Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo. Nos Estados Unidos, apenas um em cada seis pacientes com câncer de pulmão sobrevivem cinco anos após o diagnóstico. Estas estatísticas podem melhorar se novos alvos terapêuticos são identificados. Nós relatado anteriormente que uma enzima do metabolismo dos ácidos gordos, de cadeia longa muito-acil-CoA sintetase 3 (ACSVL3), é sobre-expressa em glioma maligno, e que empobrecem células de glioblastoma de ACSVL3 diminui suas propriedades malignas. Para determinar se a expressão ACSVL3 também foi aumentada no cancro do pulmão, estudamos tumorais cortes histológicos e linhas celulares de cancro do pulmão. A análise imuno-histoquímica de pulmão humano normal mostraram expressão ACSVL3 moderada apenas em células epiteliais brônquicas. Em contraste, todos os 69 tipos de tumor testados, incluindo, de células adeno- escamosas, de células grandes, carcinomas de células pequenas e, se robustamente níveis elevados ACSVL3. A análise Western blot de linhas celulares de cancro de pulmão derivadas destes tipos de tumores, também tinham aumentado significativamente em comparação com a proteína ACSVL3 células epiteliais brônquicas normais. A diminuição da taxa de crescimento das linhas celulares de cancro do pulmão não alterou a expressão ACSVL3. No entanto, derrubando expressão ACSVL3 por interferência de RNA reduziu as taxas de crescimento de células em cultura por 65-76%, ea capacidade das células tumorais para formar colônias em suspensão de agar mole por 65-80%. Nós também realizados estudos para obter uma melhor compreensão das propriedades bioquímicas de ACSVL3 humano. ACSVL3 ARNm foi detectada em muitos tecidos humanos, mas o padrão de expressão diferiram um pouco da do rato. A enzima activada de longa e de cadeia longa muito substratos de ácidos gordos, bem como mono-cadeia longa e ácidos gordos poli-insaturados a saturados seus respectivos derivados de coenzima-A. ACSVL3 proteína humana endógena foi encontrado num compartimento subcelular ponteada que parcialmente co-localizada com as mitocôndrias, como determinado por microscopia de imunofluorescência e de fraccionamento subcelular. A partir desses estudos, concluímos que ACSVL3 é um novo alvo terapêutico promissor no cancro do pulmão

Citation:. Pei Z, Fraisl P, Shi X, Gabrielson E, Forss-Petter S, Berger J, et al. (2013) Very Long-Chain Acil-CoA sintetase 3: superexpressão e Dependência do crescimento do câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (7): e69392. doi: 10.1371 /journal.pone.0069392

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2012; Aceito: 13 de junho de 2013; Publicação: 23 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Pei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede HD024061, NS037355 e NS062043 (PATA) e do Fundo de Ciência austríaco (FWF) P14163-MOB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sintetases acil-CoA (ACS) catalisar a thioesterification dependente de ATP de ácidos gordos (FA) a coenzima a (CoA) [1]. Esta “activação” passo é necessário para a FA de participar em quase todas as reacções metabólicas posteriores. Com base na sua acilo preferência de comprimento de cadeia, bem como a sua homologia de sequência de aminoácidos, a 26 ACSs diferentes encontrados em seres humanos podem ser divididos em várias famílias distintas de enzimas, incluindo a “de cadeia muito longa” (ACSVL) família, que contém 6 membros. Cinco enzimas da família ACSVL pode activar a muito longo substratos FA de cadeia longa; o sexto membro desta família é uma sintetase de ácido biliar-CoA específico do fígado [2]. Para além das suas funções metabólicas, estas enzimas também foram investigados como proteínas de transporte (FA FATP) [3], como três dos seis membros da família promover a absorção celular de cadeia longa-FA [4]. A designação oficial dos genes que codificam a família ACSVL /FATP é

SLC27A1-6

propriedades previamente descritas de ACSVL3 rato (Slc27a3; FATP3). [5]. Quando ACSVL3 foi sobre-expresso em células COS-7, a proteína localizada no retículo endoplasmático. No entanto, a enzima endógena em células de Leydig MA-10 do rato testículo parcialmente co-localizada com mitocôndrias por ambos centrifugação diferencial e imunofluorescência. knockdown transiente de ACSVL3 utilizando siRNA diminuiu a capacidade de células MA-10 para activar quer de cadeia longa (palmitato; C16:0) ou muito longa cadeia (lignocerato; C24:0) FA. No entanto, ACSVL3 knockdown não afectou a capacidade das células MA-10 para levar até C16:0. A última observação foi posteriormente confirmada quando a expressão de ACSVL3 mamífero em leveduras falhou para promover a absorção de cadeia longa FA [4]. Northern blot e análises de Western blot de tecidos de ratinho adulto revelou que a enzima é expressa principalmente na glândula supra-renal, ovário, testículo e, com a expressão mais fraca em outros tecidos, tais como cérebro, pulmão, rim e [5]. Níveis elevados de ARNm ACSVL3 estavam presentes em embrionário (E12) do cérebro do rato; no entanto, a expressão diminui rapidamente e por um mês de idade, o mRNA foi quase imperceptível.

seções do cérebro do rato adulto mostrou fraca imunomarcação ACSVL3 em neurônios corticais, os neurônios do hipocampo, e células de Purkinje do cerebelo, mas a proteína não foi detectado em células da glia [5]. Foi, portanto, inesperado quando encontramos ACSVL3 a ser marcadamente sobre-expressos em gliomas malignos e em linhas de células de glioblastoma humano [6]. Derrubando expressão ACSVL3 em células U87 de glioblastoma humano diminuiu seu comportamento maligno, tanto em cultura e quando injetada por via subcutânea ou por via intracraniana em ratinhos. Portanto, foi perguntado se ACSVL3 é expresso em outras malignidades humanas, tais como cancro do pulmão, o que é a causa principal de mortes por cancro em todo o mundo [7]. Neste artigo, mostramos que ACSVL3 é altamente sobre-expressos em todos os tumores de pulmão e linhas de células examinadas. Em linhas celulares de cancro do pulmão, o esgotamento ACSVL3 melhorou significativamente suas propriedades de crescimento malignas. Descrevemos também propriedades bioquímicas adicionais de ACSVL3 humano.

Materiais e Métodos

Materiais

[1-

14 C] ácido palmítico (C16:0), [1 –

14 C] ácido oleico (C18:1), [1-

14 C] ácido araquidônico (C20:4), [1-

14 C] ácido docosahexaenóico (C22:6) e [1-

14C] de ácido lignocérico (C24:0) foram obtidos de Moravek Biochemicals Inc. (Brea, CA, EUA). [1-

14C] de ácido linoleico (C18:2) era de American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO, EUA). Policlonal de carneiro anti-soro a 70 proteína de membrana peroxisomal kDa (PMP70) foi um presente do Dr. S. Gould (Johns Hopkins Univ. Sch. Med.). anticorpo monoclonal de ratinho a isomerase de dissulfito de proteína e de anticorpo policlonal de coelho para o manganês superóxido-dismutase (MnSOD), eram de Stressgen (San Diego, CA, EUA). anticorpo policlonal de coelho para o ATP sintase foi de Chemicon (Chemicon International, Temecula, CA, EUA). anticorpo de coelho policlonal para fosfatidiletanolamina N-metiltransferase 2 (TMEP), foi um presente do Dr. D. Vance (University of Alberta, Edmonton, Canadá). anticorpo anti-ACSVL3 purificados por afinidade anticorpos policlonais de coelho foi descrito anteriormente [5]. Os anticorpos secundários conjugados com HRP para transferências de Western foram a partir de qualquer Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA) ou anticorpos secundários de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA), e para imunofluorescência foram de Jackson ImmunoResearch (West Grove , PA, EUA). De-identificado, parafina fixadas em formaldeído de tecidos de câncer de pulmão humano de dois pacientes foram obtidos e utilizado em conformidade com um protocolo aprovado pelo Instituto Johns Hopkins de Seres Humanos Pesquisa Institucional Review Boards (Protocolo NA_00003308); Este protocolo permite a utilização de tecidos identificou-de sem autorização por escrito adicional (que não seja incluído nos formulários processo de aprovação). Um arranjo de tecido (catálogo # CBL-TMA-078) contendo pulmão humano normal e 67 tipos de tumor foi comprado de BioLabs (Port Jefferson Station, Nova Iorque) Criativa.

Clonagem de cDNA ACSVL3 Humanos e Construção de plasmídeos de expressão

sequência ACSVL3 Full-length foi obtido utilizando uma abordagem combinatória de expresso tag sequência (EST) triagem e isolamento de sequências associadas usando várias estratégias de clonagem. Em resumo, um único clone (C24355, Stratagene;. De acesso do GenBank BC003041 não) que continha uma longa mas 5′-ilimitada grelha de leitura aberta foi usado como uma base para se obter sequência adicional 5 ‘, empregando primer walking genómico. O subsequentemente identificados sequência 5 ‘de ADN genómico estendida serviu para identificar um clone de EST adicionais, proveniente de uma biblioteca enriquecida em clones de comprimento completo, que tinha sido obtido por meio do método Cap-Trapper [8], localizado a montante do primeiro ATG na BC003041 clone . Este novo clone EST (GenBank Accession n. BG720126), pode ser alinhado com o DNA genómico e desde que a sequência de ADNc de novo a partir da posição -115 a 179, que serviu como molde para mais desenho de primers de forma a obter cDNA de tamanho completo . Uma construção com uma grelha de leitura aberta completa do gene ACSVL3 humana foi montado num protocolo de dois passos. Em primeiro lugar, uma 2480-pb

Hind III-

EcoR I

fragmento foi excisado do clone de ADNc C24355 e inserido no vector de expressão pCDNA3.1 (+) (Invitrogen), dando origem a P434. Na segunda etapa, um fragmento de PCR de 915 pb foi amplificado a partir de um exão do clone genómico ACSVL3, usando iniciador para a frente, 549 (5′-CGCCAAGCTTAGCCAGATGCCTAAA-3 ‘), com o ATG (1) sublinhado, e o iniciador reverso 530 (5’-AGCGCCACAGTTGCTCCAGGT-3 ‘), purificado, digerido com

Hind III

(introduzida com o iniciador 549) e

Eco47 III, um sítio de restrição único no ADNc ACSVL3, e clonado

Hind

III,

Eco47

III digerido P434, resultando em P435 plasmídeo, contendo a construção de corpo inteiro de ACSVL3. A sequenciação de ADN foi realizada por MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha).

linhas de células e condições de crescimento

HepG2 de hepatoma humano, células COS-1, e A549, H82, H460, EKVX, e pulmão U1752 linhas celulares de cancro eram de ATCC (Rockville, MD). As células HepG2 foram mantidas em meio essencial mínimo (Mediatech, Manassas, VA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Gêmeos Bioproducts). células COS-1 foram cultivadas em DMEM (Mediatech) suplementado com 10% de FBS. Todas as linhas celulares de cancro de pulmão foram mantidas em meio RPMI (Mediatech) suplementado com 10% de FBS. células imortalizadas humanas epiteliais brônquicas (HBEC) [9] foram generosamente fornecidos pelo Dr. Jerry Shay (Universidade do Texas Sudoeste Medical Center) e foram mantidos em BEGM isento de soro (Meio de Crescimento Epitelial brônquica, Lonza, Walkersville, MD). Todas as células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C sob 5% de CO

2/95% de ar.

Produção de linhas clonais com Estável ACSVL3 knockdown e Medição de aderente e Taxas de Crescimento Celular Anchorage-independentes

os clones com knockdown estável de ACSVL3 foram produzidos utilizando o pSilencer ™ 4,1-higro CMV vector (Ambion), tal como descrito anteriormente [6]. Os vectores contendo as sequências de knockdown ACSVL3-3 (segmentação nucleótidos 397-415) e ACSVL3-4 (segmentação nucleótidos 1863-1881), que foram ambos apresentados anteriormente para diminuir a expressão ACSVL3 em células humanas, foram transfectadas em conjunto em A549, EKVX, H82, e linhas celulares de cancro de pulmão H460 por electroporação. As células de controlo foram transfectadas com um vector pSilencer (fornecidos por Ambion) que não se destina a qualquer sequência de mRNA humano. Os clones que albergam os plasmídeos de forma estável e de controlo knockdown foram seleccionados por higromicina (250 ug /ml) a resistência e analisadas quanto à expressão ASCVL3 por imunofluorescência e Western blot. A proliferação celular e crescimento de ancoragem-independente foram medidos como descrito anteriormente [6].

RNA Dot Blot e Northern Blot Análises

A expressão tecidual múltipla (MTE) array contendo poli (A) -Selecionadas ARN a partir de 61 diferentes tecidos humanos adultos foi obtido a partir de Clontech. Uma sonda de ADNc foi preparada por amplificação por PCR de um fragmento de 657 pb (posições 1631-2287 de ACSVL3 /ARNm de SLC27A3, Acesso NCBI NM_024330 #) utilizando 5′-GCACTGTATGGCCACATCTCC-3 ‘e 5′-TCTCTCAGGTGCCTCAGGTGT-3′ como para a frente e reversa iniciadores, respectivamente, e o plasmídeo contendo ADNc de P435 ACSVL3 de comprimento completo como modelo. Para verificar a especificidade da sonda para ACSVL3, uma pesquisa BLAST e vários alinhamentos de sequências utilizando os outros membros da família ACSVL /SLC27A foi realizada e não revelaram qualquer semelhança com SLC27A1, 4, e 5, e apenas baixa similaridade com SLC27A2 e 6 ( não mostrado). Para o controlo, um 528-pb gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da sonda foi preparada por PCR utilizando 5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3 ‘e 5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’ como iniciadores directo e reverso, respectivamente. Condições para etiquetagem da sonda, hibridação e detecção foram como descrito anteriormente [10], [11]. A hibridação com a sonda GAPDH foi robusta para todos os pontos de ARNm (não mostrados).

Para a análise de Northern blot, a mesma sonda que para matriz MTE foi hibridado a um tecido múltiplo humano de transferência de Northern (Ambion, Austin, TX, EUA); uma sonda de frango β-actina foi utilizado como um controlo. A hibridação foi levada a cabo utilizando uma solução de expresso de hibridação (Clontech) durante a noite a 65 ° C e lavagem em condições de baixo rigor utilizando 2 x SSC, SDS a 0,05% durante 40 min a 65 ° C, seguido de 0,1 x SSC, 0,1% SDS durante 40 min a 50 ° C durante mais elevado rigor. A hibridação de sondas foi detectada pela exposição ao Imager FX Sistema molecular (Bio-Rad).

Fraccionamento subcelular e Análise de Western Blot

células HepG2 foram fraccionados como descrito anteriormente [12]. Western blot foi realizada tal como descrito previamente [13]. Para mouse imunodetecção anti-MnSOD, os anticorpos anti-ACSVL3 primários de coelho anti-TMEP ou coelho foram utilizados juntamente com HRP-conjugado anti-coelho e anticorpos secundários anti-rato.

imunofluorescência indireta e imunohistoquímica

células HepG2 cultivadas para -60% de confluência em lamelas de vidro foram fixados em 4% de formaldeído em PBS e permeabilizadas com 1,0% de Triton X-100 antes da incubação com primário (de coelho anti-ACSVL3, de ovelha anti-PMP70, dissulfureto de rato anti-proteina anticorpos isomerase, ou de coelho anti-sintetase de ATP) e secundário (anti-coelho conjugado com FITC ou rodamina-anti-ratinho conjugada ou anti-IgG de ovelha) tal como descrito anteriormente [14]. A fluorescência foi visualizada usando um microscópio Zeiss Axiovert epifluorescência. detecção imuno-histoquímica de ACSVL3 em secções histológicas de tumores de pulmão humano foi como previamente descrito [5], [6].

acil-CoA sintetase Ensaio

células COS-1 foram transfectadas com a expressão ACSVL3 P435 plasmídeo ou vector vazio através de electroporação como descrito anteriormente [15]. As células foram colhidas 3 dias após a transfecção, lavou-se, suspenso em tampão de homogeneização, e foram armazenadas a -80 ° C antes do ensaio. A activação de [1-

14C] marcado com FA (C16:0, C24:0, C18:1, C18:2, C20:4 ou C22:6) para os tioésteres CoA foi realizada como descrito anteriormente [15] . Ensaios com C16:0 continha 15 mg de proteína de células COS, ensaios com C24:0 continha 60 ug de proteína, e os ensaios com todos os outros FA continha 50 ug de proteína.

composição em ácidos graxos

H460 e células EKVX foram cultivadas até à confluência perto, colhidas por tripsinização suave, e lavadas com solução salina tamponada com fosfato. Os sedimentos de células que contêm 1,0 mg de proteína foram extraídos, derivatizado com brometo de pentafluorobenzilo, e quantificados por cromatografia capilar gasosa por captura de electrões, espectrometria de massa de iões negativos (GC /MS), tal como descrito por Lagerstedt et ai. [16]. Os resultados são apresentados como percentagem do total de ácidos graxos.

resultados

Tissue Distribuição das ACSVL3 Humano mRNA

expressão de mRNA ACSVL3 foi examinado por RNA dot análise usando uma expressão de múltiplos tecidos blot (MTE ™) 61 amostras de tecido humano adulto de matriz contendo (Fig. 1A). A intensidade de sinal de cada ponto indivíduo foi quantificada e foi calculada ACSVL3 expressão relativa à de GAPDH. Os sinais mais fortes foram normalizados ACSVL3 presente no pâncreas, estômago, aorta, e baço. No sistema cardiovascular, particularmente ACSVL3 ARNm foi enriquecido na aorta, em relação a todas as áreas do coração. A transcrição ACSVL3 era relativamente abundante em todo o sistema digestivo, indicando um possível papel na FA metabolismo intestinal. O mRNA pode também ser facilmente detectada na maioria dos tecidos linfóides, e no sistema reprodutivo e tracto urinário. intensidade de sinal moderada foi obtido a partir de a maioria das glândulas, com excepção da glândula mamária e pituitária, onde o nível aparentemente mais elevada. Quase todas as regiões do sistema nervoso central, com excepção para o cerebelo e a glândula pituitária, tinha níveis muito baixos de ARNm ACSVL3. expressão ACSVL3 no músculo esquelético também foi muito fraco. Sem sinal indicativo da ligação não específica da sonda ACSVL3 a várias amostras de RNA de controle e de DNA foi observada.

análise (

A

) RNA Humano expressão tecidual múltipla (MTE ™) matriz dot blot. O ARN dot blot foi hibridizado com uma

32P-marcado fragmento, 657 pb por PCR de ADNc derivado do ACSVL3 humano tal como descrito nos Métodos. A membrana foi despida e hibridado com uma sonda GAPDH para controlar a abundância de ARNm. A intensidade de sinal de pontos individuais foi quantificada utilizando o software ImageJ (disponível a partir de: https://rsbweb.nih.gov/ij/download.html), e calculou-se a expressão ACSVL3 em relação à de GAPDH. (

B

) humano de transferência de Northern de tecido múltiplo contendo 2 ug de ARN poli (A)

+ – ARN seleccionado foi hibridado com a mesma sonda de ADNc ACSVL3 como em

(A)

. As pistas são: M, Millenium Marcadores ™; 1, o cérebro; 2, fígado; 3, placenta; 4, intestino delgado; 5, cólon; 6, timo; 7 baço; 8, da próstata; 9, testículos; e 10, dos ovários. tamanhos aproximados das bandas detectadas são mostradas à direita. Controlo hibridação com sonda β-actina é mostrada no painel inferior.

Para estabelecer o tamanho de ARNm ACSVL3, um tecido múltiplo humano de transferência de Northern foi hibridada com a sonda utilizada para a mancha MTE. Esta sonda detectou um 2.7 kb ACSVL3 transcrição em todos os tecidos, excepto cérebro (Fig. 1B, em cima). A ausência de um sinal a partir da amostra do cérebro é provavelmente devido à baixa quantidade de ARNm presente nesta faixa, conforme documentado pelo controlo β-actina (Fig. 1B, parte inferior). O tamanho do mRNA é semelhante ao previsto a partir de ADNc ACSVL3. A segunda espécie de ARNm de aproximadamente 1,5 kb apareceu no fígado, testículos e da próstata (Fig. 1B, no topo). Este ARNm menor era mais abundante no fígado e, portanto, muito provavelmente contribuiu para o sinal elevado no fígado no dot blot. O pequeno tamanho desta sequência cruzada hibridante não seria capaz de acomodar a estrutura de leitura aberta de um ACS típica e, portanto, não foi ainda analisados. No geral, há uma boa correlação entre os níveis de expressão entre a Northern blot e arranjos de tecidos múltiplos.

Acil-CoA sintetase Atividade de ACSVL3 Humano

Foram analisadas a capacidade funcional da proteína ACSVL3 humano para ativar FA aos seus tioésteres CoA seguintes sobreexpressão em células COS-1. Em comparação com as células COS-1 transfectadas com vector vazio, as células que expressam ACSVL3 mostraram um aumento da actividade ACS quando ensaiada com vários substratos Fa. aumentos estatisticamente significativos na activação de ácido palmítico (C16:0), ácido oleico (C18:1ω9), ácido α-linoleico (C18:2ω6), e ácido araquidónico (C20:4ω6) foram observadas (Fig. 2). Embora nós rotineiramente medido maior capacidade para ativar a cadeia longa muito FA, ácido lignocérico (C24:0), este não atingiu significância estatística. Um ligeiro aumento na activação de ácido docosa-hexaenóico (C22:6w3) foi também observada, mas não foi estatisticamente significativa. À semelhança do que foi demonstrado para outras enzimas ACSVL [15], [17], [18], sobre-expresso ACSVL3 proteína activada de cadeia longa FA a uma muito maior extensão do que de cadeia longa FA.

COS-1 células que sobre-expressam ACSVL3 (barras cinzentas) do plasmídeo P435 (ver Métodos) e as células de controlo transfectadas com vector vazio (barras brancas) foram testadas quanto à actividade utilizando o ACS indicada

ácido gordo 14C como substrato, como descrito em Métodos. Uma unidade (U) de actividade de enzima = 1 pmol /min. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências de transfecção independentes. ns, não significativo. valores-p: * 0,05; ** 0,01; ***. 0,001

ACSVL3 subcelular localização em células HepG2

imunofluorescência indireta foi usada para localizar ACSVL3 endógena na linha de células de hepatoma humano HepG2. ACSVL3 exibiu um padrão de fluorescência observado quando ponteada por microscopia confocal (Fig. 3-A, d, e g). ACSVL3 imunocoloração destas estruturas puntiformes não colocalize quer com o marcador peroxissomal, PMP70 (Fig. 3B e C) ou o marcador de retículo endoplasmático, dissulfureto isomerase de proteína (Fig. 3e e f). ACSVL3 imunofluorescência colocalized parcialmente com mitocôndrias visualizadas usando ATP sintase como marcador (Fig. 3 h e i).

A microscopia confocal foi utilizada para detectar ACSVL3 endógeno em células HepG2 por imunocoloração com anticorpo anti-ACSVL3 (a, d, e g). Rotulagem dupla com anti-ACSVL3 (a) e anti-PMP70 (b) demonstraram que as vesículas contendo puntiformes ACSVL3 não foram peroxissomas quando as imagens foram fundidas (c). Rotulagem dupla com anti-ACSVL3 (d) e dissulfureto isomerase anti-proteína (e), como um marcador para o retículo endoplasmático não revelou uma co-localização na imagem resultante da fusão (F). Double-rotulagem utilizando anti-ACSVL3 (g) e anti-ATP sintase (h) apresentou co-localização parcial de ACSVL3 com mitocôndrias na imagem mesclada (i).

Para caracterizar ainda mais a localização subcelular de ACSVL3 , as células HepG2 foram fraccionados por centrifugação diferencial. Os homogenatos foram separados em fracções enriquecidas em núcleos (N), as mitocôndrias (M), peroxissomas (L), retículo endoplasmático (P), e o citosol isento de membrana (s), e analisados ​​por transferência de Western. ACSVL3 foi encontrado principalmente na fracção de M-(Fig. 4), como indicado pela presença do marcador de proteína mitocondrial de MnSOD. Em menor grau, a proteína pode também ser detectada na fracção N-. Nenhum sinal ACSVL3 poderia ser detectado na L-, P-, ou S-fracções. A presença de ACSVL3 no N-fracção é provavelmente devido à contaminação com células homogeneizadas incompleta, como a MnSOD e fosfatidiletanolamina de N-metiltransferase 2 (TMEP), também foram detectados nesta fracção (Fig. 4).

células HepG2 foram fraccionados em nuclear (N), mitocondrial (M), mitocondrial leve (L), microssomal (P), e citosólica (S) fracções por centrifugação diferencial, e um mitocondrial total de fracção (ML) foi ainda separado em mitocondrial purificado (Mito ) e de membrana (MAM) fracções associada-mitocôndrias, como descrito em Métodos. Cada pista foi carregada com -30 ug de proteína. análises de Western blot da mesma membrana foi realizada utilizando anticorpos contra ACSVL3, o marcador mitocondrial Mn-superóxido dismutase (MnSOD), e o marcador de MAM fosfatidiletanolamina N-metiltransferase (TMEP).

Como co-localização de ACSVL3 e mitocôndrias por imunofluorescência não estava completa, especulamos que ACSVL3 pode ser encontrada na fracção de membrana associada a mitocôndria (MAM), um compartimento de derivados de retículo endoplasmático que os sedimentos com mitocôndrias durante a centrifugação diferencial [19]. Por isso, resolvemos a fração MAM das mitocôndrias purificadas por centrifugação através de Percoll. A proteína específica do marcador MAM, TMEP, foi detectada em apenas a fracção de MAM, demonstrando a separação bem sucedida de mitocôndrias e MAM. Houve um enriquecimento significativo do sinal na mitocôndria ACSVL3 purificada, mas a proteína não era detectável na fracção MAM (Fig. 4). Como já observado apenas colocalização parcial de ACSVL3 com mitocôndrias por análise de imunofluorescência (Fig. 3), apesar da sua sedimentação nesta fracção e a sua ausência na fracção de MAM, propomos que a proteína ACSVL3 reside num novo compartimento subcelular, que é distinto mas fortemente associada com as mitocôndrias. Um resultado similar foi obtido para ACSVL3 murino [5].

ACSVL3 Expressão em Normal Pulmão humano e no pulmão Tumores

Nós relatado anteriormente que, apesar de fraca expressão no cérebro e, essencialmente, nenhuma proteína detectável em glia, níveis elevados ACSVL3 foram robustamente em glioma maligno e em linhas de células de glioblastoma humano [6]. Para determinar se outras malignidades overexpressed ACSVL3, examinámos a expressão desta proteína em pulmão humano normal e nos tumores do pulmão por imuno-histoquímica. ACSVL3 expressão modesta foi observada nas células epiteliais brônquicas e bronquiolares normais (Fig. 5). Nenhuma ACSVL3 coloração histoquímica foi visto em células alveolares tipo II ou de tipo I, as células caliciformes, células estromais, ou células que compreendem a vasculatura pulmonar. Em contraste, as secções de tecido a partir de tumores ressecados a partir de dois pacientes no Johns Hopkins Hospital, uma diagnosticados como adenocarcinoma e o outro como o carcinoma de células escamosas, exibiram níveis altamente elevados ACSVL3 (não mostrado). Para confirmar estas observações iniciais, foi realizada análise imuno-histoquímica em uma matriz de tecido contendo 67 tumores pulmonares humanos diferentes. Representado na matriz foram 25 carcinomas de células escamosas, 21 adenocarcinomas, 6 adenocarcinomas papilares, 7 carcinomas de células pequenas, 3 carcinomas de grandes células, um carcinoma bronquioloalveolar, um carcinoma de células escamosas basaloide, e 3 tumores carcinóides. Destes tumores, 100% mostraram sobreexpressão de ACSVL3; vários tumores representativos são mostrados na Fig. 5. Não houve correlação evidente entre a extensão da expressão ACSVL3 eo estado de diferenciação do tumor.

As secções de parafina de tumores pulmonares presentes em uma matriz de tecido foram imunocoradas com ACSVL3 anticorpo anti-(marrom) e contrastadas com hematoxilina (azul). Tumores representante dos 67 tumores diferentes presentes na matriz, bem como o tecido pulmonar normal, são mostrados. Todos os tumores coradas positivas para ACSVL3. ampliação total, 400 ×. Bar = 50 mm.

ACSVL3 expressão no pulmão Lines tumor de células

Para confirmar e estender essas observações, nós examinamos a expressão ACSVL3 em células epiteliais brônquicas humanas normais (HBEC), e, várias linhas celulares de cancro do pulmão. expressão ACSVL3 era praticamente indetectável no HBEC (Fig. 6A e 6B). As linhas celulares derivadas de tumores de pulmão humano, que representam carcinoma de células pequenas (H82), carcinoma de células não-pequenas (A549), adenocarcinoma (EKVX), carcinoma de células escamosas (U1752), e carcinoma de células grandes (H460), todos expressos robustamente ACSVL3 ( Fig. 6A).

(

A

) Crescimento em condições de cultura padrão. linhas celulares de cancro de pulmão HBEC e cinco foram cultivadas tal como descrito em Métodos e analisadas quanto à expressão ACSVL3 por Western blot. As linhas celulares tumorais foram derivadas do carcinoma de células não-pequenas (A549), carcinoma de células pequenas (H82), carcinoma de grandes células (H460), adenocarcinoma (EKVX), e carcinoma de células escamosas (U1752). expressão de p-actina foi determinada como um controlo de carga. (

B

) Efeito da redução da taxa de crescimento na expressão ACSVL3 em linhas celulares de cancro do pulmão. HBEC, cultivadas em BEGM isento de soro, crescer significativamente mais lento do que linhas celulares de cancro. Para diminuir as suas taxas de crescimento, as células A549, H82, H460, e U1752 foram transferidos para BEGM. Todas as células foram mantidas neste meio durante 3 semanas, altura em que foram colhidas e sujeitas a análise de Western blot. As células de tumor cultivadas em meio padrão, RPMI mais 10% de soro fetal de bovino (FBS), foram colhidas para comparação. As taxas de crescimento em BEGM para todas as linhas celulares de cancro foram reduzidos em mais de 50%.

HBEC crescer a uma velocidade lenta como eles são cultivados em meio sintético isento de soro (BEGM) para impedir a diferenciação escamosa [ ,,,0],20]. Porque as linhas de células tumorais, cultivadas em meio rico contendo soro fetal bovino, crescer significativamente mais rápido do que HBEC, foi perguntado se altos níveis de ACSVL3 eram simplesmente uma consequência da rápida taxa de crescimento. Quatro linhas celulares de tumor, A549, H82, H460, e U1752, foram transferidos para BGEM isento de soro e foram mantidas neste meio durante três semanas. Apesar de uma diminuição de 50% na taxa de crescimento, todas estas linhas celulares de expressão elevada mantida ACSVL3 (Fig 6B.). Esta observação sugere que outros do que a taxa de crescimento fatores são responsáveis ​​pela manutenção de níveis elevados ACSVL3 em linhas celulares de cancro.

Efeito da ACSVL3 Knockdown em Aderente e Crescimento não-aderente de pulmão Lines tumor de células em cultura

knockdown Estável de expressão ACSVL3 em células de glioblastoma diminuíram seu fenótipo maligno na cultura [6]. Tanto o crescimento em placas de cultura e a capacidade para formar colónias em ágar mole suspensão foram mais característica de células normais quando ACSVL3 foi esgotado. Para determinar se a expressão ACSVL3 também influenciado o crescimento de células de cancro do pulmão, produzimos quatro linhas com ACSVL3 estável knockdown utilizando RNA de interferência tal como descrito em Métodos. linhas de células de controlo que albergam o plasmídeo que codifica uma forma estável um ARN gancho de cabelo curto mexidos também foram produzidos. Todas as quatro linhas celulares de knockdown diminuiu os níveis de proteína ACSVL3 por Western blot (Fig. 7).

O produtoras de vector de gancho de cabelo curto pSilencer (Ambion) foi utilizado para gerar diversas linhas celulares de cancro do pulmão com a diminuição da expressão ACSVL3 como descrito em métodos. Foram selecionados linhas clonais de H460, H82, A549 e células cancerosas EKVX pulmonares com knockdown estáveis ​​(KD) de ACSVL3. linhas de controle do porto de forma estável um plasmídeo contendo uma sequência mexidos que não tem como alvo qualquer mRNA humanos ou roedores. (

Um

) ACSVL3 expressão em células de controlo e KD foi avaliada por Western blotting. (

B

) Gel-Pro Analyzer 4.0 software foi utilizado para quantificar os sinais de Western blot em (A). Expressão de ACSVL3 em relação ao p-actina foi calculada para cada par de controlo e linhas de células de KD. razões de linhas de células de controlo foram arbitrariamente definida como 100 e foi calculada a expressão relativa, normalizada de ACSVL3 em células kD. Barras brancas, células de controlo; barras cinza, as células KD.

Em seguida, mediram o efeito de ACSVL3 knockdown sobre a proliferação de linhas de células de câncer de pulmão cultivadas H460 e H82. Como mostrado na Fig. 8A, a falta de ACSVL3 diminuiu as taxas de crescimento celular por 65-76% (medido no dia 6). Também medimos o crescimento não aderente de quatro linhas celulares, A549, EKVX, H82 e H460, em suspensão de agar mole. Como mostrado na Fig. 8B, a formação de colónias foi reduzida em todas as linhas celulares ACVL3 deficiente por 65-80%. Estes resultados indicam que a depleção ACSVL3 em células de câncer de pulmão, como em células de glioblastoma, diminui a sua

in vitro

crescimento fenótipo maligno.

(

A

) O crescimento em cultura. Controle (▪) e células de knockdown (▴) H460 e H82 (5 × 10

3) foram semeadas em placas de 6 poços. Nos dias 2, 4, 6 e 8, as células de poços em triplicado foram colhidas por tripsinização e contadas usando um hemocitômetro. A média ± S.D. é traçado. (

B

) crescimento independente de ancoragem.