Abstract

O câncer de próstata (PC) é uma das principais causas de morte em homens no entanto, os fatores que regulam a sua progressão e eventual metástase para os ossos permanecem obscuros. Aqui nós mostramos que a expressão WISP1 /CCN4 em tecidos de câncer de próstata foi regulada em estágios iniciais da doença e, ainda, que correlacionada com o aumento dos níveis circulantes de WISP1 no soro de pacientes no estágio inicial da doença. WISP1 também foi elevado no ratinho TRAMP do cancro da próstata modelo no tecido doente hipoplásica que se desenvolve antes da formação do carcinoma avançado. Quando a capacidade de anticorpos anti-WISP1 para reduzir a disseminação de células PC3-Luc para locais distantes foi testado mostrou-se que duas vezes injecções semanais de anticorpos anti-WISP1 reduziu o número e tamanho global de tumores distantes desenvolvidos após intracardíaca (IC) de injecção de células PC3-Luc em ratinhos. A capacidade de anticorpos contra WISP1 para inibir o crescimento de células de cancro PC3-Luc em ratos também foi avaliada e mostrou que duas vezes injecções semanais de anticorpos anti-WISP1 reduziu o crescimento local do tumor quando examinados em xenoenxertos. Para compreender melhor o mecanismo de acção, a migração de células PC3-Luc através das membranas com ou sem uma barreira de Matrigel ™ mostrou as células foram atraídos para WISP1, e que esta atracção foi inibida por tratamento com anticorpos anti-WISP1. Mostramos também a expressão de WISP1 na interface tumor ósseo e no estroma dos cancros de grau primeiros sugeridas expressão WISP1 está bem posicionada para desempenhar um papel tanto na promoção do crescimento do câncer e sua disseminação para o osso. Em resumo, a sobre-regulação de WISP1 nas fases iniciais do desenvolvimento do cancro juntamente com a sua capacidade para inibir a propagação e crescimento de células de cancro da próstata faz com que seja um alvo potencial e um marcador de diagnóstico para o cancro da próstata acessível.

citação: Ono M, Inkson CA, Sonn R, Kilts TM, de Castro LF, Maeda A, et al. (2013) WISP1 /CCN4: um alvo potencial para inibir o crescimento do cancro da próstata e se espalhou para osso. PLoS ONE 8 (8): e71709. doi: 10.1371 /journal.pone.0071709

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de março de 2013; Aceito: 02 de julho de 2013; Publicação: 14 de agosto de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pela Divisão de Investigação Intramural, NIDCR do Programa de Pesquisa Intramural, NIH, DHHS (MO, CAI, TMK, LFCD, AM (Maeda), FLM, PGR, ADB, LL NM-F, ACB, NPSC, AM (Molinolo) e MFY), por uma concessão do Departamento de Defesa W81XWH-11-1-0239 (AJ e NSF) e por uma bolsa de estudos Howard Hughes (RS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Sendo a segunda principal causa de morte por câncer em homens de todas as raças, o câncer de próstata é uma das principais preocupações de saúde para os homens [1], [2]. Foi proposto que a maioria dos homens idosos abrigam vestígios de câncer de próstata, e ainda as bases moleculares de como e por que os avanços câncer ainda são tímidas [3]. Como muitos outros cancros perigosos, células cancerosas da próstata têm uma incidência muito alta de migração do tumor primário para locais distantes onde eles são uma causa mais direta de morbidade e mortalidade [4]. Um local comum para a metástase do cancro da próstata é de osso, no entanto, quando o cancro progride para esta fase, é geralmente incurável [5], [6], [7]. Portanto, existe uma necessidade fundamental para 1) entender o que fatores contribuem para a progressão da doença na próstata, 2) compreender como e porque os cancros da próstata “casa” ao osso e, ainda, 3) conceber novas maneiras de impedir que este complexo e devastador processo. A metástase do cancro da próstata pode ser um processo ineficiente e apenas uma fracção dos pacientes com cancro da próstata desenvolvem cancro que metastiza para locais distantes [3]. Ao analisar os primeiros eventos que ocorrem durante a progressão do câncer de próstata é possível que novos procedimentos de diagnóstico poderiam ser desenvolvidos para prever a progressão e futuro gravidade do câncer e otimizar o tempo ea natureza das intervenções terapêuticas. Novas informações sobre proteínas candidatos envolvidos neste processo poderia, também, potencialmente, ser usado para desenvolver novas terapias para reduzir a propagação e estabelecimento da doença em locais distantes como o osso.

WISP1 (induzida Wnt proteína secretada-1 ) é um membro da família do CCN que é nomeado a partir dos seus membros fundadores da Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 e nov /CCN3. Existem actualmente seis membros da família que também incluem WISP1 /CCN4, WISP2 /CCN5 e WISP3 /CCN6 [8]. WISP1 foi pela primeira vez identificado como um gene expresso na linha de melanoma metastático, K-1735, em que foi chamado elm1 (referindo-se a sua expressão em células metastáticas inferiores) [9]. Em torno do mesmo tempo que elm1 foi descoberto, WISP1 foi identificada num laboratório separado onde foi encontrado para ser regulada para cima por Wnt1 transformadas células epiteliais mamárias, e em várias linhas de cancro de cólon, bem como sendo expressa em tecido de cancro do cólon humano [10 ]. Subsequentemente, WISP1 foi mostrado para conferir características oncogénicas de células de rim de rato (NRK-49F), incluindo o crescimento acelerado, a densidade de saturação melhorada e aumento da capacidade de formar tumores em ratinhos [11]. Desde a sua identificação inicial, WISP1 tem sido encontrados numa variedade de cancros, incluindo o carcinoma do esófago de células escamosas [12], condrossarcoma [13], carcinoma da mama [14], [15], neurofibromatose tipo I [16], carcinoma colorrectal [17 ], carcinoma do pulmão de Lewis [18], colangiocarcinoma invasivo, carcinoma gástrico scirrhous [19] e endometriod adenocarcinoma do endométrio [20]. Curiosamente, WISP1 expressão em muitos destes cancros é localizada para os tecidos do estroma que rodeiam as células cancerosas [15], sugerindo que pode desempenhar um papel no microambiente que suporta o crescimento e /ou eventual alastramento do tumor primário.

em condições não patológicas, WISP1 é encontrada em vários tecidos embrionários e adultos que incluirá, nomeadamente, novos locais de formação óssea [21] onde ele aparece para controlar osteogênese [22]. Considerando o facto de que os cancros da próstata têm um tropismo elevado para o osso e, além disso, que este processo pode ser aumentada por aumento da renovação óssea [23] a hipótese de que WISP1 pode, potencialmente, ser envolvido na regulação metatasis cancro da próstata. Este estudo foi realizado para determinar se o primeiro e WISP1 onde é expresso em tumores da próstata primários e, em seguida, para determinar o papel de WISP1 no crescimento e homing de células de cancro da próstata de tecido esquelético. Os nossos resultados mostraram que WISP1 é encontrado nas fases iniciais de cancro da próstata, quer em tecidos ou biópsias em soros de pacientes que sofrem, bem como no tecido pré-carcinoma hipoplásica a partir de um modelo de ratinho de cancro da próstata. Além disso, mostrámos que a inibição da função WISP1 usando anticorpos neutralizantes reduziram o crescimento do tumor de xenoenxerto de uma linha celular de cancro da próstata, bem como a sua homing ao osso. Tomados em conjunto, nosso estudo aponta para WISP1 como participante romance nos processos de crescimento do câncer de próstata e de metástases ósseas

Métodos

Declaração de Ética

Seres Humanos:. Biópsias representando diferentes tipos de câncer de próstata (do I-IV), incluindo tecidos de controle foram adquiridos de US Biomax ™ (Cat # PR801) e seu uso aprovado pelo National Institutes of Health Office de Seres Humanos Research, Bethesda, MD (Isenção # 11583). A aprovação para a utilização de soro humano foi obtido a partir da Universidade Johns Hopkins Medicine (JHM) Institutional Review Board (IRB), Baltimore, MD. O número do protocolo IRB aprovado para uso com o soro de ensaio é JHM IRB-X Sem: 04-07-27-03e. Os espécimes patológicos /amostras de diagnóstico a partir dos fornecedores comerciais são de fontes que estão publicamente disponíveis e as informações são gravadas pelo investigador de tal maneira que os indivíduos não podem ser identificados, directamente ou através de identificadores ligados aos assuntos e consentimento informado foi obtido de todos doadores de soro antes da sua utilização

para esclarecer:. a natureza das amostras utilizadas para seres humanos, o consentimento escrito foi obtido de doadores como parte dos protocolos para a coleta de amostras de soro (ProMedDx, Inc.) e biópsia de tecido núcleos (EUA. Biomax Inc.). Estes protocolos e seus formulários de consentimento foram aprovados pelas fontes comerciais próprias Institucionais Review Boards. Outras informações sobre os detalhes exatos de o conteúdo dos formulários de homologação escritas podem ser encontradas em www.promeddx.com para amostras de soro e em www.biomax.us para arrays de tecido. Estes protocolos e seus formulários de consentimento foram aprovados pelas fontes comerciais próprias Institucionais Review Boards. Porque as amostras comercialmente disponíveis são de-identificados e dissociada da sua doadora, a sua utilização não cabe definição de Seres Humanos de Investigação da NIH, pois os protocolos estão isentos (Isenção # 1158 para o NIH e Não: 04-07-27 -03e para JHU).

experiências com animais

Todos os procedimentos com animais foram realizados no National Institutes of Health e da instituição que concedeu a homologação para os procedimentos com animais descritos no jornal é conhecido como o Comité de Cuidados e Uso de animais (ACUC). O número de homologação para os experimentos realizados no estudo atual é NIH ACUC # 12-645.

Polyclonal Antibody Produção

Um peptídeo WISP1 humana com a sequência RDTGAFDAVGEVEAWHRN (aminoácidos 198-216, adesão número NP 003873, ver Figura S1A) foi sintetizado e conjugado através da cisteína a activada hemocianina de lapa e injectados em um coelho (LF-185) para produzir anticorpos policlonais em uma instalação aprovada AAALAC (Covance Imunologia Services, Denver, PA, EUA) . O título do anti-soro resultante foi testado utilizando um ELISA directo quer com o péptido LF-185 ou com WISP1 humana purificada como controlo (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EUA) ligado à placa de microtitulação. A especificidade da LF-185 foi testado por Western blot utilizando-se três outros membros disponíveis da família CCN Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 e nov /CCN3 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EUA) e mostraram imunorreactividade única direcção WISP1 (Figura S1B ). Um segundo anticorpo de coelho para WISP1 foi gerado a uma sequência no terminal C, o que é altamente conservada ( 95%) entre o rato e WISP1 humana (aminoácidos 346-367, NP 003873 ver, Figura S1A), usando o humano sequência peptídica CRNPNDIFADLESYPDFSEIN conjugado através da cisteína a KLH activada (LF-187). Este último anticorpo também apresentaram alta reatividade a WISP1 e não para os outros membros da família CCN testado (S1B).

Polyclonal Antibody Purification

Os peptídeos utilizados para gerar LF-185 e LF-187 foram purificado utilizando o seu péptido correspondente e a Imobilização Sulfolink Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), e os anticorpos foram purificados por afinidade como se segue. Em primeiro lugar, as colunas ligadas com péptido foram equilibrados de acordo com o protocolo do fabricante e, em seguida, 2,0 ml de cada soro foi passado através da coluna, lavou-se com PBS, e foram eluidas com uma solução 4 M de guanidina em PBS. Os anticorpos eluídos foram dialisados ​​imediatamente com excesso de volume de PBS durante a noite a 4 ° C e a recuperação da sua imunorreactividade verificada por meio de ELISA. Os anticorpos purificados por afinidade foram armazenadas a -80 ° C antes de usar. No controlo experimental, a IgG foi purificada a partir de um coelho challanged apenas com adjuvante utilizando a purificação de proteínas Kit IgG (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) com uma coluna de proteína por afinidade utilizando as mesmas lavar, de eluição e de diálise condições de ligação, usados ​​para purificador LF-185 e LF-187.

a imuno-histoquímica e TRAP coloração

as lâminas foram coradas utilizando as recomendações do fabricante de um modo idêntico ao utilizado para as seções de mouse descritos abaixo. Resumidamente, as secções de tecido foram desparafinadas, a actividade da peroxidase endógena destruído por metanólico H

2O

2, reidratadas e incubadas com um anticorpo policlonal de coelho anti-WISP1 IgG (SC-25441, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) diluída até uma concentração de 4 ug /mL (1:50) em PBS mais 10% de soro de cabra durante a noite a 4 ° C. Um isotipo normal de IgG de coelho foi usado como controlo não-imunorreactivas (AB-105-C, R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Para algumas colorações (S5) anticorpos primários para WISP1 humana (LF-185) ou soro pré-imune foram usadas e primeiro diluída 1:500 e incubadas a 4 ° C durante a noite antes da detecção. As secções foram contra-coradas com Metil verde e áreas de imunocoloração positiva avaliada por, pelo menos, dois investigadores independentes. Para a coloração TRAP, o kit mancha TRAP /ALP (# 294-67001, Wako, Osaka, Japão) foi utilizado seguindo as recomendações do fabricante.

Análise Serum

O soro de pacientes com graus definidos de cancro da próstata ou a partir de controlos normais foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulose e sondadas com um anticorpo policlonal contra o terminal carboxilo conservada de WISP1 humana (LF-187) por procedimentos de mancha Western padrão. O anticorpo primário, LF-187, foi adicionado a uma diluição de 1: 2000 seguido após incubação e lavagem com um anticorpo secundário marcado com HRP utilizado a uma diluição de 1:10,000. A seguir à remoção da solução de anticorpo secundário, a membrana foi lavada e o substrato exposto a enzima quimioluminescente e sinais foram capturados, digitalizados e analisados ​​utilizando um 2200 Lógica Imaging System Kodak GEL (Carestream Health Inc., Rochester, NY, EUA). Para cada blot, a intensidade líquida da banda correspondente a WISP1 de comprimento completo foi normalizado para o sinal médio das pistas em duplicado contendo 20 ng de WISP1 recombinante (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EUA).

Animais

ratinhos imunocomprometidos (nu atímicos-Foxn1nu) foram adquiridos a Harlan e tinham 8 semanas de idade no momento do estudo. Um modelo de rato de cancro da próstata (próstata de ratinho transgénico adenocarcinoma ou TRAMP) que sobre-expressa o vírus símio 40 (SV-40 /dia) do gene da estirpe promotor probasina específico da próstata (PB) foi gerado anteriormente [24], e usado para examinar expressão WISP1 no tecido da próstata afetada. O fundo genético dos ratos TRAMP foi NOD e foi obtido pelo cruzamento das fêmeas TRAMP B6 com NOD /machos LTJ para gerar um hemizygous estirpe F1 para o PB-Tag. Resultantes ratinhos TRAMP-NOD foram sacrificados por overdose de pentobarbital a 8 e 16 semanas de idade e da próstata e das vesículas seminais colhidos para análise histológica. Os tecidos foram fixados em formalina tamponada durante a noite e, em seguida, transferidas para álcool a 70%. Os tecidos fixados foram embebidos em parafina e seccionados a uma espessura de 4 mm. Para determinar a densidade mineral óssea relativa dos ratinhos tratados ant-WISP1 foi utilizado um Lunar PIXImus Densitometer (GE Medical Systems) projetado especificamente para roedores.

Colonização de PC-3 Cells Luc para locais distantes por intracardíaca Injection ( IC)

macho de oito semanas de idade, foram anestesiados ratinhos atímicos nude- NIH /BG-nu /nu-XID com isofluorano e raspada no local de injecção, que foi em seguida esfregada com iodo e álcool a 70%. Uma seringa de tuberculose com uma agulha de calibre 27 ligada foi então carregado com uma suspensão de PC3-Luc (5 × 10

5 células /150 ml de PBS) e a agulha inserida na vertical no quarto espaço intercostal. Quando um flash de sangue foi notado no cubo da agulha, as células foram injectadas lentamente até que o conteúdo da agulha estavam vazios e a agulha foi puxada para fora lentamente. Para assegurar-nos de que as células foram correctamente injectada no ventrículo esquerdo e disseminado ao longo do rato e não, por exemplo, preso nos pulmões (como seria o caso de uma injecção no ventrículo direito) após a injecção de IC os ratos foram imediatamente injectados com 100 ml de uma solução 40 mg /ml d-luciferina de pirilampo (Biosynth) por via intravenosa e fotografada usando um Lumina-XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EUA). Os ratos que mostram a distribuição das células PC3-Luc como julgado por luminescência ao longo de todo o corpo, em seguida, foram utilizados para posteriores tratamentos. Os ratinhos foram divididos em três grupos de tratamento (n = 6 /grupo) e injectados com células no dia 0. A administração de anticorpos foi levada a cabo com uma dose de 100 ug por injecção ip, duas vezes por semana, com início no Dia 0 da inoculação do tumor e continuando ao longo da experiência. Três grupos consistiu em: 1) murganhos injectados com o anticorpo purificado por afinidade ul 100, LF-185, 2) que receberam IgG de controlo, e 3) que receberam apenas PBS 1X.

In vivo

de imagem foi realizado semanalmente para acompanhar o crescimento e criação de células tumorais usando um Lumina-XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EUA). Antes da imagiologia de ratinhos foram injectados com 100 uL de uma solução 40 mg /ml d-luciferina de pirilampo (Biosynth) em PBS, por via intravenosa. Os ratos foram tratados por um total de 4 semanas e a área e contagens de exposição à luz foram quantificados como descrito acima. Na quarta semana, depois analisa a luciferase final, os ossos que exibem colonização por as células de tumor foram colhidas e analisadas utilizando um sistema de radiografia MX-20 Faxitron com exposição a 30 kV durante 40 segundos usando filme PPL a partir da Kodak com a incorporação subsequente e o processamento de histologia e imunoquímica.

Cultura de células e

células PC3-Luc RT-PCR

[25] são um cancro da próstata humana que expressam constitutivamente luciferase (um presente do Dr. Russell Taichman, da Universidade de Michigan Escola de Odontologia, EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) contendo 10% de FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, EUA) e 1% de solução de penicilina /estreptomicina (Gibco GlutaMAX-I, Grand Island, NY, EUA ) em uma temperatura de 37 ° C atmosfera de 5% de CO

2 /ar. As células foram passadas a cada 2 dias a 85% de confluência. RT-PCR foi realizada em ARNm isolado a partir de células PC3-Luc cultivadas e amplificadas usando conjuntos de oligonucleótidos correspondentes a WISP1 humana utilizando sequências e condições descritas anteriormente [22].

Xenoenxerto

células de cancro da próstata Humana PC3-Luc foram entregues a ratinhos nus-Fox1nu 8 semanas de idade atímicos por inoculação subcutânea de uma suspensão de células tumorais (5 × 10

6 células /200 uL de PBS) no dia 0. neste experimento células foram contadas, ressuspensas em 200 mL de PBS frio e mantidas em tubos estéreis sobre gelo molhado durante o transporte para a instalação de animal. O número ideal de células para esta experiência foi determinada pela primeira medir o crescimento global PC3-Luc utilizando 2 x 10

6, 5 × 10

6 1 × 10

7 células /inoculação em 4 locais diferentes /rato . Para a inoculação, as células foram arrastados para uma seringa de tuberculose com uma agulha 25G ligada e injectados com o lado em bisel para cima o lado dorsal previamente limpas com álcool. O tamanho do tumor foi então medida com um compasso ou por actividade de luciferase relativa usando o Lumina XR como descrito acima. Nosso estudo piloto mostrou que o menor 2 × 10

6 dose de PC3-Luc cresceu lentamente, enquanto que a dose mais elevada 1 × 10

7 doses cresceu muito rapidamente ambos os quais julgamos ser sub-óptima para o 4 curso de tempo -week prevista para os nossos tratamentos de anticorpos. A dose média de 5 × 10

6 foi óptima e depois usado para as experiências subsequentes. Três grupos de tratamento constituídos por 6 desafiados ratinhos nus por grupo injectado por via intraperitoneal (IP), duas vezes por semana com 1) 100 ug de anticorpo policlonal purificado por afinidade dirigidos contra WISP1 (LF-185) 2) 100 ug de IgG de controlo similarmente purificado ou três ) apenas PBS num volume de 100 ul. Os anticorpos purificados foram preparadas recentemente preparado antes da injecção os ratinhos de teste. Através do decurso das experiências foram os tumores medidos com um calibrador para estimar a sua taxa de crescimento relativa e na quarta semana, os tumores foram colhidos e pesados. Em uma experiência ratos foram seguidos durante 6 semanas (S4) com resultados semelhantes. Todas as experiências utilizando murganhos foram repetidas pelo menos duas vezes. No final da experiência alguns tumores foram ainda analisados ​​por histologia e analisadas quanto à expressão WISP1 como descrito na secção anterior “Imuno-histoquímica e TRAP coloração”.

in vitro de migração

Em migração vitro

das células PC3-Luc foi testada usando BD Falcon FluoroBlok Cultura celular inserções com furos 8 mícrons (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). células PC3-Luc em fase de crescimento logarítmico foram descoladas a partir de placas de 100 mm por tripsina-EDTA, e 2 × 10

4 células foram pré-tratadas com 100 ug /ml de LF-187, o anticorpo IgG ou PBS durante 1 hora a 37 ° C em soro livre RPMI 1640 e foram adicionados para FluoroBlok celular Cultura inserções. RPMI 1640 contendo FBS a 5% ou 200 ng /ml WISP1 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, EUA) foi adicionada à câmara inferior, e todo o sistema foi incubado a 37 ° C durante 24 horas em 5% de CO

2 . Após a incubação e a fixação, as células foram coradas com DAPI (Cat # P36935, Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). células migradas foram examinadas microscopicamente no lado inferior da membrana através da detecção de núcleos marcados com DAPI migradas. O número de células em 3 campos inteiros aleatórios em 100x foi contado com a imagem-Pro Plus (MediaCybernetics, Rockville, MD, EUA) e a média de três poços foi determinada.

Análise Estatística

É um Student não pareado

t

-test foi utilizado para comparar o controle vs. amostras experimentais utilizando o software GraphPad Prism (Prism 5, GraphPad software, Inc., La Jolla, CA, EUA) para a migração celular, o crescimento do tumor e Os ensaios de luciferase.

valores P Restaurant 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A distribuição dos parâmetros medidos para valores WISP1 soro foi avaliada pelo D’Agostino Pearson teste de normalidade omnibus. As comparações entre os dois grupos foram realizadas usando

t

-teste, enquanto que as comparações entre três ou mais grupos utilizou um one-way ANOVA de um Student não pareado. A associação dos níveis de proteína com WISP1 PSA foi avaliada através de uma correlação de Spearman.

valores P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Expression WISP1 proteína no tecido do cancro da próstata e no soro de pacientes afetados

O anti-soro foram. criado contra um domínio mal e altamente conservada de WISP1 (LF-185 e LF-187, respectivamente, ver S1) em coelhos e verificou-se ser altamente reactivos para WISP1 (S1) e incapaz de reagir de forma cruzada com outros três membros da família CCN incluindo Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 ou nov /CCN3 (S1). Apesar de não ser testada diretamente por Western blot, WISP2 humana /CCN5 e WISP3 /CCN6 não contém quaisquer sequências de proteínas primárias que podem ser razoavelmente consideradas homólogas ao peptídeo humano altamente conservadas utilizadas para produzir LF-185. A localização e nível relativo de expressão de WISP1 na próstata e cancros da próstata humanos normais de diferentes graus de gravidade foi avaliada com LF-185 utilizando biópsias de tecidos comercialmente obtidas a partir de Biomax ™. Nesta experiência biópsias de cancros baixo e alto grau (I foi menor, IV era mais alto) e foram corados para imuno-histoquímica utilizando o anti-soro WISP1 e comparados com coloração utilizando IgG como controlo negativo. A avaliação deste coloração em pelo menos dois observadores independentes revelou que WISP1 é expressa em maior medida no cancro da próstata em comparação com os controlos normais (Figura 1A) e que foi localizado principalmente no tecido do estroma em torno do tumor e, em certa medida, no tecido epitelial. Em adição a isto, a coloração WISP1 foi maior em amostras provenientes de pacientes com o menor grau de cancro (I) em comparação com aqueles com os graus mais elevados (IV) de cancro.

. detecção imunohistoquímica da WISP1 em biópsias de pacientes com vários tipos de câncer de próstata. A coloração específica para WISP1 (LF-185) foi encontrada no estroma e no epitélio de tumores de menor pontuação Gleason Grade (Grau I) e difusamente em todo o altamente metastático (Grau IV) carcinoma neoplásica. B. uma imagem representativa de um ensaio Western blot quantitativo utilizado para medir os níveis séricos de WISP1 no soro de indivíduos normais (pistas 1-6) e a partir de indivíduos com cancro da próstata (pistas 7-12). bandas C. quantificados a partir de 20 indivíduos normais e 60 pacientes com câncer de próstata foram comparadas pelo

t

-teste. D. As amostras foram estratificados por estágio da doença usando o sistema TNM de pontuação e comparadas pelo teste de ANOVA. NL, Normal, PT1, PT2 pT3 menor para a maior gravidade, LN

+ /SV

+, linfonodo positivo, vesícula seminal positivo. E. Os níveis de WISP1 foram estratificados por escores de Gleason e comparadas pelo teste ANOVA, 5 é menor gravidade, 9 é maior severidade. F. A associação dos níveis séricos WISP1 com PSA foi analisada por correlação de Spearman (PSA, X-eixo, WISP1, eixo Y). Cada pequeno círculo representa os valores de um único paciente.

Os dados imuno-histoquímica mostrando que a expressão WISP1 foi mais forte em biópsias de grau inferior nos levou a especular que WISP1 em tais cânceres poderiam escapar para soro e ser detectada usando immunoblotting técnicas. Para testar esta hipótese, as amostras de soro foram examinadas por anticorpos blotting usando ocidentais para WISP1 (Figura 1B). A análise mostrou que, quando todos os graus foram agrupadas WISP1 foi significativamente maior nos soros de pacientes com cancro da próstata (PCA) em comparação com controlos normais (NL) (Figura 1C). Estas amostras foram subdivididos utilizando o tumor, nódulo, metástase sistema de pontuação (TNM) e mostrou que os níveis relativos de WISP1 foram significativamente maiores em pacientes com graus pT2, pT2 e PT3 comparação com qualquer NL ou para pacientes que estavam linfonodo e seminal vesícula positivo (+ LN /SV +) (Figura 1C). Como previsto, quando as amostras foram re-avaliados usando o sistema de classificação de Gleason os níveis relativos de WISP1 foram significativamente mais elevadas em graus de 5-7 em comparação com os graus mais avançados 8-9 (Figura 1E). Curiosamente, quando comparado com os níveis de PSA houve uma significativa correlação inversa com WISP1 sendo mais alta nas amostras que apresentaram menores níveis de PSA (Figura 1F).

Expression WISP1 no modelo TRAMP de cancro da próstata

a fim de confirmar a nossa noção de que WISP1 foi regulada no cancro da próstata foi utilizado um modelo de rato gerado anteriormente conhecido como TRAMP (adenocarcinoma rato transgénico da próstata). Esta estirpe de ratinhos transgénicos começa a adquirir tecido da próstata hipoplásica por 8 semanas de idade e por 16 semanas, os tecidos afectados evoluem para carcinomas com a carga tumoral significativa. próstatas afectados foram isoladas a partir de ratinhos TRAMP-NOD no início (8 semanas de idade) e tardia (16 semanas de idade) fases de progressão tumoral e analisadas quanto à expressão WISP1 por imuno-histoquímica. Nas fases iniciais da doença WISP1 foi altamente expressa no tecido hipoplásica que inicialmente se desenvolve no modelo em que a idade (painel inferior Figura 2A). Em tecidos isolados de ratos 16 semanas de idade, expressão WISP1 foi aumentada ainda mais com o desenvolvimento de hiperplasia (Figura 2B painel do meio) e, ainda, foi expressa em termos gerais, as regiões com carinoma avançada (Figura 2B painel inferior).

A. WISP1 localização às 8 semanas de idade no tecido normal da próstata (painel superior) e de tecido hiperplásico (painel inferior, seta preta). B. localização WISP1 com 16 semanas de idade em tecido normal da próstata (painel superior), o tecido hiperplásico (painel do meio, seta preta) e carcinoma (painel inferior). controles de IgG são mostrados à direita de cada painel.

Anti-WISP1 tratamento reduz a disseminação eo estabelecimento de PC3-Luc distantes do local da injeção

células PC3-Luc foram injectado no ventrículo esquerdo de ratos imunodeprimidos e deixada espalhar-se e crescer durante 4 semanas com duas injecções semanais de PBS, IgG ou anti-WISP1. O número de tumores e a carga total do tumor foram então determinada pela sua capacidade para emitir luz (luminescência) e mostrou que o anti-WISP1 reduziu significativamente ambos estes parâmetros em relação ao PBS ou tratamentos de IgG (Figura 3A e 3B, respectivamente). Em nossas mãos a linha de células PC3-Luc utilizado no estudo tinham um alto triopism para o osso fazendo o seu caminho após a injeção IC de inúmeros locais do esqueleto, incluindo a mandíbula, focinho, coluna, fêmur, tíbia, costelas, esterno, escapular e ulnae. No entanto, outros sites de homing células PC3-Luc também foram encontrados fora do esqueleto e incluiu tecidos moles, o coração, pulmão e testículo compreendendo approximately10% de todas as metástases. Uma imagem representativa dos tumores formados após a injecção de IC é mostrado em (S2) que ilustra estas descobertas. Quando o número de tumores foram contadas verificou-se que os locais do esqueleto foram preferencialmente reduzida pelo tratamento com o anticorpo WISP1. Especificamente, nos controlos, 90% eram de metástases no tecido duro e 10% em tecido mole. Com tratamentos com anticorpos WISP1 o número de locais do esqueleto afectados foi reduzida para 66% do total das metástases com os sítios de tecidos moles que constituem 33% do total das metástases. Em adição ao número total de tumores a carga total do tumor foi reduzida em por tratamentos com anticorpos WISP1 em comparação com tratamentos de IgG (Figura 3B). Isto indicou que não só a difusão, mas também o crescimento do tumor foi reduzida por neutralização WISP1. Para testar a possibilidade de que WISP1 poderia afetar tumor cresceu nós próxima avaliou o crescimento das PC3-Luc utilizando xenoenxertos.

A. Número total de tumores desenvolvidos por rato tratado com IgG ou anti-WISP1 (LF-185). **

p Art 0,01 vs. PBS tratamento anti-WISP1, a carga tumoral B. total julgado por medições luciferease relativas por mouse. ***

p

. 0,001 IgG contra o tratamento anti-WISP1

WISP1 Antibody Tratamento reduz o tamanho do PC3-Luc xenoenxertos em ratinhos imunocomprometidos

os anticorpos contra WISP1 foram usados ​​ao longo de IgG lado e PBS controla a testar a sua capacidade relativa para reduzir o crescimento de células de cancro da próstata que foram cultivadas sob a pele de ratinhos imunocomprometidos. Os animais foram injectados duas vezes por semana com anticorpo anti-WISP1 e o crescimento do tumor monitorizada durante 4 semanas. Considerando que WISP1 é feita no osso foram também examinados os murganhos utilizando uma máquina DEXA e mostraram que os ratinhos tratados com anti-WISP1 não tiveram alterações significativas na percentagem de densidade mineral óssea antes e depois do tratamento em comparação com PBS ou controlos de IgG (S3 ). A taxa de crescimento do tumor foi medido durante o curso da experiência utilizando compassos de calibre, e indicou que os tumores nos ratinhos tratados com anti-WISP1 foram reduzidos em tamanho em comparação com os controlos PBS ou IgG (S4). Quando os tumores foram removidos no final dos tratamentos e fotografado, era evidente que os tumores eram mais pequenos nos ratinhos tratados com anti-WISP1, (Figura 4A) e que tinham peso estatisticamente menos global em comparação com os tumores de ratos tratados com PBS ou IgG (Figura 4B).

A.