Sumário
Um grande desafio para os oncologistas e farmacologistas é desenvolver medicamentos menos tóxicos que irão melhorar a sobrevida de pacientes com câncer de pulmão. Frondoside A é um glicosídeo triterpeno isolado a partir do pepino do mar,
Cucumaria frondosa
e foi demonstrado ser um composto altamente seguro. Nós investigamos o impacto da Frondoside A sobre a sobrevivência, migração e invasão
in vitro
e no crescimento do tumor, metástase e angiogênese
in vivo
isoladamente e em combinação com a cisplatina. Frondoside A causou redução dependente da concentração na viabilidade de LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, HepG2 e mais de 24 horas por meio de uma caspase 3/7-dependente via de morte celular. As concentrações de IC50 (que produzem metade da inibição máxima) a 24 h estavam entre 1,7 e 2,5 uM de Frondoside A. Além disso, Frondoside Um induziu uma inibição do tempo e dependente da concentração de migração celular, invasão e angiogénese
In vitro
. Um Frondoside (0,01 e 1 mg /kg /dia i.p., durante 25 dias) diminuiu significativamente o crescimento, a angiogénese e metástase de nódulo linfático xenoenxertos de tumores em ratinhos atímicos LNM35, sem efeitos colaterais tóxicos evidentes. Um Frondoside (0,1-0,5 uM) também impediu significativamente basal e induzida por bFGF angiogénese no ensaio CAM da angiogénese. Além disso, Frondoside Um melhorada à inibição do crescimento do tumor do pulmão induzida pela cisplatina agente quimioterapêutico. Estes resultados identificam Frondoside A como um novo agente terapêutico promissor para o câncer de pulmão
Citation:. Attoub S, Arafat K, Gélaude A, Al Sultan MA, Bracke M, Collin P, et al. (2013) Frondoside A Efeitos supressor sobre Lung Cancer sobrevivência, crescimento tumoral, angiogênese, invasão e metástase. PLoS ONE 8 (1): e53087. doi: 10.1371 /journal.pone.0053087
editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 13 de junho de 2012; Aceito: 27 de novembro de 2012; Publicação: 08 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Attoub et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo número de concessão FMHS NP /08/27 (SA), a concessão Universidade UAE abrigo de um contrato não. 01-04-8-11 /09 (SA), o Fundo Fox Terry para Cancer Research (SA e TA), o UAEU-NRF 09/10 número de concessão 21MO72 (SA), e do Instituto de Tecnologia Maine, Gardiner, Maine, EUA, e do Instituto Nacional do Câncer, Programa RAPID (PC). As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Peter Collin é diretor, gerente do laboratório, funcionários e estoque-titular de Coastside Bio recursos, um Maine, EUA Corporation. Thomas Adrian e Peter Collin são co-inventores de uma patente dos Estados Unidos descrevendo Frondoside A e outros glicosídeos pepino do mar como agentes anti-câncer putativos, e podem beneficiar financeiramente se Frondoside A torna-se uma droga para cancros humanos. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O câncer de pulmão é a forma mais comum de cancro com uma das maiores taxas de mortalidade em o mundo. terapias direcionadas para os subgrupos selecionados de pacientes constituem um progresso notável no tratamento do cancro do pulmão. No entanto, apesar destes avanços, controvérsias permanecem, pacientes morrem, e uma cura permanece indefinida [1]. compostos naturais estão a emergir como uma nova geração de agentes anti-cancro com toxicidade limitada em doentes com cancro [2], [3]. Eles podem ter um alto valor em tumores resistentes às quimioterapias clássicas ou resistentes aos inibidores da tirosina quinase, tais como gefitinib
Os pepinos do mar têm sido valorizadas por centenas de anos na dieta chinesa como uma iguaria de alimentos, bem como um medicamento para uma ampla variedade de doenças. Nos Estados Unidos e Canadá, os tecidos são secos pepino do mar, e pulverizado encapsulado como nutracêuticos para over-the-counter suplementos alimentares de saúde, dirigidos principalmente em condições inflamatórias em seres humanos e animais de companhia [4]. Frondoside A é um glicosídeo triterpen�de isolado do pepino Atlântico,
Cucumaria frondosa
. (Ver [5] para a estrutura química). Estudos recentes demonstram que baixas concentrações de Frondoside Um inibir o crescimento e induziu apoptose de células pancreáticas, leucemia e câncer de mama humano através da activação da caspase [6] – [8]
Os agentes quimioterápicos atualmente em uso para câncer de pulmão. ainda são insatisfatórios devido à toxicidade e induzida por drogas resistência co-lateral associada [9] – [11], que motivam a nossa investigação sobre o impacto da Frondoside a na sobrevivência de não-pequenas células de pulmão humano, migração e invasão
in vitro
e no crescimento do tumor, metástase e angiogênese
in vivo
isoladamente e em combinação com a cisplatina.
Materiais e Métodos
cultura de células e reagentes
pulmão humano de células cancerosas LNM35 (NSCLC) [12], A549 e NCI-H460-Luc2 (Caliper Life Sciences, EUA) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), melanoma humano MDA-MB-435, da mama humano células de adenocarcinoma MCF-7, e células de hepatoma humano HepG2 foram mantidas em DMEM (Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Todos os meios foram suplementados com antibióticos (penicilina 50 U /ml; estreptomicina 50 ug /mL) (Invitrogen, Cergy Pontoise, França) e com 10% de soro fetal bovino (FBS, Biowest, Nouaille, França). Células EndoGRO ™ Veia Umbilical Humana endoteliais (HUVECs) (Millipore, Temecula, CA) foram mantidas em EndoGRO ™
-MV-VEGF Media Kit Completo (Millipore, Temecula, CA). A cisplatina foi adquirido de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França). Frondoside A foi purificado a partir de
Cucumaria frondosa
, colhido perto de Stonington, Maine e a pureza (99,9%) confirmada por RMN como descrito anteriormente [13], [14].
viabilidade celular
As células foram semeadas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços. Após 24 h, as células foram tratadas durante mais 24 h com diferentes concentrações de Frondoside A (0,01-5 ^ M), em triplicado. As culturas de controlo foram tratadas com DMSO a 0,1%. O efeito de um Frondoside sobre a viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo Luminescent (Promega Corporation, Madison, EUA), com base na quantificação de ATP, o que sinaliza a presença de células metabolicamente activas. O sinal luminescente foi medida utilizando o sistema GLOMAX Luminómetro. Os dados foram apresentados como a viabilidade proporcional (%) comparando o grupo tratado com as células não tratadas, a viabilidade dos quais se assume como sendo 100%.
Caspase 3/7 actividade
células foram LNM35 semeadas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços e tratadas com Frondoside a (1-2,5 mM) durante 2 h e 24, em triplicado. a actividade da caspase-3/7 foi medido usando um luminescente caspase-Glo kit de ensaio 3/7 seguindo as instruções do fabricante (Promega Corporation, Madison, EUA). Caspase reagente foi adicionado e a placa foi misturada usando um agitador orbital e incubaram-se durante 2,5 h à temperatura ambiente. A luminescência foi medida utilizando um sistema GLOMAX Luminómetro.
Cicatrização de feridas motilidade ensaio
LNM35 células foram cultivadas em pratos de seis cavidades de cultura de tecidos até confluência. As culturas foram incubadas durante 10 min com tampão de Moscona. A raspagem foi feita através da monocamada confluente com uma ponta de pipeta de plástico de 1 mm de diâmetro. Em seguida, os pratos foram lavados duas vezes e incubados a 37 ° C em meio RPMI fresco contendo soro fetal bovino a 10%, na presença ou ausência das concentrações não-tóxicas de Frondoside A (0,1-0,5 uM). No lado inferior de cada prato, dois locais arbitrários foram marcados, onde a largura da ferida foi medida com um microscópio invertido (× objectivo 4) (1X71 Olympus, Japão). A motilidade foi expressa como a média ± SEM de a diferença entre as medições no tempo zero e o período de 6, 24 e 30 h de tempo considerado.
ensaio de invasão de Matrigel
A capacidade de invasão do cancro do pulmão LNM35 células tratadas com Frondoside a (0,1-1 uM) foi testada utilizando BD Matrigel Invasão câmara (8 mícrons de tamanho de poro; BD Biosciences, Le Pont de Claix, França) de acordo com o protocolo do fabricante. O inibidor de PI3-quinase LY294002 (20? M) foi utilizada como um inibidor positivo da invasão celular. Resumidamente, as células (1 x 10
5 células em 0,5 mL de meio e a concentração indicada de Frondoside A) foram semeadas em câmaras superiores do sistema, os poços de fundo no sistema foram cheios com meio RPMI suplementado com 10% de fetal de soro bovino como um quimio-atractor e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 24 h. As células não-penetrantes foram removidos a partir da superfície superior do filtro com um cotonete. As células que migraram através do Matrigel foram fixadas com formaldeído a 4%, coradas com DAPI e contados em 25 campos aleatórios sob um microscópio. O ensaio foi realizado em duplicado e repetidos três vezes para análise quantitativa.
membrana Corioalantóide (CAM) ensaio de angiogénese
Este ensaio foi realizado como descrito anteriormente [15], com algumas modificações. Resumidamente, os ovos fertilizados foram incubadas durante 3 dias a 37, 8 ° C com uma humidade de 48%. No dia 4, albumina foi removido para retirar a casca da CAM e o desenvolvimento de uma janela se na casca do ovo expondo a CAM, e coberta com uma película de respiração (Suprasorb F®). Os ovos foram devolvidas à incubadora até ao dia 10, antes da aplicação dos compostos de teste. O composto de teste e composto de controlo (DMEM sem FBS a 10%) dissolvido em DMEM sem FBS a 10% foram vertidos em discos separados estéreis (12 mm de diâmetro), que foram deixados a secar sob condições estéreis. Uma solução de acetato de cortisona (125 ug /disco) foi vertida em todos os discos para evitar uma resposta inflamatória. Os discos de teste sondados com bFGF humano recombinante (Peprotech) serviu como um controlo para a estimulação da angiogénese. Em cada CAM, o composto de controlo e do disco que contém o composto de ensaio contendo disco foram colocadas a uma distância de 1 cm. As janelas estavam cobertas e os ovos foram incubados até o dia 14, antes da avaliação da angiogênese. Portanto, os ovos foram inundadas com 10% de formalina tamponada e os ovos foram mantidos à temperatura ambiente durante pelo menos 20 minutos. A CAM, a área dos discos incluídos, foi colocado numa placa de Petri com 10% de formalina tamponada. Os discos de plástico foram removidos e imagens de contraste de fase da área dos discos de plástico foram tomadas. O índice vascular foi medida como descrito previamente [16]. intersecções vasculares em uma grade contendo três círculos concêntricos (6, 8 e 10 mm de diâmetro com o centro como centro do disco) foram contadas. O índice angiogénico =
(tc) /c
, com
t
o número de cruzamentos na área coberta pelo disco de teste e
c
o número de cruzamentos na área coberta pelo disco de controlo no mesmo ovo. O U-teste de Mann-Whitney foi utilizado para análise estatística (p 0,05).
Vascular formação do tubo de ensaio
Avaliação da
in vitro
formação capilar usado Matrigel (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, França). Matrigel é um carcinoma de células escamosas da matriz da membrana basal composta principalmente de colagénio IV, laminina, entactina, e proteoglicanos de sulfato de heparano. A matriz Matrigel foi descongelado, misturou-se suavemente até à homogeneidade utilizando pipetas arrefecida, e diluída v /v com o EndoGRO ™
-MV-VEGF O meio completo Media Kit (Millipore, Temecula, CA, EUA). Matrigel, 50 ul /poço, suplementado com péptidos angiogénicos e outros efectores foi usado para revestir os poços de placas de 96 poços. A placa foi então incubada durante uma hora a 37 ° C para permitir que a solução de matriz para solidificar antes do tratamento. HUVECs (a uma densidade de cerca de 4 × 10
4 células /poço e a concentração indicada de Frondoside A) foram plaqueadas a cada poço e incubou-se durante 8 h a 37 ° C em 0,1 mL de EndoGRO ™
-MV -VEGF meio completo kit de mídia (Millipore, Temecula, CA, EUA). Em seguida, as células foram fotografadas usando um fotomicroscópio contraste de fase invertida. A área de crescimento da rede tubular foi comparado no controle e inibidor tratados matriz Matrigel. formação do tubo foi quantificada através da contagem do número de estruturas semelhantes a tubos formados em cada poço. O efeito de Frondoside A na viabilidade das HUVECs foi determinada utilizando um ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo Luminescent (Promega Corporation, Madison, EUA), como descrito anteriormente para as células cancerosas.
crescimento de tumores e metástases de ensaio
as experiências com animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo comitê de ética animal e Institutional animal Care na Faculdade de Medicina Ciências da Saúde /Universidade dos Emirados Árabes Unidos. Seis semanas de idade atímicos NMRI fêmeas ratinhos nude (nu /nu, Charles River, Alemanha) foram alojados em cabines de fluxo laminar de ar filtrado e manipulados sob condições assépticas. Procedimentos que envolvem animais e seus cuidados foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais que estão em conformidade com a Faculdade de Medicina Ciências da Saúde, leis e políticas (CEE Directiva 86/609, JO L 358, 1, 12 de dezembro de 1987; e Guia NIH para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Publicação NIH No. 85-23, 1985) nacionais e internacionais. células LNM35 (1 × 10
6 células em 200 ul de PBS) foram injectadas subcutaneamente no flanco lateral dos ratinhos nus. Uma semana após a inoculação, quando tumores tinham atingido o volume de cerca de 150 mm
3, animais (seis em cada grupo) foram tratados no primeiro protocolo de 25 dias com Frondoside A (0,01 e 1 mg /kg /dia, ip ) ou solução veículo (controle), a fim de determinar o efeito da Frondoside a sozinho no crescimento de tumores e metástase. No segundo protocolo, os animais foram tratados durante apenas 10 dias com a dose mais baixa de Frondoside A (0,01 mg /kg /dia, ip), cisplatina (1 mg /kg /dia, ip), ou com o tratamento combinado Frondoside A e cisplatina . Os animais de controlo foram tratados com solução veículo. dimensões dos tumores e os pesos dos animais foram medidas a cada 3 dias. O volume do tumor (V) foi calculada utilizando a fórmula: V = 0,4 × a × b
2, com “um” é o comprimento e “b” a largura do tumor. Após o sacrifício, os tumores e linfonodos axilares foram extirpados e pesados.
determinação Imuno-histoquímica da CD31 /plaquetas-endotélio molécula de adesão celular 1 (PECAM-1) para densidade de microvasos
O efeito Um dos Frondoside na angiogénese foi avaliada usando CD31 imuno-coloração. Os tecidos tumorais foram rapidamente congelados em isopentano a -130 ° C e armazenado a -70 ° C até posterior processamento. Oito mícrons secções congeladas foram fixadas em acetona, e incubados durante a noite com um anticorpo de CD31 (clone MEC13.3, 1:100) (BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA). As lâminas foram então lavadas três vezes em PBS e incubadas com o anticorpo secundário marcado com rodamina (de cabra anti-rato 1:100) durante uma hora à temperatura ambiente. A área ocupada pelos microvasos CD31-positivas e área total do tecido por seção foram comparados entre os ratos tratados e de controlo. Todas as análises foram realizadas de forma cega.
Os resultados foram expressos em média ± S.E.M. do número de experiências. A diferença entre os valores experimentais e de controlo foram avaliados por ANOVA seguido de post-hoc teste de comparação múltipla de Dunnett. O crescimento do tumor e estudos metástases foram analisados utilizando o teste t de Student não pareado. P 0,05 indicam uma diferença significativa
Resultados
Efeito da Frondoside A da viabilidade celular
Como mostrado na fig.. 1, as concentrações Frondoside A (0,01-5 ^ M) provocou uma redução dependente da concentração na viabilidade celular de LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, HepG2 e células durante 24 horas. As concentrações de IC50 (que produzem metade da inibição máxima) a 24 h estavam na gama de 1,7 e 2,5 uM Frondoside A para todas as linhas celulares.
em crescimento exponencial LNM35 (A), A549 (B), NCI-H460 -Luc2 (C), MDA-MB-435 (D), células MCF-7 (e), e HepG2 (F) foram tratadas com veículo (DMSO a 0,1%) e as concentrações indicadas de Frondoside A. as células viáveis foram ensaiadas quanto descrito em Materiais e Métodos. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.
Colunas
, média;
bares
, S.E.M. ** Significativamente diferente em P 0,01, *** Significativamente diferente em P . 0.001
Frondoside A induz a actividade da caspase-3/7 ativação
A caspase-3/7 é essencial nas vias de morte celular por apoptose. A actividade relativa de caspases 3/7 foi analisada em células tratadas LNM35 durante 2 e 24 h com Frondoside A (1-2,5 M), e normalizada para o número de células por poço. Como mostrado na Fig. 2, caspase 3/7 actividade aumentou de 2,5 e 10,8 vezes em células tratadas durante 24 LNM35 h com Frondoside A 1 e 2,5 uM respectivamente. Foi observado um efeito semelhante após tratamento com Frondoside A (1-2,5 mM) durante 2 h (dados não mostrados).
foi analisada em células tratadas LNM35 durante 24 h com Frondoside A (1-2,5 M), normalizada para o número de células viáveis por poço e expressa como a indução de dobragem em comparação com o grupo de controlo. * Significativamente diferente em P . 0,05
Impacto da Frondoside A em xenoenxertos LNM35
Para confirmar a relevância farmacológica dos nossos
in vitro
dados, a atividade anticancerígena de Frondoside a foi investigado
in vivo
em ratinhos atímicos inoculados com células cancerosas LNM35 pulmonares. O crescimento dos xenoenxertos de tumor humano LNM35 foi monitorizado a cada terceiro ou quarto dia durante 25 dias consecutivos após administração i.p. diariamente injecção de 0,01 mg e 1 mg /kg de Frondoside A. O tratamento com a dose mais baixa de Frondoside A (0,01 mg /kg /dia) reduziu o volume dos xenoenxertos LNM35 em 41% (Fig. 3A). Uma diferença semelhante também foi encontrado em peso do tumor no final da experiência (2,1 +/- 0,3 g contra 4,5 +/- 0,8 g;
P 0,05
; A Fig. 3C). O tratamento com a dose mais elevada (100 vezes mais) de Frondoside A (1 mg /kg /dia) reduz o volume do tumor de cerca de 43,9% dos xenoenxertos LNM35 (Fig. 3B). Quase diferença semelhante foi encontrado em peso do tumor no final da experiência (3 +/- 0,5 g contra 4,5 +/- 0,8 g; A Fig. 3D). Esta experiência demonstrou claramente que a dose mais baixa de Frondoside A (0,01 mg /kg /dia) é ideal para a inibição do crescimento do tumor. Não houve efeitos indesejáveis manifestos de Frondoside um tratamento sobre o comportamento animal ou peso corporal em ambos experimento (Fig. 3E e 3F). Além disso, não houve anormalidades visíveis no momento da necropsia, ou quaisquer outros sinais óbvios de toxicidade, como descrito anteriormente pela nossa equipa [7]
A) B) O volume de tumor de xenoenxertos LNM35 inoculadas subcutaneamente em ratinhos nus e tratados com Frondoside A (0,01 e 1 mg /kg, injecções intra-peritoneal, respectivamente) ou solução veículo de controle por si só, para um total de 25 dias. Os pontos de dados representam a média ± S.E.M. de 6 ratinhos por grupo. Acampamento; D) Peso do tumor obtido a partir do mesmo controlo e ratinhos nus tratados. Os pontos de dados representam a média ± S.E.M. de 6 ratinhos por grupo.
Colunas
, média;
bares
, S.E.M. E) F) O peso corporal destes ratinhos. Os pontos de dados representam a média ± S.E.M. de 6 ratinhos por grupo. * Significativamente diferente em P .
A inibição da angiogênese por Frondoside A nos tumores xenoenxerto e no ensaio CAM 0,05
in vivo
e nas estruturas do tipo capilar
em vitro
a angiogênese é um alvo atraente na terapia do cancro, não só porque fornece oxigênio e nutrientes para a sobrevivência das células tumorais, mas também fornece o caminho para a propagação metastática destas células cancerosas. Em primeiro lugar, demonstra-se que nas zonas em proliferação na periferia do tumor, a densidade de microvasos (medida por coloração CD31) foi significativamente reduzida pela Frondoside A (0,01 mg /kg /dia) (Fig. 4, painel direito) em comparação com o Os tumores tratados com controlo (Fig. 4, painel da esquerda). Em seguida, utilizou-se o ensaio CAM envolve a coordenação e a integração das respostas multicelulares durante o desenvolvimento do embrião de pinto para confirmar este efeito anti-angiogénico potencial de Frondoside A. Tal como mostrado na Fig. 5 e 6, bFGF (2 ug /ml), 15% estimularam formação de novos vasos angiogénicos com índices estatisticamente diferentes em comparação com o meio DMEM de controlo. Um Frondoside (100 e 500 nM) inibiu a angiogénese da base de uma maneira dependente da concentração com respectivamente 7% e 12% de inibição do índice angiogénico comparação com o controlo (Fig. 5 e 6). A formação de novos vasos sanguíneos induzidos por bFGF também foi completamente suprimida por Frondoside A (500 nM) (Fig. 5 e 6). Finalmente, para avaliar se o efeito anti-angiogênico do Frondoside A envolve uma interação direta do composto com células endoteliais, realizamos estudos comparativos sobre a formação de estruturas do tipo capilar
in vitro
, utilizando HUVECs semeadas em Matrigel placas -Revestido. Como mostrado na Fig. 7A, as células endoteliais humanas têm a capacidade de formar estruturas capilares quando semeadas e cultivadas no topo do substrato de Matrigel. As células de controlo passar do seu padrão uniforme inicial de camadas de células dispersas e se associam para formar uma rede de aglomerados de células ligadas por processos longos, multicelulares que conduzem à formação de estruturas semelhantes a tubos. A adição de concentrações não-tóxicas de Frondoside A (0,01-1 ^ M) resultou numa inibição acentuada do presente fenótipo angiogénico espontânea (Fig. 7A e 7B). Frondoside A inibição induzida deste fenótipo angiogénico espontânea ocorreram sem redução significativa da viabilidade celular (Fig. 7C). Tomados em conjunto, estes dados confirmam um potencial anti-angiogênico forte de Frondoside A.
coloração imuno-histoquímica de tumores xenoenxerto de pulmão para CD31 (densidade de microvasos).
CAM foi tratado com controlo (meio isento de soro), 100 nM Frondoside a, 500 nM Frondoside a, 2 ug /ml de bFGF, 2 ug /mL de bFGF + 500 nM Frondoside a e a vascularização de discos de teste foi fotografado.
Barras
indicam índices angiogénicos (%) de apalpada do CAM com 2 mg /mL bFGF, 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 ng /mL bFGF + 500 nM Frondoside A. Os dados representam ± médios SD (Mann-Whitney U-test, *: p 0,05, ***: p 0,01). Em cada experiência, seis ovos foram testados por condição.
A) Os padrões de angiogénese induzida por células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) cultivadas em matriz de Matrigel em placas de 96 poços na ausência ou na presença de Quantificação da Frondoside A. B) da morfogénese tubular induzida em células HUVEC cultivadas na ausência ou na presença de Frondoside A. formação do tubo foi determinada pelo comprimento das estruturas semelhantes a tubos contendo células ligadas. Os dados são a média ± S.E.M. de três experiências separadas. Os asteriscos indicam que valores significativamente diferentes foram obtidos em presença dos inibidores indicados comparada a estimulação de controlo correspondente. *** Significativamente diferente em P 0,001. C) As células HUVEC foram tratadas com veículo (DMSO a 0,1%) e as concentrações indicadas de Frondoside A. As células viáveis foram analisadas como descrito em Materiais e Métodos. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.
Colunas
, média;
bares
, SEM
Frondoside Um prejudica também a migração de células do cancro do pulmão e da invasão
in vitro
e metástase
in vivo
progressão do câncer está associada com a revogação dos controlos normais que limitam a migração e invasão celular, levando à metástase. pacientes com câncer de pulmão estão em alto risco de recorrência na forma de doença metastática. Metástase começa com a migração de células no tumor primário, conduzindo a invasão de tecido local e entrada em vasos linfáticos ou do sangue. A capacidade de Frondoside A para reduzir a migração celular foi investigada usando um
in vitro
modelo de cicatrização de feridas clássico. Um Frondoside reduzida migração celular de células LNM35 de uma forma sua concentração e do tempo-dependente (Fig. 8A). Da mesma forma, Frondoside Um prejudicada a invasão de células LNM35 no ensaio de invasão de Matrigel (Fig. 8B). Frondoside uma inibição induzida de migração celular e invasão de matrigel ocorreu sem uma redução significativa da viabilidade celular (Fig. 1A).
) Feridas A foram introduzidos em LNM35 confluentes mono-camadas cultivadas na presença ou ausência (controlo) de Um Frondoside (0,1-0,5 uM). A distância média percorrida de que as células a partir da borda da área raspada durante 6, 24, e 30 h a 37 ° C foi medida de um modo cego, utilizando um microscópio invertido (4 × ampliações). Os dados são médias ± S.E.M. de duas experiências independentes. B) células LNM35 foram incubadas durante 24 h na presença ou ausência de um Frondoside (0,01-1 ^ M) e LY294002 (20 uM). As células que invadiram em Matrigel foram marcados, tal como descrito em Materiais e Métodos.
Colunas
, média; barras, S.E.M. Linfonodos peso metástase de xenoenxertos de cancro estabelecidas pulmão humano tratadas com Frondoside Um 0,01 mg /kg (C) e 1 mg /kg (D) todos os dias durante 25 dias.
Colunas
, média;
bares
, S.E.M. * Significativamente diferente em P 0,05, ** Significativamente diferente em P 0,01, *** Significativamente diferente em P . 0.001
Em seguida, avaliamos o comportamento metastático da linha celular pulmonar humana LNM35 examinando gânglios linfáticos axilares. O exame histológico dos gânglios linfáticos em ratinhos LNM35 de rolamento revelou a presença de células LNM35 em todos os gânglios linfáticos, tanto do controlo e Frondoside Um ratinhos tratados (dados não mostrados). No grupo de tratamento de controlo, o peso médio nodos linfáticos era 548,5 +/- 112,8 mg em comparação com 256 +/- 43,3 +/- 55,7 e 268,8 mg nos grupos tratados com Frondoside Um 0,01 mg e 1 mg /kg /dia, respectivamente (Fig. 8C e 8D).
Frondoside Um aumenta a actividade anti-cancro de cisplatina
Como se mostra na Fig. 9A, a administração diária de Frondoside A a ratinhos nus reduziu o crescimento de xenoenxertos de tumor humano LNM35 por 40,3% ao dia 10. A inibição do crescimento do xenoenxerto de tumor LNM35 por Frondoside A foi comparável com a produzida pelo agente anti-cancro cisplatina-danificam o ADN (46,9% ). O tratamento combinado de Frondoside A com a cisplatina resultou numa potenciação notável (67,6%;
P 0,05
) do efeito terapêutico a cisplatina (Fig. 9A). Não houve efeitos colaterais manifestos de o tratamento combinado sobre o comportamento do animal ou peso corporal (Fig. 9B).
A) Frondoside A melhora eficácia cisplatina contra células NSCLC LNM35 de crescimento como xenoenxertos. B) Impacto das Frondoside A e cisplatina sós ou em combinação sobre o peso corporal. * Significativamente diferente em P . 0,05
Discussão
Apesar dos avanços na biologia molecular do câncer de pulmão, um melhor diagnóstico e terapias-alvo, mesmo ideais, os protocolos atuais para o tratamento de câncer de pulmão câncer ainda são insuficientes para produzir impressionantes benefícios clínicos e a cura dos doentes com cancro do pulmão continua a ser vencida. As atuais drogas terapia-alvo desenvolver resistência e eles são muito caros e não estão disponíveis para a maioria dos pacientes com câncer de pulmão no mundo. Muitas drogas têm relativamente baixa atividade; alguns pacientes são curados, com uma breve, se for o caso, o aumento da sobrevida [17]. A história de agentes anti-cancro, tal como o paclitaxel, que mostra o mecanismo de acção foi identificado vários anos após a sua eficácia clínica foi demonstrada. Apesar de não saber o mecanismo de ação da droga, acreditamos que o
in vitro
, bem como a forte
in vivo
efeitos anti-câncer de Frondoside Um deve se traduzir na clínica para um novo potente anti-agente de câncer de pulmão.
no presente estudo, investigamos o impacto da Frondoside a sobre a progressão de células de câncer de pulmão. Mostrámos que Frondoside A causou concentração responsivos (0,01-5 uM) diminui na viabilidade de LNM35, A549, e as células NCI-H460-Luc2 mais de 24 horas por meio da caspase 3/7-dependente via de morte celular. As concentrações de IC50 (que produzem metade da inibição máxima) a 24 h estavam entre 1,7 e 2,5 uM Frondoside A. Estes resultados são consistentes com os resultados publicados anteriormente que a baixa concentração de Frondoside A inibe o crescimento de células de cancro pancreático humano e a apoptose induzida através da caspase 9 /3/7, o aumento da Bax, diminuição da Bcl-2 e Mcl-1, e preso ciclo celular e supra-regulados a p21 [8], a apoptose induzida em células de leucemia humana através da activação da caspase [6], e diminui significativamente a viabilidade do receptor de estrogénio (ER), MDA-MB-231 de cancro da mama -negativas células por indução de apoptose através da Caspase9-Caspase3 /7 via intrínseca [7]. Também tem sido demonstrado que Frondanol A5, um extracto impuro de
Cucumaria frondosa
pele a partir do qual Frondoside A é originalmente derivada, a inibição do crescimento induzida pelo S e fase G2-M com uma diminuição na Cdc25C e um aumento na p21
WAF1 /CIP1 com apoptose significativa associada com a fosforilação H2AX e caspase-2 clivagem nas células HCT116 derivadas de câncer de cólon [4]. Um segundo documento também demonstrou que Frondanol-A5P, um precipitado sub-fração polar de Frondanol-A5, inibiu a proliferação e induziu G2 /M parada do ciclo celular fase em duas células de câncer de pâncreas com diminuição da expressão de ciclina A, ciclina B, e cdc25C [ ,,,0],18]. Este efeito anti-cancerígeno de Frondoside A não é específico de tecido, e, neste contexto, demonstramos que Frondoside Um induziu uma redução dependente da concentração na viabilidade celular do melanoma MDA-MB-435, da mama MCF-7, e as células de hepatoma HepG2.
Para avaliar os efeitos da Frondoside a sobre o desenvolvimento do tumor de pulmão
in vivo
, xenotransplantes LNM35 foram feitos em ratos imunodeprimidos. Foi demonstrado que a administração intraperitoneal de Frondoside A provocou uma forte regressão de tumores estabelecidos. A inibição máxima foi obtida com a dose baixa de 0,01 mg /kg /dia durante 25 dias. Uma dose 100 vezes mais elevada dá efeitos semelhantes, indicando que o aumento da dose não irão melhorar a eficácia anti-cancro do Frondoside A. O efeito inibidor do cancro da Frondoside A tem sido observada anteriormente em AsPC-1 pancreático e MDA-MB-231 em xenoenxertos atímicos ratinhos [7], [8]. Este efeito anti-tumor de Frondoside A pode ser, em parte devido ao seu efeito imuno-estimulante [13] e efeito /ou anti-angiogénica. Neste estudo, foi demonstrado pela primeira vez, que Frondoside A é um potente agente anti-angiogénico. Ele reduz a densidade de microvasos (medida por coloração CD31) no tumor xenoenxerto tratado com Frondoside A e também invertem significativamente basal e induzida por bFGF angiogénese no ensaio CAM da angiogénese. Da mesma forma, Frondoside Um completamente suprimida a formação da estrutura capilar em Matrigel substrato por células endoteliais humanas.
A angiogênese é um alvo atraente na terapia do cancro, não só porque fornece oxigênio e nutrientes para a sobrevivência das células tumorais, mas também fornece a rota para propagação metastática destas células cancerosas. a progressão do cancro está associado com a revogação dos controlos normais que limitam a migração celular e invasão, levando eventualmente a metástase.