Abstract

Fundo

Temos anteriormente descrito um modelo de rato transgénico RAF oncogene conduzido para o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Aqui nós examinar se iniciação do tumor e crescimento requer o fator de auto-renovação de células-tronco Bmi1.

principais conclusões

A fim de avaliar a função Bmi1 em NSCLC duas linhas fundadoras que diferem na incidência e latência de formação do tumor foram comparados. A ablação de expressão em ambas as linhas Bmi1 tinha um diminuiu dramaticamente o crescimento tumoral. Como a linha com latência menor correspondeu ao tempo de vida de Bmi1 bater para fora ratos, estes ratos foram escolhidos para um estudo mais aprofundado. A ausência de Bmi1 não diminuiu o número de iniciação do tumor nestes ratos como só o tamanho e não o número de tumores diminuiu. Redução no crescimento do tumor resultou de um aumento da morte celular e diminuição na progressão do ciclo celular que correspondeu com up-regulação do p16

INK4a e p19

ARF.

Significância

Os dados identifica Bmi1 como um fator importante para a expansão, mas não o início da RAF impulsionado NSCLC

Citation:. Becker M, Korn C, Sienerth AR, Voswinckel R, Luetkenhaus K, Ceteci F, et al. (2009) Protein Grupo Polycomb Bmi1 é necessária para o crescimento da RAF Impulsionada Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 4 (1): E4230. doi: 10.1371 /journal.pone.0004230

editor: Mauricio Rojas, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de agosto de 2008; Aceito: 05 de dezembro de 2008; Publicação: 19 de janeiro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Becker et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. MB e CK foram apoiados por SFB TR 17 do DFG, ARS e KL foram apoiados pelo DFG graduado da faculdade 1141 Wuerzburg-Nice. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer no mundo ocidental. Com base na histologia dois tipos diferentes de cancro do pulmão, cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC) e cancro do pulmão de pequenas células (SCLC) são definidos. Em geral 50% de todos os adenocarcinomas, a forma mais prevalente de NSCLC, abrigar mutações nos constituintes da sinalização mitogénica cascata i.e. EGFR, K-Ras e Raf-B [1]. As mutações do C-RAF também são encontrados em NSCLC, no entanto, com uma frequência menor.

Vários sistemas que o câncer modelo de pulmão em camundongos têm sido relatados. As estratégias para estabelecer esses modelos têm, basicamente, seguido dois caminhos diferentes. 1) Indução da expressão de oncogenes e supressão de genes supressores de tumores através de adenovírus expressão dirigida de Cre-recombinase [2] – [5]. Esta ocorrência abordagem imita de mutações somáticas em tecidos adultos. 2) A expressão de oncogenes constitutiva em células alvo através da utilização de promotores específicos do tipo de célula [6], [7]. Os últimos modelos podem ser mais apropriadas para mutações gestationally adquiridos. Embora os modelos viralmente induzidas mostram um espectro de células alvo tanto indefinido a abordagem transgénica tem o potencial de segmentação todas as células sensíveis de transformação que mostram a expressão de um promotor específico determinado tipo de célula.

anteriormente descrita a geração de linhas transgénicas expressando uma versão oncogenicamente activada do C-RAF-cinase (C-RAF BXB) sob o controlo do tipo alveolar humano dois (AT2) célula específica proteína surfactante C (SP-C) promotor de [7]. Duas linhas fundadoras, mais adiante referidos como BXB11 e BXB23, show de pulmão alvo desenvolvimento adenoma com alta penetrância, alta incidência e latência curta. Os tumores são fenotipicamente bastante estável como sem atipia nuclear ou metástase foi visto em um /6 fundo C57Bl. Um tipo de célula cubóide predominantemente forma os adenomas. Nenhuma hiperplasia epitelial brônquica contínua com tumores cubóides como descrito para os modelos oncogénico K-ras [4], foi observada. A linha fundador BXB23 tem sido amplamente utilizado em estudos genéticos para analisar a progressão do tumor factores que influenciam a [7] – [12]. Embora a expressão do transgene em todos os alvos principais células AT2 apenas um subconjunto deles responderam a expressão do C-RAF BXB com a formação de tumores [7]. Uma explicação para este achado é que um compartimento progenitor pulmonar responde a cascata mitogênica sinalizando com expansão. Alternativamente desligar da expressão do transgene na maior parte das células pode ocorrer AT2. Nós favorecer a primeira possibilidade e assumir que este compartimento de células progenitoras é Bmi1 positiva e depende da cascata mitogénica de sinalização para a auto-renovação uma vez que o tratamento com um inibidor da MEK levou à redução preferencial na fracção de células tumorais positivas para Bmi1 e uma diminuição dramática na massa tumoral [ ,,,0],12]. Consistente com estes resultados de células da endoderme primitiva, que vai dar origem a células progenitoras pulmonares mostram a dependência de sinalização mitogénica de auto-renovação, em vez de diferenciação [13]. Foi previamente demonstrado que a proteína grupo Polycomb Bmi1 é um fator crucial para a auto-renovação em células-tronco células-tronco /tumor adultos através da inibição da INK4a /ARF p16 locus de codificação

INK4a /p19

ARF ([ ,,,0],14], revisto em [15]). Bmi1 também foi recentemente identificado como um marcador de prognóstico para NSCLC [16], [17] e pertence a um grupo de factores que foram identificados como uma assinatura de morte de-cancro em malignidades humanas [18].

neste estudo nos propusemos a avaliar a função Bmi1 na RAF formação adenoma induzido. Devido ao tempo de vida limitado de ratos gene ablated Bmi1 [19] aproveitamos a maior incidência e menor latência da linha fundador BXB11 para examinar a dependência Bmi1 do crescimento adenoma na doença avançada.

Bmi1 ablação via cruzando a Bmi1 – /- fundo para a linha fundador BXB23 e BXB11 revelou que Bmi1 não é necessária para a iniciação do tumor, mas para a expansão de células iniciadas

Materiais e Métodos

Ética declaração

.

Todos os estudos com animais foram aprovados pelas autoridades do Estado da Baviera para a experimentação animal.

Animais

BXB23 e ratos BXB11 eram rotineiramente criados no fundo C57BL /6. Para a geração de Bmi1 – /- e BXB23 Bmi1 – /- ratos BXB11 ratos SP-C C-RAF BXB foram cruzados com Bmi1 +/- ratos que tinham sido propagadas sobre um fundo FVB /N. Os ratos heterozigotos compostos Bmi1 resultantes foram retrocruzado com FVB /N /Bmi1 +/- ratos para gerar Bmi1 – /-. Camundongos compostos SP-C C-RAF BXB

Reagentes e anticorpos

Os anticorpos usados para imuno-histoquímica /imunofluorescência: anticorpo SP-C de coelho policlonal Pro (Chemicon International), anticorpo CC10 de cabra policlonal (Santa Cruz Biotechnology), Pan-citoqueratina anticorpo policlonal de coelho (DAKO), Ki-67 de anticorpo monoclonal de ratinho (Novocastra), C-RAF rato anticorpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology), anticorpo monoclonal de ratinho Bmi1 (Upstate), p19

anticorpo policlonal de coelho ARF (Abcam), c-myc anticorpo policlonal de coelho (Santa Cruz Biotechnology), p16

anticorpo INK4a policlonal de coelho ( Santa Cruz Biotechnology), coelho monoclonal fosfo-p44 /p42 MAPK Thr 202 /Tyr204 (fosfo-ERK) anticorpo (Cell Signaling).

microscopia

a microscopia de fluorescência foi realizada utilizando um software Openlab ( Improvisação, Coventry, Reino Unido), controlada DMIRBE microscópio (Leica, Wetzlar, Alemanha) com uma Leica objectiva de imersão em óleo 40 ×. Todas as imagens foram capturadas e armazenadas como arquivos Openlab LIF. As imagens foram posteriormente processados ​​usando Power Point e software Adobe Illustrator.

O exame histopatológico e imuno-histoquímica /Imunofluorescência coloração

Os animais foram sacrificados e os pulmões foram fixados sob pressão de água de 25 cm com 4% PBS tamponada de formalina. A histologia foi feita no espécime, pulmão embebidos em parafina e fixados em formalina. 6 uM secções de corte foram desparafinizadas, re-hidratadas em álcoois graduados e hematoxilina-eosina (H E) corado. Para a quantificação da incidência tumoral o número de tumores dentro de pelo menos cinco áreas diferentes (uM 310390

2) por H secções de pulmão coradas E ou C-RAF foi contado. Pelo menos quatro ratinhos foram analisados ​​para cada genótipo. O volume do tumor foi calculado a partir de qualquer um de H E manchado ou anti-C-RAF tumores a partir de secções de pulmão inteiro assumindo um tumor coradas esférica. Os diâmetros dos tumores foram medidos usando um microscópio Leica. Para a quantificação dos volumes tumorais foram examinadas pelo menos quatro animais de cada genótipo e idade: 321 tumores de BXB11, 266 tumores de Bmi1 – /- BXB11, 92 tumores de BXB23 e 54 tumores do Bmi1 – /- BXB23 animais com a idade de duas semanas foram analisados. 133 tumores de Bmi1 – /- BXB11, 121 tumores de BXB23 e 4 tumores de Bmi1 – /- BXB23 animais com a idade de três meses foram analisadas. Para a quantificação da proliferação Ki67 /células positivas SP-C pro em secções de pulmão de ratos com o genótipo de idade indicada e foram analisados. Um total de pelo menos 1200 células positivas pro SP-C foram contadas a partir de cinco tumores seleccionados aleatoriamente e analisados ​​por co-coloração de Ki67. Para a coloração TUNEL Fluorométrica TUNEL-sistema sem saída (Promega) foi usado. foram analisadas e 25 tumores selecionados aleatoriamente de cinco camundongos (BXB11) Um total de 20 tumores selecionados aleatoriamente a partir de quatro ratinhos (BXB11 Bmi1 – – /). células positivas de 325 (+/- 100) DAPI por tumor foram analisados ​​por TUNEL positivo. Para a quantificação das células com coloração nuclear fosfo-ERK foram analisados ​​um mínimo de 14 tumores de dois ratinhos do genótipo indicado e a idade. análise morfológica semi automatizada de secções de pulmão de WT e Bmi1 – /- de animais foi efectuada tal como descrito em [20]. Para a quantificação de células CC10 SP-C /Pro duplas positivas foram analisadas cinco tumores selecionados aleatoriamente por seção de pulmão de um total de 5 animais nas idades de 2 semanas a 3 meses. Definições para captura de imagem foram escolhidos, que permitiu a detecção de células positivas duplas nos cruzamentos bronco-alveolar-duto (BADJs)

colorações de imunofluorescência foram realizadas de acordo com o seguinte protocolo básico:. Seções embebidos em parafina foram desparafinados e reidratadas . Por antigénio de microondas recuperação secções foram incubadas em tampão de citrato 10 mM, durante 6-23 min. As lâminas foram bloqueadas em solução tampão apropriada contendo quer 4% de cabra ou soro de burro, ou 1% de BSA (exclusivamente para a coloração Bmi1). A incubação com os anticorpos primários foi realizada durante a noite a 4 ° C, seguido de passos subsequentes tal como segue: Para pro SP-C /secções co-coloração de Ki67 foram incubadas com anticorpo de burro anti-ratinho biotinilado (1:200) e Cy5 anticorpo anti coelho de burro (1:200) durante 90 min à temperatura ambiente (RT) secções foram subsequentemente incubados com estreptavidina conjugada com Alexa 555 (1:200). Para coloração Bmi1 secções foram incubadas com um anticorpo anti-rato de cabra biotinilado em tampão de bloqueio durante 90 minutos à TA. Após três lavagens com PBS, as secções foram incubadas com o reagente ABC (Vectastain Elite Kit ABX, Vector Labs) durante 30 min à TA. Subsequentemente, as secções foram incubadas com anticorpo (1:100) Cy5 anti marcado com HRP (peroxidase de horseraddish) em tampão de bloqueio. Para p19

secções de coloração ARF foram incubadas com o anticorpo anti coelho de burro biotinilado (1:200) 90 min a RT. Após três lavagens com PBS secções foram incubadas com estreptavidina conjugada com Alexa 555 (1:200) em PBS, 0,2% de Triton X-100, 90 min à TA. Para pro seções SP-C /CC10 co-coloração foram incubadas com burro anti-cabra Alexa 555 (1:200) e burro anti coelho Cy5 (1:200) anticorpos em tampão de bloqueio durante 90 minutos. Todas as colorações foram finalmente contrastadas com DAPI antes da montagem.

Para colorações imuno-histoquímica cortes foram desparafinados e reidratadas. Para secções de recuperação de antigénio foram incubadas em tampão de citrato 10 mM a 90 ° C durante 10-20 min. A actividade da peroxidase endógena foi extinta com metanol ou com PBS contendo 3% H

2O

2. Para a coloração de c-myc, as secções foram bloqueadas 60 min com PBS contendo 0,2% Triton X-100 e soro de cabra a 4%. Após incubação do anticorpo primário durante a noite a 4 ° C secções foram incubadas com anti-coelho de cabra biotinilado anticorpo secundário, a uma diluição 1:200 durante 60 min à TA. reagente ABC foi aplicado (Kit Vectastain Elite ABX, Vector Labs) e desenvolvido em diaminobenzidina (DAB). As secções foram então contrastadas com hematoxilina e montadas após a desidratação. Fosfo p44 /p42 MAPK coloração foi realizada essencialmente como descrito para o c-myc, com as seguintes alterações: TBS, utilizou-se um de Tween 20 (TBST)% para lavagens. As secções foram bloqueadas com TBST contendo 0,2% de Triton X-100 e soro de cabra a 5%. incubação do anticorpo secundário foi efectuada utilizando anticorpo anti-coelho de cabra biotinilado em tampão de bloqueio durante 60 minutos. colorações Pan-citoqueratina foram realizadas [8].

análise de transferência de Western como previamente descrito de extractos de pulmão inteiro de

Para a preparação de extractos de recém-preparados pulmões foram transferidos para um tubo contendo 500 jil de gelo frio tampão RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato (DOC), 1% de Nonidet P40 com o cocktail inibidor de protease). Os pulmões foram homogeneizados durante 5 min, utilizando um homogeneizador Ultraturax em ambiente frio. Os tubos contendo o homogeneizado de pulmão foram centrifugadas numa centrifugadora arrefecida a 18000 g durante 30 min. Após centrifugação os sobrenadantes foram transferidos para um tubo fresco e aliquotas tomadas para determinação de proteínas. Os extractos restantes foram misturados com 2 × tampão de carga Laemmli aquecida a 95 ° C durante 5 min e armazenado a -20 ° C ou resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. Depois de um período de bloqueio de uma hora em PBS (0,05% Tween, 5% leite em pó desnatado) as transferências foram incubadas durante a noite com anticorpo primário, lavou-se três vezes com PBS e subsequentemente incubadas com um anticorpo secundário acoplado a peroxidase. Depois de três vezes lave em borrões PBS foram desenvolvidos.

RTPCR

RNA foi preparado a partir de pulmões inteiros de duas semanas ratos velhos com o kit para preparação de RNA peqGOLD TRIFAST (peqlab Biotechnologie GmbH) de acordo com o fabricante instruções. As amostras foram sujeitas a um tratamento com DNAse I, antes da preparação de ADNc utilizando iniciadores hexâmeros aleatórios fornecidos pelo First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas).

-PCR em tempo real foi realizada monitorização incorporação SYBR verde. Como um controlo interno dos níveis de ARN do gene HPRT foram monitorizados. a análise por PCR em tempo real foi realizada em um sistema de detecção de 2,000 Roto-Gene (Corbet Research). As sequências dos iniciadores: HPRT: CACAGGACTAGAACACCT; GCTGGTGAAAAGGACCTCT; p19

ARF: GCGCTCTGGCTTTCGTGAAC; CGTGTCCAGGAAGCCTTCCC; p16

INK4a: CGTGAGGGCACTGCTGGAAG; ACCAGCGTGTCCAGGAAGCC; p15

INK4b: CCAGGAAGCCTTCCCGAGCT; GGGGGCAAGTGGAGACGGTG; Cbx7: CGGCCCATTGGTCAGGTCTG; GACCCTCGCCTTGTCATGGC.

Resultados

Desenvolvimento de NSCLC em BXB23 e BXB11 ratos

formação adenoma Lung foi comparada entre BXB23 e BXB11 RAF linhas fundadoras transgênica. Tal como avaliado a partir de H E a coloração não houve diferença na histopatologia de tumores a partir de ambas as linhas. No entanto, o número de focos do tumor por área era notavelmente diferente. Quantificação de tumores mostraram uma incidência mais elevada de 4-5 vezes em pulmões de BXB11, em comparação com animais BXB23 (Figura 1A). A base desta diferença entre as tensões podem resultar da maior fracção de células que mostram nuclear fosfo-ERK em BXB 11 ratinhos (Figura S1A e B). Com base no número de tumores por secção, calculada a quantidade total de tumores por pulmão na gama de 3000 por uma média de tumores pulmonares BXB23 e 12000-15000 em um BXB11 pulmonar média. No fundo de aproximadamente 1-2 × 10

6 células AT2 dentro do pulmão do rato [21] conclui-se que em ambas as linhas fundadoras apenas um número muito limitado de células AT2 servir como células que iniciam tumorais. Esta constatação é consistente com a iniciação do tumor em um compartimento de células progenitoras e a resistência das células terminalmente diferenciadas AT2 para transformação embora desligamento transgene estocástica não pode ser excluída. Comparação do volume do tumor entre os fundadores não revelou diferenças significativas (Figura 1B). Tumores em BXB11 são mais frequentes e, portanto, mais rapidamente encher o pulmão levando à asfixia, como é evidente a partir das curvas de sobrevivência (Figura 1C).

A) Quantificação da incidência de tumores em BXB23 e BXB11 pulmões com a idade de 3 semanas (n = 5 animais, para mais detalhes veja materiais experimentais). B) Quantificação do volume do tumor entre BXB23 e BXB11. A diferença entre os dois fundadores não foi significativa. Dados apresentados como parcelas Box-and-Whisker. Caixas delinear primeiro e terceiro quartil, bigodes representam mínimos e máximos, respectivamente, medianas são indicados por linha sólida dentro de caixas, pequenos quadrados representam valores extremos experimentais. p-valores foram calculados utilizando o teste t de Student, apenas valores-p, indicando significância (p 0,05) são mostrados. C) trama de Kaplan-Meier para a sobrevivência de ratinhos BXB11 e BXB23. P-valor foi calculado pelo teste Logrank.

Bmi1 promove o crescimento do tumor, mas não iniciação do tumor em ambos os ratos BXB11 e BXB23

Com base na observação de que Bmi1 é expressa em BXB11 induzida tumores e o papel anteriormente descrita de Bmi1 em tumor de células estaminais auto-renovação [14], [22], [23], decidimos estudar melhor o papel da Bmi1 para o desenvolvimento de adenomas C-RAF BXB (Figura 2A). Geramos ratos compostos que expressam o transgene SP-C C-RAF BXB na Bmi1 bater para fora do fundo. À medida que a deleção genómica de Bmi1 não teve efeito sobre o desenvolvimento do pulmão e na estrutura do pulmão de adulto (Figura S2) quaisquer alterações no crescimento do tumor pode ser atribuída a Bmi1. A análise do Bmi1 – /- ratinhos SP-C C-RAF BXB é dificultada pela curta duração da vida destes ratinhos que é causada pela supressão de Bmi1 [24] e raramente permitiu a monitorização do desenvolvimento do tumor por mais de três meses.

a) parafina secções de pulmão embutidos de BXB11 e Bmi1 – /- BXB11 pulmões foram coradas para Bmi1 (verde) e DAPI (azul). linhas brancas pontilhadas delinear tumores. Barra de escala = 30 mm. B) H E a coloração de secções de pulmão de BXB11 e Bmi1 – /- BXB11 ratos com a idade de duas semanas e três meses demonstra Burdon tumoral reduzida em Bmi1 – /- BXB11 pulmões. Barra de escala = 200 pm. C e D) Análise de incidência do tumor e crescimento dentro dos pulmões de BXB11 e Bmi1 – /- BXB11 ratinhos. Dados apresentados como gráficos de Box-e-Bigodes, para obter detalhes sobre a apresentação de dados veja a figura lenda da Figura 1 (animais n≥4 por genótipo e idade, para mais detalhes veja materiais experimentais). Note-se que a incidência de tumores é aumentada por um factor de dois em comparação com a Figura 1A) por causa do fundo genético FVB /N introduzido através de acasalamento com a Bmi1 – /- ratos. n.d. = Não determinado porque os tumores foram confluentes. p-valores foram calculados utilizando o teste t de Student apenas valores-p, indicando significância são mostrados.

Por isso, analisou primeiro o efeito de Bmi1 ablação na iniciação do tumor de pulmão em segundo plano BXB11 como o tempo de vida de estes ratos igualou a de Bmi1 knock out camundongos. Em contraste com BXB23, BXB11 pulmões mostrou extremamente grandes áreas do pulmão ocupada por tecido de tumor em três meses de idade. O crescimento do tumor foi fortemente reduzida no interior dos pulmões de Bmi1 – /- BXB11 ratinhos (Figura 2B) de duas maneiras, em primeiro lugar, houve uma diminuição de aproximadamente duas vezes de números de tumor entre duas semanas e três meses de idade (Figura 2C) e segundo o volume de sobreviventes tumores diminuiu (Figura 2D). Dados semelhantes foram obtidos para Bmi1 – /- ratos BXB23 compostos (Figura S3). Embora reduzida no tamanho dos tumores em Bmi1 – /- BXB11 pulmões apresentavam características de SP-C, C-RAFBXB adenomas induzidos, tal como avaliado por análise da morfologia celular e coloração com dois marcadores tumorais (pan-citoqueratina e pro SP-C; Figura S4) . Além disso, o fechamento de expressão do transgene em consequência de Bmi1 ablação pode ser descartada como uma razão para o crescimento do tumor reduzido desde Bmi1 – /- BXB11 tumores manchadas positiva com um anticorpo C-RAF (Figura S4). Consistentemente o nível de nuclear fosfo-ERK foi mantida em BXB11 e Bmi1 – /- BXB11 de duas semanas a três meses de idade, demonstrando que a cessação de crescimento não é causada por uma redução na sinalização através da cascata mitogénico (Figura S5)

em resumo, a ablação de Bmi1 em BXB11 ratos leva a uma redução fortemente o crescimento do tumor. O número inicial de tumores em BXB11 contra Bmi1 – /- BXB11 no entanto, não mostram uma redução significativa no Bmi1 – /-. BXB11 pulmões, o que indica que a especificação de células tumorais de iniciação não depende Bmi1

Aumento morte celular e reduzida fração de células no ciclo na Bmi1 – /- BXB11 animais

o crescimento do tumor fortemente reduzida e a perda de tumores ao longo do tempo em ambas as linhas fundadores com expressão Bmi1 revogada ou é uma consequência de um bloco em a progressão do ciclo celular ou aumento da morte celular, ou uma combinação de ambos. Bmi1 foi anteriormente implicado na promoção da sobrevivência de células tumorais e progressão do ciclo celular em um sistema de cultura de tecidos modelo [25], [26]. Coloração de TUNEL demonstrou um aumento significativo na proporção de células apoptóticas nos adenomas de três meses de idade Bmi1 – /- BXB11 ratinhos (Figura 3A e 3C). Isto indica que a apoptose é um evento tardio no Bmi1 – /- BXB11 adenomas. Em seguida, examinamos a taxa de crescimento. Foi realizada Ki-67 /pro SP-C co-manchas nos pulmões preparados a partir de duas semanas e três meses de idade Bmi1 – /- BXB11 e BXB11 animais. A fracção de células em ciclo é fortemente reduzido mediante Bmi1 ablação. Além disso, como é evidente a partir do controlo BXB11 com a idade de três meses, a taxa de crescimento desses tumores também diminuiu sugerindo quer um tempo de vida replicativo limitado para BXB11 AT2 células transformadas ou outros níveis de controlo do crescimento (Figura 3B e 3D).

A) coloração TUNEL de secções de pulmão embebidos em parafina de Bmi1 – /- ratos BXB11 e BXB11. Tratado com DNase I secções de pulmão foram usadas como controlo positivo. Secções tratados sem desoxinucleotidiltransferase terminais serviu como controle negativo. linhas brancas pontilhadas delinear tumores. Genótipos e idades, como indicado. As setas indicam células apoptóticas (verde). Barra de escala = 30 mm. B) Ki67 (vermelho) /pro SP-C (verde) imunofluorescência co de secções de pulmão a partir BXB11 e Bmi1 – /- BXB11 ratos. As setas indicam células tumorais ciclismo. “*” Indica coloração artefato. Barra de escala = 30 mm. C) Quantificação de células positivas TUNEL em tumores de pulmão de duas semanas e três meses de idade BXB11 e Bmi1 – /- BXB11 ratos (n = 4 animais por genótipo), para detalhes, ver materiais e métodos. Dados apresentados como Box-and-Bigodes enredo para detalhes da apresentação de dados veja a figura lenda da Figura 1. D) Quantificação de Ki-67 /pro células SP-C dupla positivos. Pelo menos cinco tumores de cinco animais diferentes foram analisadas. p-valores foram calculados utilizando o teste t de Student, apenas valores-p, indicando significância são mostrados.

Em conclusão, tanto a sobrevivência da célula tumoral e proliferação celular são afetados em ratos BXB11 com Bmi1 eliminação e pode responder por o crescimento do tumor reduziu observado.

Bmi1 expressão dependente de p16

INK4a e p19

ARF

Bmi1 está implicado na regulação cdki. O mais proeminente p16

INK4a, p19

ARF foram mostrados para ser regulamentado negativamente por Bmi1 [27]. Portanto alterado p16

INK4a /p19

níveis de expressão ARF poderia explicar o número reduzido de sobreviventes e de bicicleta células em Bmi1 – /- BXB11 tumores. O primeiro analisada a expressão de níveis de ARNm de p16

INK4a por RT-PCR semi-quantitativa em pulmões de duas semanas de idade e BXB11 Bmi1 – /- BXB11 ratinhos (Figura 4A). Os níveis de expressão de p16

INK4a foram significativamente aumentada em Bmi1 – /- BXB11 pulmões. A análise Western blot dos lisados ​​pulmonares inteiros confirmou este resultado no nível de proteína (Figura S6A).

A-D) em tempo real A análise de PCR semi-quantitativa de ARN total a partir de pulmões inteiros de ratos velhos duas semanas, como genótipos indicado. níveis BXB11 foram definidos para um. Os dados são representativos de dois conjuntos independentes de análise. Os dados mostram desvios padrão de valores triplicados. p-valores foram calculados utilizando o teste t de Student, apenas valores-p, indicando significância são mostrados. A) Quantificação de p16

INK4a níveis de expressão B) Quantificação de p19

níveis de expressão de RNA ARF. C) Quantificação de p15

INK4b níveis de expressão. D) A quantificação dos níveis de expressão Cbx7.

Em seguida, analisaram os níveis de p19

ARF expressão de mRNA. Tal como no caso de p16

INK4a, p19

ARF e p15

INK4b níveis de expressão foram regulados positivamente em pulmões de Bmi1 – /- BXB11 quando comparado com BXB11 (Figura 4B e 4C). Em contraste com p16

INK4a que não foi alterada entre o tipo selvagem e ratinhos BXB11, que encontraram níveis elevados de p19

expressão de ARN IRA também na BXB11 pulmões (dados não mostrados). Outro regulador epigenética do locus INK4a, Cbx7 não foi significativamente alterada na expressão em cima Bmi1 ablação em BXB11 ratos (Figura 4D). imunofluorescência de Bmi1 – /- BXB11 e BXB11 pulmões mostraram que p19

ARF é expressa em tumores de pulmão de animais de ambos os genótipos. As diferenças na distribuição subnuclear de p19

IRA são, no entanto, evidente quando Bmi1 – /- e BXB11 BXB11 tumores são comparados. Enquanto a ablação de Bmi1 está associada com um padrão nuclear focal de multi coloração de p19

ARF em quase todas as células tumorais é confinado a um único locus dentro dos núcleos de tumores, na presença de Bmi1 (Figura S7).

em conclusão encontramos reduzidos em p19 fase tardia

ARF tumores BXB11 positivos que possam ser interpretados como parte de um fenótipo de senescência. Uma possível explicação para este efeito suave pode ser a expressão de c-MYC que encontramos em células tumorais BXB11 (Figura S6B) e que foi recentemente descrito para reverter um fenótipo sensescence em melanomas B-RAF transformadas [28]. Na ausência de Bmi1 No entanto, a expressão de INK4a /Arf foi mais pronunciado, embora a expressão de c-MYC foi mantida (Figura S6B) levando eventualmente a cessação de proliferação. Assim, nestas condições, um resgate c-MYC pode deixar de funcionar.

Não há evidência de células-alveolar-tronco brônquio (BASCs) em tumores de pulmão independente de Bmi1

A seguir, dirigiu-se à contribuição de células BASC à formação de tumor SP-C C-RAF BXB. Para este fim, realizado Pro SP-C /CC10 dupla coloração e analisados ​​BXB11 tumores para a presença de células positivas duplas. Para esta imagem Análise de configurações de aquisição foram escolhidos, que permitiu a identificação de BASCs em BADJs. Tal como ilustrado na Figura 5, não há células duplamente positivas pode ser observada em tumores.

secções de pulmão de ratos embebido em parafina foram coradas para BXB11 Pro SP-C (vermelho) e de CC10 (verde) para detectar dupla brônquio positiva células estaminais alveolares (BASCs). Uma célula BASC representativo que está localizada a uma junção adesiva alveolar brônquio (BADJ) está indicado pela seta branca. Barra de escala = 30 mm.

Em resumo destes dados indica que o pool de células tumorais independente Bmi1 que representa presumivelmente células tumorais iniciando não representa BASCs.

Discussão

no presente estudo foram empregados duas linhas fundadoras transgênicos com pulmão alvo expressão de C-RAF BXB para a dependência da iniciação adenoma e crescimento no fator de auto-renovação das células-tronco Bmi1. Mostramos que BXB11 tem uma maior incidência de quatro vezes e a menor latência de adenomas permitindo o exame de doença avançada, na ausência de Bmi1. Depleção de Bmi1 tanto no fundo BXB23 BXB11 e levou a uma diminuição acentuada na taxa de crescimento do tumor e um aumento na morte de células dentro dos adenomas. Em contraste nenhuma redução significativa nos eventos de iniciação do tumor pode ser observado em ambas as linhas fundadoras, argumentando para Bmi1 ser um factor importante para a expansão do tumor em vez de iniciação.

A partir da observação, que é expresso em Bmi1 o C- RAF BXB iniciado de adenomas do pulmão e que é um alvo Bmi1 de sinalização RAF [19], decidimos investigar a formação de adenoma na ausência de Bmi1. O cancelamento de expressão Bmi1 no fundo BXB23 BXB11 e não deu uma redução significativa em eventos de iniciação do tumor, tal como definido pelo número de tumores que se formaram nas várias combinações genéticas de duas semanas de idade. Análise de células de adenoma do pulmão na ausência ou na presença de Bmi1 não revelou diferenças no nível de expressão do marcador de célula morfológica e em. Portanto, a ausência de Bmi1 não afectar o processo de iniciação do tumor. Estes resultados são consistentes com um relatório publicado anteriormente mostrando Bmi1 iniciação glioma independente embora na ausência de INK4a [29]. A ausência de Bmi1 não afectou a identidade das células tumorais resultantes no que diz respeito à morfologia e expressão de um conjunto limitado de marcadores. Estes resultados também indicam que Bmi1 não é necessária para a especificação de um tumor de células iniciando no interior do pulmão. níveis de fosfo-ERK pode compensar a perda Bmi1 de curto prazo, mas não a longo prazo divisões auto renovação das células iniciadas como observamos um crescimento significativo do tumor em Bmi1 – /- BXB11 mostrando maior nuclear fosfo-ERK seguido de cessação da divisão celular em momentos tarde ( três meses de idade) quando nuclear de fósforo-ERK ainda estava presente. No curso de nossos estudos, também não observaram alterações na morfologia pulmonar em Bmi1 – /- ratos indicando que Bmi1 não é um factor crucial para o desenvolvimento do pulmão adequado. Encontramos um forte aumento da regulação do p19

ARF, p16

INK4a e, p15

INK4b em preparações de ARN de pulmão inteiras de Bmi1 – /- animais, em comparação com ninhada de tipo selvagem. A expressão da p19

ARF não pode ser exclusivamente atribuídos a células pulmonares infiltração do sistema hematopoiético, uma vez nós vemos p19 pronunciada

expressão ARF nas células e células que revestem os brônquios em Bmi1 AT2 – /- animais (dados não mostrados ). Obviamente, a expressão de cdkis não prejudicar a função das células do pulmão normal. Este achado é de interesses referente a efeitos pontuais alvo em possíveis futuras estratégias terapêuticas dirigidas Bmi1 no cancro do pulmão

Cdkis codificado no locus INK4a estão implicados na inibição da progressão do ciclo celular e controle da célula de sobrevivência [30] -. [ ,,,0],32]. Em linha com esta vemos a progressão reduzida de células tumorais ciclo no Bmi1 – /- BXB11 tumores e um aumento das células em apoptose embora com algum atraso. Estas conclusões estão em linha com os resultados anteriores publicados por Liu e colegas [25] mostrando

in vitro

um efeito específico de Bmi1 na sobrevivência de células tumorais.

De acordo com relatórios anteriores que mostram p19

ARF-regulação em resposta a sinais hiperproliferativas oncogênicos [33] – [35], expressão da p19

ARF não se restringiu ao Bmi1 – /- fundo, mas também pode ser observada em menor medida, na BXB11 adenomas. Notamos que p19

ARF localizada a apenas um de dois focos nuclear distinta dentro BXB11 adenomas.