Abstract

Fundo

melhores sistemas de entrega são necessários para as vacinas rotineiramente usados, para melhorar a absorção de vacina. Muitas vacinas conter adjuvantes alum ou alum base. Aqui nós investigamos uma seco com revestimento densamente agrupadas em emplastro na pele micro-matriz de projecção novel (nanopatch ™) como um sistema de entrega alternativo para injecção intramuscular para a entrega de um adjuvante de alúmen papilomavírus humanos (HPV) (Gardasil®) utilizada como uma vacina profilática contra o câncer cervical.

Metodologia /Principais achados

matrizes Micro-projeção seco revestido com material de vacina (Gardasil®) entregue a C57BL /6 pele de orelha de rato vacina liberada no prazo de 5 minutos. Para avaliar a imunogenicidade da vacina, doses de correspondente ao componente de HPV-16 da vacina entre 0,43 ± 0,084 ng e 300 ± 120 ng (média ± DP) foram administradas a ratinhos no dia 0 e no dia 14. A dose de 55 ± 6,0 ng entregue intracutânea pela rede de micro-saliência era suficiente para produzir uma resposta de anticorpo neutralizante de vírus sérica máxima no dia 28 pós-vacinação. Títulos de anticorpos neutralizantes foram sustentados para 16 semanas após a vacinação e, por doses comparáveis ​​de vacina, títulos um pouco mais elevados foram observados com fornecimento de patches intracutaneous do que com a entrega intramuscular com a agulha e seringa, neste ponto do tempo.

Conclusões /Significado

o uso de matrizes micro-projeção secos (nanopatch ™) tem o potencial para superar a necessidade de uma cadeia de frio vacina para as vacinas comuns atualmente entregues pela agulha e seringa, e para reduzir o risco de lesões por picada de agulha ea vacina evasão devido ao medo da agulha especialmente entre as crianças

Citation:. Corbett HJ, Fernando GJP, Chen X, Frazer IH, Kendall MAF (2010) a vacinação contra a pele cervical Cancer Associated Papilomavírus Humano com um Novel matriz micro-Projeção em um rato modelo. PLoS ONE 5 (10): e13460. doi: 10.1371 /journal.pone.0013460

editor: Sotirios Koutsopoulos, Instituto de Tecnologia de Massachusetts, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de julho de 2010; Aceito: 16 de agosto de 2010; Publicação: 18 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Corbett et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Cancer Council de Queensland, da Universidade de Queensland, National Health and Medical Research Council (Austrália) Grants ID # 569726, ID # 456.150, Australian Research Council Grant ID # DP077464 eo sistema do Estado inteligente Queensland financiou esta pesquisa. Professor Mark A. F. Kendall foi o destinatário de um futuro Fellowship Australian Research Council. Professor Ian H. Frazer foi o destinatário de Fellowship do Premier do Governo de Queensland. A Universidade de Queensland e Professor Ian H. Frazer derivar receitas de royalties a partir da venda de vacinas contra HPV VLP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, ou a preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a maioria das vacinas são actualmente distribuídos por agulha e seringa. No entanto, como um dispositivo de entrega de vacinas, a agulha e seringa tem muitos problemas importantes. Estes incluem a transmissão potencial de doenças transmissíveis pelo sangue através de picadas de agulhas [1] e reutilização de agulhas – cerca de 30% das injeções para fins de vacinação nos países em desenvolvimento não são seguros [2], e que os ferimentos com seringas causam mais de 500.000 mortes por ano [3]. Agulha-fobia e dor associada com uma injecção intramuscular são também desvantagens – estima-se que a agulha fobia está presente em pelo menos 10% [4] da população, ou superior [5]. O músculo é também um local altamente ineficiente para vacinação, uma vez que não têm uma alta densidade de células apresentadoras de antigénio. Em contraste, a pele é um sítio alternativo atractivo para a vacinação, devido à sua rede densa de células apresentadoras de antigénios potentes (APCs) incluindo células de Langerhans (LCS) [6], e diversos sub-conjuntos de células dendríticas dérmicas (PDs) [7] . A proximidade destas células à superfície da pele significa que poderia ser possível orientá-las de maneiras que podem reduzir a dor e potencial de transmissão de agentes patogênicos transmitidos pelo sangue. Enquanto a entrega cutâneo tem um grande potencial, o método mais próximo utilizado atualmente na clínica – injeção intradérmica – é tecnicamente difícil, necessitando de desenvolvimento de métodos de segmentação avançados como revisto em [8], [9]

Neste estudo a. novel pele patch chamado o nanopatch ™ é usado para direcionar essas células do sistema imunológico da pele. O nanopatch ™ é uma matriz de micro-projeção com a projeção excepcionalmente densa embalagem ( 20.000 /cm

2) e projeções curtas (110 ^ m de comprimento). Esta densidade de agulha foi concebido de tal modo que entregue vacina foi co-localizada com as células imunitárias de 50% da pele – em ambos os epiderme e derme -. Após a aplicação cutânea, sem depender de difusão (ver Figura 1) [10]

A duas matriz dimensional de projecções localiza vacinas revestidos secos de camadas da pele ricas em células do sistema imunológico. Uma vez que os hidratos de vacinas, difunde-se através da epiderme e derme viáveis. Ovalbumina

Estudos anteriores com nanopatch ™ imunização utilizaram e vacina contra a gripe dividida como antígenos, sem adição de um adjuvante. Crichton et. al [11] demonstraram altos títulos de anticorpos após uma imunização com menos de 2 mg via nanopatch ™ usando o antígeno ovalbumina modelo em camundongos C57BL /6, sem um impulso utilizando 65 mm projeções nanopatch longos. Fernando et. ai. [10] demonstraram a indução de níveis protectores de anticorpos funcionais contra a influenza em murganhos com 110? M projecções longas nanopatch ™ (o mesmo que utilizado no presente estudo) utilizando um vírus de divisão, sem adjuvante de vacina da gripe trivalente (Fluvax 2008®); com um factor de 100 em doses poupadores entregue, em comparação com a agulha e seringa. Nestes estudos anteriores, as vacinas foram entregues sem adjuvante.

No estudo atual nós estendemos para explorar a utilidade do nanopatch ™ na entrega de um adjuvante alum. Isto é importante, porque muitas são vacinas com adjuvante -. Com alúmen na mais amplamente utilizado [12]

Com efeito, até ao licenciamento da recente AS04, alúmen era o único adjuvante licenciado para ser pelo FDA [13] . AS04 é baseado alúmen, com a adição de um lípido baseado Toll-like receptor 4 agonista de 3-O-desacil-4′-monofosforil-lípido A (MPL) [14]. “Alum” é quimicamente quer oxi-hidróxido de alumínio, ou hidroxifosfato de alumínio. Para as novas tecnologias para tirar vantagem das vacinas atualmente licenciados, idealmente, deve-se trabalhar com vacinas com o adjuvante alum. Até agora, o trabalho de formulação sólida foi realizada com adjuvante alúmen para imunização epidérmica pó (EPI) com hepatite B [15], [16], [17], e toxóides diftérico e tetânico [17]. coagulação em gel de alúmen extensa durante a secagem é suspeito de inibir a libertação de antigénio de tal forma que não é recuperável após re-hidratação [16], e as perdas de eficácia foram relatadas após liofilização ou de congelação [18], [19], [20]. Para minimizar estas perdas, sem reduzir significativamente a quantidade de sulfato de alumínio no total de sólidos ( 1% [18])., Congelação rápida é utilizado para evitar a concentração de solutos congelação em combinação com excipientes vidro formando

No entanto, no nosso revestimento de micro-saliência, um passo de congelação é não só tecnicamente mais exigente, mas tem o potencial de reduzir a integridade mecânica da camada de revestimento. O revestimento deve ser mecanicamente forte o suficiente para permanecer ligada na penetração da agulha, e as diferentes propriedades de expansão térmica entre as projecções e a vacina podem causar fissuras ou a delaminação das camadas revestidas enquanto o dispositivo é levado até à temperatura ambiente.

A secagem ao ar de alúmen contendo formulações foi investigada em Maa et ai [17], e verificou-se grande causar coagulação, mesmo na presença de trealose e /ou manitol, e /ou dextrano. Como protocolos de revestimento actuais estão mais próximas dos protocolos de secagem ao ar descritas em [17], em oposição a liofilização ou secagem por congelação, espera-se que a vacinação com as micro-saliências seco revestido com uma formulação contendo alúmen iria resultar numa resposta imunitária fraca. Neste trabalho utilizamos o polímero metil-celulose solúvel para reduzir a coagulação do gel de desidratação, e para ajudar na dissolução de reidratação após a aplicação.

O nosso caso de teste da doença para este estudo é o Papilomavírus Humano (HPV) causa – para além da importância social da vacina – ensaios para medir a neutralização do vírus estão bem estabelecidos. estrutura antigénio é importante para aumentar uma resposta de anticorpo neutralizante do vírus [19], fazendo com que o sistema sensível a perturbações na estrutura do antigénio que pode ser causada por desidratação alúmen durante o revestimento seco.

infecção por HPV é causador em praticamente todos os casos de câncer cervical – com DNA HPV presentes em 99,7% dos carcinomas cervicais [20]. A vacinação foi tornado possível por sistemas de expressão de proteína recombinante modernos e a descoberta de que a expressão da proteína principal da cápside L1 sozinho foi suficiente para produzir vírus de auto-montagem como partículas (VLP) [21], [22]. O VLP é uma partícula viral vazia -. Por isso não contém o genoma viral que codifica as proteínas oncogênicas que causam doenças malignas [23], [24], [25] em uma infecção natural

vacinas comercialmente disponíveis Gardasil® [Merck] e Cervarix® [GlaxoSmithKline] demonstraram excelente acção profilática em ensaios clínicos, evitando pré-malignas e cancros subsequentes em quase 100% no protocolo de acordo com-a-análises [26], [27], [28]. Ambas as vacinas contêm uma forma de adjuvante alum. As imunizações são dadas como três doses ao longo de seis meses. Estas vacinas são profilático. HPV é a infecção sexualmente transmissível mais comum [29], e a incidência de infecção cumulativa mais de 2 anos pós primeira relação é de aproximadamente 30%, com o uso do preservativo não apresentando efeito protetor significativo [30]. A imunização deve ocorrer antes da primeira relação sexual para ser totalmente protetora. Muitos países têm agora programas de imunização nacionais dirigidos a 11 e 12 anos de idade meninas. Este não foi sem problemas. desmaios em massa e dores de cabeça são acreditados para ser causado por uma fobia de agulhas e histeria em massa [31], e a vacinação sem agulhas podem melhorar a cobertura vacinal e aceitação.

A eficácia a longo prazo das vacinas contra o HPV é importante. Enquanto incidência varia com a idade, a prevalência mesmo em mulheres entre as idades de 40 e 49 anos é estimado em 25,2% [32], de modo que o potencial de infecção continua ao longo da vida. Duração da protecção é um fator significativo na eficácia de custo de vacinas contra o HPV [33], e quaisquer vacinas de segunda geração devem demonstrar proteção duradoura.

injecção intra-dérmica de Papilomavírus Oral canina (COPV) L1-glutationa pentâmeros de fusão S-transferase – semelhante ao pentâmeros – HPV tem sido mostrado para ser protectora em beagles em ng cão 400 /[33]. Suzich, J.A., et ai. [34] demonstraram que reuniu COPV-VLP resultou em proteção completa com uma dose de 50 ng e proteção parcial a 0,125 ng utilizando a via intra-dérmica em beagles.

O HPV VLP é montado a partir de 72 de pent�eros a proteína L1 [35], [36]. A desmontagem das VLP pode ser realizada de forma reversível

In-vitro

a pH elevado, baixa concentração de sal, e com a adição de agentes redutores (por exemplo, pH 8,2, NaCl 0.166M com DTT 2 mM). A diálise contra um tampão de pH 6,8 com uma concentração de sal de 0,5-1 M resultados em conjunto das partículas [37]. Lenz, P., et ai. [38] demonstra que HPV16L1-VLP sozinho, mas não os seus constituintes L1-pent�eros induzir a maturação de células dendríticas

in-vitro

. THONES et. ai. [39] estimar que a imunização com L1-pentâmeros também requer 20-40 vezes mais proteína administrada para obter a resposta de anticorpos semelhante. proteína L1 desnaturada não dá uma resposta de anticorpos neutralizantes do vírus [19], e enquanto que as formulações secas podem significar maior vida de prateleira na temperatura mais elevada, uma formulação pobre pode causar uma degradação significativa dos produtos de proteína. As formulações líquidas adequadas para a estabilidade de HPV-VLP foram definidos para tanto a vacina de [40] e CERVARIX [41]. À medida que a formulação tem um impacto sobre a montagem de VLPs (e potencialmente a estrutura dos próprios caps�eros) e VLPs são mais imunogénicos do que os capsómeros, formulação é importante para a potência de uma vacina revestido seco. Ambas as vacinas um componente de adjuvante alum – Gardasil conter hidroxifosfato de alumínio. Para nosso conhecimento, estudos utilizando formulações sólidas não foram publicados para o HPV, ou HPV adsorvido em alum.

O projeto nanopatch ™ utilizada neste estudo utiliza uma variedade de micro-saliências 110 mm elevados 58 × 58, e 30 um de diâmetro de base, com um espaçamento de 70 uM entre centros de projecção (ver Figura 2). A vacina é seco revestido sobre as micro-saliências, tal como descrito em [42], e Nanopatches ™ são aplicados em 2 ms

-1. Esta configuração proporciona o material para as camadas epidérmica e dérmica da pele de orelha de rato com uma profundidade de penetração de 42 uM (SD = 9.9, N = 365), como determinado por imagiologia de traçador fluorescente em orelhas de rato seccionado em crio tal como descrito em [11] , mas com projeções semelhantes aos utilizados em [10]

elétrons secundários mostram a morfologia da superfície, enquanto as imagens de elétrons retroespalhados mostram composição -. com elementos de massa atómica baixos dando sinal baixo – ou seja, área revestida aparece escura em comparação com o não revestido nanopatch ™. Micro-projeções são revestidos em b) 800 ng, c) 80 ng, d) 8 ng e e) 0,8 ng de HPV-16 proteína por patch. Enquanto alguns ponte está ocorrendo no grupo de 800 ng (painel b – seta branca)., Revestimento é visto na parte afunilada de projeções em todos os grupos de dose

Neste artigo, demonstramos revestimento seco e liberação de um alum adjuvante vacina contra o HPV-VLP com o nanopatch ™. Nós, então, demonstrar uma resposta imune posterior que é de longa duração, e neutraliza o vírus a níveis comparáveis ​​com injeção intramuscular com a agulha e seringa.

Resultados

morfologia Projeção da seco revestido Nanopatches ™ é adequado para agulha de penetração

remendos revestidos foram examinadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), utilizando elétrons secundários e modos retroespalhados (Figura 2) para investigar a distribuição da vacina revestido ao longo projeções. Modo de electrões secundários mostrou a forma da superfície das agulhas revestidas, enquanto que o modo de electrões retrodifusão foi usada para confirmar qualitativamente a espessura do revestimento, devido a diferenças na massa atómica da superfície nanopatch ™ o ouro e o revestimento. Tentativas para secar revestimento adjuvante alúmen sem excipiente de revestimento resultou em vacina mínimo sobre pontas de agulha, e a cristalização do adjuvante alúmen (Figura S1). Por isso, adicionou-metil-celulose para estabilizar a vacina e melhorar a morfologia do revestimento (Figura 2). Uma percentagem significativa do revestimento estava localizada à porção afunilada das projecções. Isto pode ser visto nas imagens de electrões secundários pela diferença na morfologia antes e depois do revestimento, e as imagens de electrões em retro-espalhados pelo sinal escuro em pontas de projecção. No grupo de 800 ng, foi observada alguma ponte entre as projecções em certas áreas do Nanopatches ™ (indicado pela seta na Figura 2b), provavelmente devido à maior concentração de vacinas do que em outros grupos.

A vacina é liberado de dicas de projeção, e eficiência de entrega a granel é consistente com as expectativas com base na morfologia de revestimento e os dados de penetração

diluições Tenfold série de Gardasil® foram preparados e 14C marcado ovalbumina adicionado como um marcador para cada amostra, revestido em Nanopatches ™ , e aplicada ao lóbulo ventral de ratinhos C57BL /6 (n = 5 por grupo de dose) tal como descrito em Materiais e Métodos. Um equilíbrio de massa utilizando o traçador marcado radioactivamente foi realizada entre a quantidade total de revestimento, e que foi entregue na pele da orelha, para a esquerda na nanopatch ™, ou depositados sobre a superfície da pele. Eficiência da liberação foi: 19% (DP = 7,5), 34% (DP = 4,7), 36% (DP = 10) e 27% (DP = 5,2) para 800 ng, 80 ng, 8 ng e 0,8 ng de HPV-16 revestido respectivamente (ver Figura 3).

de libertação foi determinada por balanço de massa, e variou entre quantidades revestidos com uma média de 19%, 34%, 36%, e 27% para as formulações usadas para 800 ng, 80 ng, 8 ng e 0,8 ng de HPV-16 revestido por nanopatch ™.

percentagens de entrega foram então usados ​​para calcular doses eficazes, multiplicando a eficiência de entrega pela quantidade revestido. quantidades de entrega foram estimados em 300 ng (DP = 120), 55 ng (DP = 6,0), 5,7 ng (DP = 1,6), e 0,43 ng (DP = 0,084) de HPV-16L1.

Nanopatches ™ pós-aplicação também foram visualizados com SEM para determinar se qualquer solução de revestimento ainda permaneceu em projeções. material de baixa massa molecular foi detectada na base, em alguns casos, mas raramente em pontas de projecção (Figura S3)

vacinação nanopatch ™ provoca vírus duradoura resposta imune neutralizante, comparável com intramuscular

™ nanopatch doses estavam divididos sobre cada orelha (ou seja, um remendo por orelha) e administrada no dia 0 e novamente no dia 14. os soros foram recolhidos no dia 28 e no dia 112 após a vacinação para examinar a resposta imediata, bem como a persistência de longo prazo de anticorpos postar vacinação. Os soros foram ensaiados para a capacidade de neutralizar o vírus HPV com o ensaio de neutralização à base de pseudo-virião (PBNA) (Figura 4). Uma análise de não-inferioridade foi usada (Materiais e Métodos) semelhantes a estudos comparativos de imunização anteriores Papilomavírus Humano [43].

doses nanopatch ™ foram 300 ng (DP = 120), 55 ng (DP = 6,0), 5,7 ng (DP = 1,6) e 0,43 ng (DP = 0,084). doses intramusculares foram de 10 mg, 1 mg, 100 ng, 10 ng e 1 ng. No dia 28, nanopatch ™ 300 ng e 55 ng grupos de dosagem ter atingido vírus comparáveis ​​títulos neutralizantes de todos os grupos de injecção intramuscular (p 0,05). Por dia 112, todas as doses nanopatch ™ alcançaram títulos de neutralização comparáveis ​​contra todos os grupos de injeção intramuscular (p 0,05). Repetições são escalonados no eixo x para ajudar na visualização. Não imunizado plotados com uma dose de 0,05 ng devido à escala logarítmica.

No dia 28 após a imunização, os títulos do ng 300 ± 120 e 55 ± doses 6,0 ng grupos nanopatch ™ foram estatisticamente não inferior para todas as doses intramusculares (p 0,001), com título médio geométrico (GMT) de 30500 e 26000, respectivamente (Figura 4). Em cada um dos ng 5,7 ± 1,6 e nível de dose ng 0,43 ± 0,084 grupos nanopatch ™, dois ratos não soroconvertem.

Os anticorpos neutralizantes foram titulados no dia 112 pós-vacinação (Figura 4) para estabelecer a longo prazo eficácia. No dia 112 pós-imunização, todos os grupos nanopatch ™ mostrou 100% de sero-conversão. No dia 112, todas as doses nanopatch ™ eram estatisticamente não inferior a todas as doses intramusculares (p 0,05).

Ao comparar a resposta no dia 112 e dia 28 em cada grupo (Figura 4), no dia 112 título não preencheram os critérios de não-inferioridade contra o título dia 28 em ambos os 100 ng e 1 grupos ng intramusculares (proporção de títulos: 100 ng IC de 90% (0,40, 1,2) e 1 ng 90% CI (0.39,1.2) ). Em contraste, no grupo de titulação comparações nanopatch ™ revelaram títulos no dia 112 não foi inferior em todos os casos, e superior ao nível de dose de 0,43 ± 0,084 ng, com o título de 112 dias sendo 1.2-5.8 vezes mais elevadas do que no dia 28 (título p 0,05) na mesma dose

Discussão

Este documento demonstra revestimento e lançamento de um alum contendo vacina Gardasil® de um remendo matriz romance micro-projeção eficaz (nanopatch ™) projetado para. entregar vacina directamente a cerca de 50% das células que apresentam antigénio pele abundantes [10], para a indução de uma resposta eficiente de anticorpos neutralizantes do vírus.

eficiência de lançamento variou entre os grupos de dose. Prevê-se que isto é principalmente dependente da morfologia do revestimento. Isto é suportado por nossas expectativas teóricas de entrega (Figura S2). Nossos lançamentos previsto (Figura S2), em comparação com a liberação medido foram mais precisos dentro dos mais baixos grupos de dose. Nós over-previu o lançamento no mais alto dos grupos de dose. Esta discrepância é provável que seja devido a ponte entre as projecções e revestimento excessiva na base de Nanopatches ™ (Figura 2b) que conduz ao desperdício da solução de revestimento. Desde o revestimento na base e colmatar as projeções não foram contabilizados nos cálculos, quando esses valores são significativos, isso resultaria em uma superestimativa do valor entregue como os cálculos teóricos foram apenas com base na solução de revestimento nas projeções. Esta ponte vai provavelmente ser aliviado por adição de um surfactante em formulações posteriores. Estes dados, e as imagens do aplicativo pós demonstrar que a liberação das projeções está completo e, portanto, com os avanços da tecnologia de revestimento para isolar revestimento exclusivamente a partes das projeções que penetram a pele, liberação completa 100% de eficiência é possível com estas formulações.

liberação rápida é susceptível de ajudar a garantir a dose da vacina consistente é entregue, como é mais fácil de garantir o cumprimento do protocolo de imunização. Um período de observação de 15-20 minutos após uma imunização intramuscular padrão é geralmente recomendado como choque anafilático mais ocorrerá dentro deste período de [44]. A libertação da vacina revestido seco do nanopatch ™ ocorreu no prazo de cinco minutos, -., Assim, facilmente reunidos orientações período de observação

Para demonstrar que o vírus de anticorpos neutralizantes foram levantadas, o soro foi pesquisada através da pseudo-virião-Based Ensaio de Neutralização (PBNA) – considerado o “padrão ouro” nas orientações da OMS para vacinas contra o HPV [45], [46]. Este ensaio mede a eficácia dos anticorpos ou outros compostos em bloquear a entrada do vírus HPV em células 293TT [47]. Isto é importante, como protecção acredita-se ser um resultado de anticorpos de neutralização do vírus mediada [48], [49]. O método também elimina a tendência de usar o mesmo material tanto para a imunização e ensaio imunológico ELISA que ocorre quando é usado. sinal do ensaio só é gerado por pseudoviriões intactas que imitam o vírus nativo, assim qualquer resposta imune levantada contra contaminantes ou proteína desnaturada não terá impacto nos resultados do ensaio de neutralização. imunização nanopatch ™ com 0,43 ± 0,084 ng de HPV-16 resultou em resposta neutralizante de vírus em 112 dias após a vacinação. Isto implica que a proteína L1 revestido seco mantém alguma estrutura semelhante a vírus nativo. Especula-se que um certo grau de desmontagem de VLP em pentâmeros podem ter ocorrido. Esta afirmação baseia-se em nossos estudos semelhantes utilizando vetores virais (dados não publicados). Devido ao aumento da imunogenicidade de VLPs em comparação com pent�eros, se a desmontagem em pent�eros está ocorrendo durante o revestimento seca, um grande aumento na atividade é provavelmente através de reformulação a preservar a estrutura de VLP.

Embora os resultados iniciais mostraram apenas 50% sero-conversão no ng 5,7 ± 1,6 e 0,43 ± 0,084 ng grupos nanopatch ™, vantagens tornar-se mais clara na sangria terminal quando todos os ratos têm sero-convertidos. Nas doses mais baixas intramuscular começou a vacilar, com os títulos de dois ratos caindo abaixo do limite de detecção. É possível que nanopatch ™ imunização, com vacinas contendo alúmen, tem cinética de libertação mais lenta, em comparação com a administração intramuscular – devido ao local de administração diferente e um efeito de depósito maior do alúmen desidratado. Embora extremamente baixas doses de HPV-VLP parecem intramuscularmente imunogénico em ratinhos, doses para seres humanos nas vacinas aprovadas estão no intervalo de 20-40 ug por subtipo. cinética de libertação lenta pode alterar favoravelmente resultados imunológicos e ajudar a atingir a activação óptima de APCs, sem a necessidade de aplicar fisicamente mais doses. É necessário mais trabalho para investigar isso.

Estudos anteriores sobre a imunização intradérmica com COPV [33], [34] utilizado um ensaio ELISA assim uma comparação directa com os nossos resultados não é possível. Suzich et al [34] estudaram a entrega intradérmica de montada COPV-VLP e obteve uma protecção parcial ao nível da dose sub-nanograma. Em comparação, um estudo mais tarde por Yuan, et. ai. [33] com a administração intradérmica de proteína de fusão COPV-L1-GST (não é possível montar em VLPs) não mostraram nenhuma resposta detectável por ELISA, abaixo de uma dose de 400 ng. Este trabalho focado na montagem pent�eros incompetentes como uma alternativa barata para VLP. Em ambos os casos, observou-se uma protecção parcial contra o desafio, mesmo quando os anticorpos não foram detectados. nanopatch imunização com a vacina contra influenza ™ virião fragmentado dá a redução da dose superior contra intramuscular [10], em comparação com o que tem sido demonstrado na administração intradérmica [50]. Se desmontagem de HPV-VLP está ocorrendo em nosso revestimento seco nanopatch ™, a comparação dose eficaz mais próximo é com o trabalho de Yuan et al. Isto sugeriria que nanopatch ™ imunização pode dar uma imunogenicidade aumentada em comparação directa com a administração por via intradérmica (e, assim, presumivelmente, a administração intramuscular) de L1-pentâmeros. No entanto, como as vacinas atualmente licenciadas são baseados VLP, reformulação para preservar a integridade VLP será o foco do trabalho futuro

Nossa ensaios de libertação de medir a proporção de revestimento que é liberado na pele -. Eles não medir o que proporção de antígeno é efetivamente liberado do alum, nem a sua conformação em release. Se o gel de alúmen é coagulado, de acordo com estudos anteriores [17], o antigénio não pode escapar da matriz alúmen colapsada – reduzindo, assim, a dose eficaz. Este efeito pode, de facto, negar quaisquer benefícios de adjuvante alúmen a disposição em contrário, embora um estudo mais aprofundado é necessário para determinar a extensão em que a matriz de libertação prejudica alúmen, e o seu impacto. O trabalho futuro vai investigar a estrutura da proteína e coagulação do alum, bem como excipientes para reduzi-la. Como HPV VLP-L1-são altamente imunogénicas, mesmo sem adjuvante, formulações sem alúmen também irá ser investigado. Especula-se que com as formulações melhoradas, nanopatch ™ imunização pode eventualmente significar doses mais baixas de alum adjuvante VLP pode ser usado para provocar uma resposta imune duradoura em seres humanos.

O trabalho futuro vai se concentrar em melhorar sparing dose nanopatch ™ imunização, e investigar thermostability. Para este fim, a integridade VLP revestido seco, explorando VLP sem adjuvante e melhorar formulações serão exploradas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Universidade de Queensland regulamentos ética animal.

Fabrication nanopatch ™

Nanopatches ™ foram fabricados por Deep Reactive Ion Etching de acordo com a patente [51] no Rutherford Appleton Laboratory, Oxford, Reino Unido. Nanopatches ™ foram revestidos por pulverização catódica com ouro com uma espessura de 100 nm. morfologia uniforme foi confirmada por microscopia eletrônica de varredura (SEM) em um Philips XL30. As amostras foram inclinado a 45 ° para confirmar o perfil de projecção apropriado.

nanopatch ™ Revestimento

Gardasil® (Merck, EUA) foi centrifugado a 5000 g durante 15 minutos para sedimentar o alúmen com o vírus adsorvido como partículas. O sobrenadante foi removido e a pelete re-suspenso em metilcelulose a uma concentração final de 10 ug /mL de metilcelulose, e 100 ng /mL de HPV-16-VLP. Dez vezes diluições em série foram preparadas em 10 ug /mL de metilcelulose para formular doses diferentes. Methocel 60 HG – metil-celulose (cat # 646555) foi adquirida da Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia):

Nanopatches ™ com 110 mm de comprimento agulhas foram revestidas por pipetagem 8 mL de solução de revestimento sobre. e a superfície de revestimento seca através de jacto de azoto, como anteriormente descrito [42]. morfologia revestimento apropriado foi confirmada por SEM.

em 6 semanas velhas foram anestesiados

nanopatch ™ Imunização

Quatro grupos (n = 5) do sexo feminino camundongos C57BL /6 com Ketamil® e Xylasil®. Os ratinhos foram, em seguida, uma vez corrigido em cada orelha no lado ventral utilizando um dispositivo de aplicação de mola para aplicar o adesivo em 2,0 ms

-1 – uma velocidade encontrada para dar máxima de penetração de agulha sem danificar o tecido (dados não mostrados). Doses afirmou neste documento referem-se a dose total HPV-16 para cada imunização distribuída ao longo de dois Nanopatches ™, e os ratinhos foram imunizados no dia 0 e aumentou no dia 14. Os patches foram realizadas in situ por 5 minutos. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho de Saúde e Pesquisa Médica Nacional (Austrália). O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Queensland (Permissão Número AIBN /020/10 (NF)). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

injecções intramusculares

doses Gardasil® foram concentradas por centrifugação a 5000 g durante 15 minutos. O excesso de sobrenadante foi removido e pelete foi re-suspenso na quantidade apropriada de sobrenadante para dar uma concentração de VLP de HPV-16 de 0,2 mg /mL. Quatro diluições em série de 10 vezes foram preparados para o excesso de sobrenadante.

Cinco grupos (n = 5) de ratinhos C57BL /6 com 6 semanas de idade foram imunizados por via intramuscular no dia 0 e reforçados no dia 14 com 25 uL entregue cerca de 2 mm em cada músculo caudal da pata traseira com cada grupo que recebeu 10 mg, 1 mg, 100 ng, 10 ng, ou 1 ng de HPV-16 por ratinho por imunização.

Aplicação de Controle

controle tópica: Um grupo (N = 5) de C57BL 6 ratos /a 6 semanas de idade foram anestesiados com ketamil e xylasil. Os ratinhos foram restringidos com a superfície ventral da orelha plana, e 125 uL de Gardasil® (contendo 10 ug de HPV-16) foi aplicado topicamente durante cinco minutos

Fluvax imunizados controlo:. Um grupo (N = 5) de ratinhos C57BL foram anestesiados /6 ratos em 6 semanas de idade com Ketamil® e Xylasil® e imunizados por via intramuscular com 6 mg de Fluvax 2008® (CSL Ltd., Melbourne, Austrália) em um volume de 30 mL.

controlo não imunizado : Um grupo (N = 5) de C57BL /6 foram anestesiados ratos em 6 wks com Ketamil® e Xylasil® e sacrificados imediatamente após a cessação de reflexos por punção cardíaca

coleção Sera

sangue. As amostras foram obtidas no dia 28 e 112 após a vacinação por sangrias retro-orbital, e separação do soro. Os soros foram armazenadas a -20 ° C até análise.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

As amostras foram examinadas em elétrons secundários e modos de elétrons em um Philips XL30 volta dispersos.