = 0,012, respectivamente) foram induzidas (Fig 6). Estes achados foram de acordo com os efeitos sobre as células após desmetilação. Os nossos resultados sugerem que as alterações significativas de bioactividade após o tratamento com 5-aza-DC pode ser induzida por diminuição da expressão de E6 e E7 meCpG causada por desmetilação. No entanto, deve notar-se que a inibição do crescimento dramático após transfecção sugeriu a E6 /E7 siARN possivelmente teve efeitos fora do alvo.

a) O número de células apoptóticas no aumento de 96 h após a E6 e E7 knockdown no UM -SCC47, CaSki, SiHa e células. As células foram presos em G2 /M fase B) UM-SCC47 e células C) CaSki, e em ambos M e S fases em D) células G2 /SiHa. Todos os dados são médias ± SEM de 3 experiências independentes.

Diferentes padrões de metilação em pacientes OPSCC HPV-positivos

Foram coletadas amostras de 10 OPSCC pacientes com infecção pelo HPV16 para análise de sua LCR padrões de metilação (Tabela 2). A taxa de metilação significativo nas 10 amostras foi de 9,5% para a região inteira de LCR, 13,9% no 5′-LCR, 6,0% como promotor de E6 e 9,5% no promotor de p97 (Figura 2D). Mais de 70% dos locais CpG (111/150) foram completamente não metilada, enquanto que 26,0% (39/150) foram heterogeneamente metilado (≥ 1 meCpG clone). Todos os clones CpG não metilado foram em nt7862, que está em linha com o status de hipometilação clara em células UM-SCC47 e CaSki. No entanto, nos outros locais de CpG, foi detectada pelo menos 1 meCpG clone.

Embora o tamanho da amostra foi relativamente pequeno, foi realizada uma análise mais aprofundada e classificados os perfis de metilação como hipermetilação e hipometilação. Dois pacientes com cancro tonsilar (OPSCC-1 e OPSCC-10) teve um estado hipermetilação (41,6% e 40,0%, respectivamente) no promotor p97. No entanto, nos outros pacientes, os clones meCpG esporádica ou todos os clones CpG não metilado foram detectados, e a taxa de metilação média foi de 4,1% (24/585). Os perfis de metilação distintas nos pacientes OPSCC foram muito semelhantes aos tipos de metilação em linhas celulares de cancro HPV positivas. Além disso, analisamos as relações entre estado de metilação e de carga viral (E6 cópias) e taxa de E2 /E6 [36]. Após a exclusão de 2 casos (OPSCC-5 e OPSCC-7) com outliers no gráfico de dispersão, a frequência de metilação do promotor p97 foi positivamente correlacionada com a taxa de E2 /E6 (r = 0,759, P = 0,029). No entanto, nenhuma associação significativa foi encontrada entre a frequência de metilação do promotor p97 e carga viral (P = 0,220).

Discussão

Estudos anteriores de HPV16 LCR metilação foram baseados principalmente em células cervicais e amostras clínicas. Após a recombinação com o genoma celular, estado de metilação do genoma de HPV16 podem ser alteradas e depende do tipo de evento de integração e carga viral provavelmente [30]. No presente estudo, HPV16 LCR foi hipermetilado em células cervicais CaSki com genoma em tandem integrado HPV16 (um tipo 2 integrantes) e não metilado em células SiHa com a integração de genomas HPV16 individuais (tipo 1) integrantes. Estes resultados foram em linha com os resultados de estudos anteriores [7,15,25,32]. Em primeiro lugar temos de identificar as células de carcinoma epidermóide UM-SCC47 contendo um gene intacto E2 do genoma de HPV16 e um LCR hipermetilado como células CaSki cervicais, em que os genomas de HPV são integrados no genoma celular em matrizes em tandem [20]. A metilação de E2BSs em HPV16 LCR foi correlacionado com o nível de E6 oncogénica e E7 de expressão, e a desmetilação de HPV16 LCR em células de UM-SCC47 reprimida a expressão de E6 e E7, inibiu a proliferação, e, finalmente, causada paragem do ciclo celular em G2 /M. Os nossos resultados sugerem que a metilação dentro de HPV16 LCR também desempenha um papel vital no ciclo de vida virai em células que contêm um genoma CECP integrante de HPV16 de tipo 2. Além disso, a metilação também pode ser interpretado como um mecanismo de defesa alternativa para silenciar a replicação viral e transcrição [40], o que pode representar um novo mecanismo pelo qual o genoma do HPV é convertido a partir de um agente infeccioso produtivo se a um novo agente cancerígeno.

tem sido demonstrado que genoma de HPV16 completamente metilado é transcricionalmente inactivos [41], e estudos anteriores sugeriram que a metilação pesado não é necessária para LCR E2BSs para influenciar a actividade do promotor p97 [27,42]. A repressão do promotor pode restaurar as funções normais de p53 e pRb, bem como outros objectivos de E6 e E7 [43-45]. Além disso, a reintrodução de E2 em associação com qualquer E6 ou E7 sob o controlo de um promotor E2-independente foi utilizado para esclarecer as funções de E6 e E7 em células transformadas [43,45]. Os nossos dados mostraram que os locais CpG no 5′-LCR e a região do promotor de células de UM-SCC47, incluindo todos E2BSs, foram metilados preferencialmente, e 5-aza-DC desmetilação foi mais eficaz para as meCpGs na região do promotor e do que o E2BSs outros locais CpG dentro HPV16 LCR em células UM-SCC47, sugerindo que estes locais cruciais e região possam ser vulneráveis ​​a metilação na carcinogênese e desmetilação. No entanto, o CpG na nt7862, que está localizado na região ligante entre o intensificador e o promotor, tenderam a ser hypomethylated em ambas as células de UM-SCC47 e CaSki, bem como amostras OPSCC, com resultados semelhantes também relatados anteriormente [24,25, 29,30,33]. Isto sugere que o local de CpG podem estar envolvidos na origem de replicação virai e o seu estatuto unmethylation é muitas vezes retido para manter o ciclo de vida viral.