Abstract

Os microRNAs são não codificante RNAs que regulam vários processos celulares durante a progressão do câncer. Entre vários microARNs, miR-630 foi recentemente identificado por estarem implicados em muitos processos críticos em malignidades humanas. Nós teve como objetivo investigar o significado e valor prognóstico do miR-630 no cancro gástrico humano. O câncer gástrico e espécimes normais adjacentes de 236 pacientes de que não tinham recebido quimioterapia neoadjuvante foram recolhidos. A expressão de miR-630 foi investigado por ensaio de PCR quantitativo em tempo real e a sua associação com a sobrevivência global dos pacientes foi analisado por análise estatística. nível de expressão de miR-630 foi significativamente elevados em cancro gástrico em comparação com amostras normais adjacentes. Está igualmente provado que a expressão de miR-630 era para ser associado com a invasão gástrica câncer, metástase linfonodal, metástases à distância e estágio TNM. Além disso, a análise de sobrevivência mostrou que a expressão elevada de miR-630 foi associada com fraca sobrevivência global dos doentes. A análise multivariada também provou que miR-630 foi um marcador prognóstico independente após ajuste para fatores prognósticos conhecidos. O presente estudo comprovou a sobre-expressão de miR-630 e sua associação com a progressão do tumor no câncer gástrico humano. Ele também forneceu a primeira evidência de que a expressão de miR-630 foi um fator prognóstico independente para pacientes com câncer gástrico, o que pode ser um potencial biomarcador valioso para câncer gástrico

Citation:. Chu D, Zhao Z, Li Y, Li J, Zheng J, Wang W, et al. (2014) o aumento da expressão microRNA-630 em câncer gástrico está associada com pobre sobrevida global. PLoS ONE 9 (3): e90526. doi: 10.1371 /journal.pone.0090526

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 14 de setembro de 2013; Aceito: 03 de fevereiro de 2014; Publicação: 12 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81201927, 81272204 e 31270812) e China Pós-Doutorado Science Foundation (No. 2012M521862). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é uma das doenças malignas mais comuns em todo o mundo [1]. O prognóstico do cancro gástrico é pobre e os pacientes são geralmente diagnosticado numa fase bastante avançado na maioria dos países [2], [3]. Assim, a taxa de sobrevida global em 5 anos é de cerca de 40%, e que os pacientes com metástases à distância é inferior a 5% [4] – [8]. Aproximadamente 700.000 pacientes com câncer gástrico morrem anualmente, tornando-se a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os dados mostraram que a taxa bruta de mortalidade de câncer gástrico foi de 25,2 por 100.000 (32,8 por 100.000 nos homens e 17,0 por 100.000 em mulheres) [1]. Mas existe notável variação geográfica na incidência de câncer gástrico para os países orientais, como China e Japão têm taxas mais altas de câncer gástrico do que os países ocidentais [9], [10]. Na China, o câncer gástrico é o segundo câncer mais freqüentemente diagnosticado ea terceira principal causa de morte por câncer, com uma estimativa de 464 439 novos casos e 352 315 mortes por câncer em 2008. A estimativa taxa de incidência global ajustada por idade em 2008 foi de 29,9 por 100.000 pessoas na China [9]. Então, câncer gástrico continua sendo um problema significativo em todo o mundo, apesar de uma incidência em declínio em não só os países ocidentais, mas também a China.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de altamente conservadas,, pequenas moléculas de RNA não-codificantes de cadeia simples, que são conhecido como reguladores endógenos de expressão expressão gênica pós-transcricional regulação através da repressão de translação e de clivagem de ARN mensageiro [11]. Eles podem inibir a expressão genética ao nível da pós-transcrição ligando-se a região não traduzida a 3 ‘de mRNAs alvo pode resultar na degradação do mRNA ou a inibição de tradução, dependendo do grau de emparelhamento de bases complementar [12], [13]. Tem sido largamente aceite que miARNs têm um papel central em vários processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, a proliferação celular, diferenciação, apoptose e metabolismo [14]. As evidências acumuladas também sugere que miARNs participar na angiogénese tumoral, invasão e metástase de tumor maligno humano [15]. miARN expressão aberrante tem sido associada com a oncogénese, e alguns miARNs actuam como supressores de tumor, ao passo que outros como oncogenes, dependendo dos seus alvos, que podem proporcionar uma visão sobre o diagnóstico e o prognóstico de doenças malignas humanas [16]. Recentemente, evidências têm demonstrado que a expressão de miRNAs é desregulamentado em vários tipos de tumores malignos humanos, como câncer gástrico, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de pâncreas e leucemia linfocítica crónica [17] – [19]. No cancro gástrico humano, múltiplos miARNs com expressão aberrante, foram identificados, por exemplo, o miR-21, o miR-22, o miR-23, o miR-127, o miR-148, o miR-202 e miR-433, que desempenhou oncogénico ou supressora papel [20] – [25]. Estes resultados indicaram que miRNAs podem desempenhar diversos e cruciais papéis em malignidades humanas, incluindo câncer gástrico. No entanto, o perfil de miRNAs expressão é altamente tecido e tipo de câncer específico e miRNA específico, demonstrando assim a importância funcional e clínico de um miRNA específico pode fornecer insights clinicamente relevantes em função de miRNA e gestão câncer eficaz [12], [15]. Para nosso conhecimento, até agora, o significado clínico e prognóstico da expressão de miR-630 em câncer gástrico ainda não foi relatado.

No presente estudo, investigamos o nível de miR-630 expressão em gástrica clínica amostras e tecidos normais adjacentes, bem como analisar sua associação com a sobrevida global dos pacientes.

Materiais e Métodos

pacientes e espécimes

o presente estudo foi aprovado pelo Comissão de ética da Quarta Universidade médica Militar. Todos os membros envolvidos forneceram consentimento informado por escrito. amostras de cancro frescos clínicos gástricas e tecidos normais adjacentes foram coletados de 236 pacientes submetidos a cirurgia entre janeiro de 2007 e dezembro de 2008 no Hospital Xijing de doenças digestivas, Quarta Universidade Médica Militar. Nenhum destes doentes tinham recebido quimioterapia antes da cirurgia. Além disso, amostras de tecidos normais foram tiradas de 18 pacientes submetidos à cirurgia para outros fins que malignidade como amostras de controlo normais razões. O histomorfologia de todas as amostras de tecido foram confirmadas pelo Departamento de Patologia da Quarta Universidade Médica Militar. Os espécimes foram colocados imediatamente em N líquido

2 após a ressecção cirúrgica durante 10 min, em seguida, em uma temperatura de -70 ° C ultra-freezer por isolamento de ARNm. informações clínicas dos pacientes, tais como idade, sexo, estado de diferenciação e estádio TNM, foi recolhido e armazenado em um banco de dados. Acompanhamento completo foi disponibilizado por pelo menos 5 anos. A sobrevivência global é definida como o tempo decorrido desde a cirurgia à morte dos doentes com cancro gástrico. informações de acompanhamento de todos os participantes foi atualizado a cada três meses para a visita de telefone e questionário letras. Morte de participantes foi determinado por meio de relatórios a partir da família e verificado pela revisão dos registros públicos.

Quantitative PCR em tempo real

O RNA total foi purificado a partir de todo o câncer gástrico 236 e combinando amostras normais adjacentes pelo fabricante utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Apenas as amostras de ARN total com DO razão A260 /A280 perto de valor de 2,0, o que indica que o ARN é puro, foram subsequentemente analisados. O cDNA específico de controlo interno de miR-630 e RNU44 foram sintetizados a partir de ARN total, utilizando iniciadores específicos de genes de acordo com o protocolo de ensaios TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os produtos de transcrição reversa foram depois amplificados e detectados por PCR em tempo real utilizando Taqman MicroRNA Ensaio (Applied Biosystems) específico para HSA-miR-630. Cada amostra foi analisada em triplicado e os dados em bruto foram apresentados como a quantificação relativa da expressão de miR-630 avaliadas pelo método comparativo limiar de ciclo (CT), normalizada em relação a RNU44. A média normalizada expressão de miR-630 ± desvio padrão (SD) foi calculado a partir de análise em triplicado. PCR em tempo real foi realizado utilizando um sistema ABI 7500 (Applied Biosystems) e análise comparativa 2

-ΔΔCt foi realizada usando software de SDS 2.2.2 (Applied Biosystems).

Análise estatística

As associações entre o miR-630 de expressão e clínico-patológicas características foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, conforme o caso. As curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças de distribuições de sobrevivência foram avaliados pelo teste de log-rank. riscos proporcionais de modelagem de fatores potencialmente relacionados com a sobrevivência de Cox foi realizada a fim de identificar quais fatores podem ter uma influência significativa na sobrevivência e controle para idade, sexo e estado de diferenciação. Diferenças com um

valor P

de 0,05 ou menos foram consideradas estatisticamente significativas.

Resultados

miR-630 Expressão detectado no câncer gástrico

o ensaio de PCR em tempo real, 236 casos de cancro gástrico, correspondentes amostras normais adjacentes e 18 casos de amostras normais de controlo foram investigados. A expressão relativa de miR-630 normalizado para RNU44 no cancro gástrico foi encontrado para ser 8,51 ± 1,63 (média ± DP), enquanto que, em correspondência adjacente normal foi de 3,25 ± 0,63. Os resultados estatísticos mostrou que a expressão de miR-630 em cancro gástrico foi significativamente mais elevada do que em amostras de controlo e adjacentes normais (

P

0,05). Estes resultados indicaram que o miR-630 pode desempenhar um papel no cancro gástrico oncogénica. Para facilitar ainda mais a análise sobre a associação entre o miR-630 expressão e características clínicas, definimos manualmente câncer gástrico com miR-630 expressão menor que 3,88 (média + expressão SD de miR-630 em amostras adjacentes) um preço tão baixo miR-630 grupo expressão enquanto espécimes com expressão de miR-630 não inferior a 3,88 foram definidos como de alta grupo expressão de miR-630. Assim, entre os 236 casos de câncer gástrico, 98 casos foram atribuídos ao grupo expressão baixa, enquanto 138 casos foram atribuídos ao grupo alta expressão.

Relação de miR-630 às características clínico-patológicos do Câncer Gástrico

como nossa investigação mostrou que a expressão de miR-630 foi aumentada no cancro gástrico, que indicaram que miR-630 pode atuar como um papel oncogênico no câncer gástrico. Nós investigamos ainda mais a associação da expressão de miR-630 com características clinicopatológicas dos pacientes para explorar seu potencial papel na progressão do cancro gástrico. Análise estatística Os resultados, apresentados na Tabela 1, mostrou-se que o aumento da expressão de miR-630 foi associada com o avançado invasão do cancro gástrico desde alta miR-630 de expressão foi mais frequentemente para ser detectada em tumores T3 e T4 (

P = 0,007

). Na medida em que a metástase do tumor foi considerado, elevada expressão de miR-630 foi relacionada com linfonodo positivo e metástase distante em alta a expressão de miR-630 foi mais frequentemente para ser detectada em tumores com linfonodo positivo (

P

0,001) ou metástases à distância (

P

= 0,002). Além disso, quando medimos as características clínicas dos pacientes pelo sistema TNM, que descobriram que a expressão de miR-630 foi significativamente associada com o estádio TNM de câncer gástrico, porque alta miR-630 expressão era mais provável que seja detectada em tumores com estágio TNM avançado (

P Art 0,001). Estes resultados sugerem que o miR-630 pode desempenhar um papel na progressão oncogénica de cancro gástrico. No entanto, a ração positivo de miR-630 não foi encontrado para ser associado com o sexo dos pacientes (

P

= 0,788), idade (

P

= 0,471), estado de diferenciação (

P

= 0,890), local do tumor (

P

= 0,835) ou classificação Lauren (

P

= 0,160).

A Relação de MiR- 630 a sobrevida global dos pacientes ‘com câncer gástrico

Durante todo o período de acompanhamento, 130 dos 236 pacientes (55,1%) com câncer gástrico tinha morrido e o tempo de sobrevivência global mediana de todos os pacientes recrutados foi 48 meses. A análise de Kaplan-Meier foi aplicado para examinar o valor prognóstico da expressão de miR-630 a sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico. Os resultados provaram que pacientes com câncer gástrico de alta expressão de miR-630 tendem a ter pior sobrevida global (log rank:

P Art 0,001, Figura 1). O tempo médio de sobrevivência de pacientes com baixa expressão de miR-630 não pode ser estimado, pois mais de 50% dos pacientes sobreviveu durante o período de acompanhamento. Enquanto o tempo médio de sobrevivência pós-operatório de pacientes com alta expressão de miR-630 foi de 34 meses (IC 95%: 28,2-39,8). Quando risco relativo não ajustado (HR) foi considerada com baixa expressão de miR-630 como referência (1,00), os pacientes com câncer gástrico de alta expressão de miR-630 tinha um 2,28 vezes maior risco de morte (95% CI: 1,57-3,32;

P Art 0,001). No que diz respeito as características clinicopatológicas foram considerados, metástase ganglionar (log rank:

P

= 0,002), metástases à distância (log rank:

P Art 0,001) e estágio TNM (log rank:

P Art 0,001) foram também provou ser associado à sobrevida global já que os pacientes com câncer gástrico de metástases em linfonodos, metástases à distância ou grau avançado tendem a ter pior sobrevida global e maior risco de morte. No entanto, o sexo (log rank:

P

= 0,168), idade (log rank:

P

= 0,572) estado de diferenciação (log rank:

P

= 0,156), local do tumor (log rank:

P

= 0,632) ou classificação Lauren (log rank:

P

= 0,573) não tiveram valor prognóstico na sobrevida global de pacientes com câncer gástrico .

como miR-630 expressão foi provou ser associado a sobrevida global dos pacientes em análise de sobrevivência univariada, investigou também se miR-630 pode servir como um marcador de prognóstico independente para pacientes com câncer gástrico. Porque metástases em linfonodos e informações de metástases à distância foi incluído nos dados de estadiamento TNM, foi realizada Cox modelo de riscos proporcionais, que é ajustada por sexo, idade e estágio TNM. Os resultados mostraram que o HR ajustado de alta grupo expressão de miR-630 foi 3,51 (IC 95%: 1,83-6,72;

P Art 0,001). Estes resultados demonstram que o miR-630 foi um fator prognóstico independente de sobrevida global para pacientes com câncer gástrico. Assim, o aumento da expressão de miR-630 poderia ser um indicador de sobrevida global pobres sem consideração de idade, sexo ou estágio TNM (Tabela 2).

Discussão

De acordo com estudos recentes, mais de 1.900 miARNs humanas foram identificadas, que são estimadas para regular mais de 60% dos genes em mamíferos [26]. Devido à sua grande importância na regulação da expressão do gene, tem sido amplamente aceito que miRNAs estão envolvidos em várias funções celulares, incluindo proliferação, apoptose e diferenciação, assim, têm sido implementados em diversos processos fisiológicos e patológicos vão desde o desenvolvimento de câncer [27 ] – [29]. investigação pesquisados ​​anteriores perfis de expressão de miRNA em fase I cancro do pulmão de células não pequenas para identificar padrões que possam predizer recorrência após ressecção cirúrgica descobriram que miR-630 foi um dos mais comumente miRNA entre os 1.000 classificadores identificadas [30]. Outro estudo sobre pulmão de células não-pequenas encontrado que o miR-630 poderia regular a morte celular induzida por cisplatina cancro, indicando o miR-630 era um modulador potencial da resposta cisplatina em cancro de pulmão de células não pequenas [31]. MiR-630 também foi encontrado para ser regulada na cabeça e carcinoma de células escamosas da garganta após o tratamento com cisplatina e pode modular a expressão da proteína de Atg5, ATG6 /BECN1, ATG10, ATG12, ATG16L1 e UVRAG [32], [33]. estudo recente mostrou que a regulação alta de miR-630 em células de câncer de pâncreas pode induzir a apoptose, visando IGF-1R [34]. Desde miRNAs individuais em diferentes tipos de câncer pode ter um grande número de genes alvos diferentes, portanto, têm funções diferentes em várias doenças malignas. Portanto, a descoberta funcional dos miRNAs individuais pode permitir visão mais profunda de regulação da expressão gênica e da complexidade da progressão do câncer.

Expressão de mRNA miR-630

No presente estudo, nós investigamos por real-time PCR em 236 casos de câncer gástrico de pacientes que não tinham recebido quimioterapia neoadjuvante. Baseada no cálculo de expressão relativa, analisou-se a associação de miR-630 com características clínico-patológicas, bem como prognóstico dos pacientes. Os resultados mostraram que a expressão de miR-630 foi aumentada no cancro gástrico em comparação com o que em tecidos adjacentes normais e de controlo para expressão elevada de miR-630 foi mais susceptível de ser detectada em espécimes de cancro gástrico, o que indica a sua possível participação na carcinogénese. Encontra-se também que a expressão de miR-630 estava intimamente relacionada à invasão gástrica câncer, metástase linfonodal, metástases à distância e estágio TNM em alta expressão de miR-630 foi mais frequentemente para ser detectado em tumores com invasão profunda, metástase linfonodal, distante metástase ou estágio TNM avançada, sugerindo a possível participação de miR-630 na invasão câncer gástrico e metástase. Juntamente com as evidências acima, foi, assim, propôs que miR-630 pode desempenhar um papel importante na carcinogênese do câncer gástrico e progressão.

Como miR-630 expressão foi encontrado para ser associado com a invasão de câncer gástrico e metástase, considerando a invasão de câncer para tecidos próximos e metástase para tecidos distais são fatores cruciais que afetam o prognóstico dos pacientes, miR-630 pode ser um potencial marcador de prognóstico para pacientes com câncer gástrico. A fim de investigar o papel prognóstico de miR-630 sobre o cancro gástrico, foi realizada a análise de Kaplan-Meier da sobrevivência global. Os resultados mostraram que os pacientes com câncer gástrico de alta expressão de miR-630 tendem a ter pior sobrevida global em comparação com pacientes com tumor de baixa expressão de miR-630, que sugeriu que a expressão de miR-630 era um marcador de prognóstico para pacientes com câncer gástrico. Para melhor avaliar o valor prognóstico do miR-630 no câncer gástrico, realizamos Cox riscos proporcionais modelo que foi ajustado para sexo, idade e estágio TNM dos pacientes. Os resultados provaram que o aumento da expressão de miR-630 era um marcador de mau sobrevivência global independente de factores ajustados, assim, o miR-630 pode ser utilizado para determinar o prognóstico dos doentes com a fase considerando TNM. Estes resultados indicaram que miR-630 pode constituir um aditivo marcador prognóstico molecular para estágio TNM para pacientes com câncer gástrico, a identificação de indivíduos de alto risco que estão mais propensos a ter recidiva tumoral na prática clínica, assim, bons candidatos para receber um tratamento mais agressivo. Estes resultados são consistentes com as investigações voltadas para o câncer de pulmão de não pequenas células, indicando a consistência do miR-630 função nestes tipos de tumor. Assim, a ligação positiva entre o miR-630 superexpressão e mau prognóstico pode não só ser utilizado para a identificação de pacientes com câncer gástrico com maior risco de recidiva do tumor inicial, mas também para fornecer pistas valiosas para entender o possível mecanismo de invasão câncer gástrico e metástase.

em conclusão, temos provado que o miR-630 expressão foi aumentado em câncer gástrico e associado com a progressão do tumor. O presente estudo também demonstrou pela primeira vez que a expressão de miR-630 foi um fator prognóstico independente de pacientes com câncer gástrico. Portanto, é possível que o miR-630 podem desempenhar um papel importante na capacidade de invasão e metástases de cancro gástrico. É também possível que o miR-630 serve como marcador de prognóstico clínico e na prática até mesmo a inibição de miR-630 utilizando inibidores específicos podem tornar-se um novo método terapêutico para o tratamento do cancro gástrico.