Abstract

Cirurgia induzida a inflamação é um potente promotor de recorrência de tumores e metástases no cancro colorectal. A família de enzimas recentemente descobertas Nox representam uma fonte importante de espécies de oxigénio reactivas (ROS) endógenas e são agora fortemente implicada na metástase de células tumorais. Curiosamente, as enzimas de NOx podem ser ‘propositadamente’ activado por citoquinas inflamatórias e factores de crescimento que estão presentes em abundância na janela de peri-operatória. Como as células cancerígenas do cólon expressam enzimas NOx e receptor 4 do tipo Toll (TLR-4), que a hipótese de que LPS pode potenciar a capacidade das células de cancro do cólon para metastizar via enzima Nox sinalização redox mediada. Em apoio a esta hipótese, este trabalho demonstra que o LPS induz um aumento significativo, transitória da endógena ROS em SW480, SW620 e CT-26 células cancerígenas do cólon. Este aumento na actividade de ROS induzida por LPS é completamente abolida por um inibidor de Nox, diphenyleneiodonium (DPI), Nox1 siRNA e um inibidor de NF-kB, Dicloridrato. Um aumento significativo na expressão de proteínas e Nox1 Nox2 ocorre após o tratamento com LPS. Inibição de NF-kB também atenua o aumento da expressão da proteína Nox1 e Nox2. A localização sub-celular de geração de ROS induzida por LPS reside principalmente no retículo endoplasmático. LPS activa a via PI3K /Akt através Nox gerado ROS e este sinal é inibida pelo DPI. Este mecanismo activados com LPS Nox facilita um aumento significativo na adesão de células de cancro do cólon SW480 a colagénio I, que é inibida pelo DPI, Nox1 siRNA e um inibidor de PI3K. No seu conjunto, estes dados sugerem que o eixo redox sinalização LPS-Nox1 desempenha um papel crucial na facilitação da adesão celular do cancro do cólon, aumentando assim o potencial metastático de células de cancro do cólon. Nox1 pode representar um alvo valioso em que para evitar a metástase do câncer de cólon

Citation:. O’Leary DP, Bhatt L, Woolley JF, Gough DR, Wang JH, Cotter TG, et al. (2012) TLR-4 Sinalização Acelera Colon Cancer Cell Adesão via NF-kB mediada por transcrição-regulação de Nox-1. PLoS ONE 7 (10): e44176. doi: 10.1371 /journal.pone.0044176

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de maio de 2012; Aceito: 30 de julho de 2012; Publicação: 11 de outubro de 2012

Direitos de autor: © O’Leary et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é a segunda causa mais comum de câncer. mortalidade relacionada no mundo ocidental [1]. A ressecção cirúrgica continua a ser o pilar do tratamento curativo para câncer de cólon. No entanto, cerca de 25 a 35% dos pacientes positivos nó irá desenvolver a recorrência local ou metástase distante dentro de cinco anos de pós-operatório [2]. Este fenómeno é devido à libertação de mediadores inflamatórios em resposta ao trauma cirúrgico, que potenciam a capacidade metastática de células de tumor e células de tumor residual em circulação. Os efeitos deste fenómeno se manifesta em uma redução significativa nos livre de doença e sobrevida global em doentes com cancro colorectal.

Aderência celular

tumor é um passo essencial da cascata metastática. Evidências recentes demonstram como as espécies reactivas de oxigénio induzida por cirurgia exógenos (ROS) aumentar a capacidade das células de tumor circulante para aderir ao revestimento endotelial, criando aberturas intercelulares, permitindo que as células tumorais a aderir preferencialmente a matriz extra-celular exposta. Estes efeitos citotóxicos, destrutivas de ROS ocorrem em níveis elevados. No entanto, a níveis baixos, endógena ROS pode promover a sobrevivência de células por meio de regulação das vias de sobrevivência sensíveis redox, tais como PI3K /Akt, que tem sido fortemente implicado no sentido de facilitar a metástase de células tumorais.

Enzimas

de NOx são uma importante fonte de endógena a produção de ROS em resposta a mediadores inflamatórios tais como citoquinas, factores de crescimento e condições de hipoxia, todos os quais são elevados em resposta ao trauma cirúrgico [3] – [4]. enzimas Nox consistem de uma família de enzimas, 7 Nox1-5 Duox1,2 e [5]. Curiosamente, a expressão de enzimas de Nox em células de cancro foi recentemente descrita e ROS Nox-derivados são agora conhecidos para facilitar o processo metastático em células cancerosas incluindo cólon, melanoma, do pâncreas e nas células de cancro gástrico [6] – [8]. Evidências recentes sugerem que os efeitos de sinalização de ROS Nox-derivada é dependente do contexto, uma vez que não só confere efeitos pró-inflamatórios, mas também desempenhar um papel no mecanismo celular de defesa anti-inflamatório [9].

lipopolissacarídeo ( LPS) ou endotoxina é um gatilho potente de respostas inflamatórias do hospedeiro na janela peri-operatória. LPS é um antigénio bacteriano Gram-negativo, que transloca o através da parede do intestino após uma cirurgia importante ou durante um episódio séptico, endotoxemia resultando em um [10]. O reconhecimento de LPS pela Toll-like receptor-4 (RST4) induz imunidade inata por meio de uma cascata de sinalização intracelular de uma forma dependente ou independente de MyD88. Tanto in vitro e in vivo em estudos implicam agora induzida por LPS de TLR-4 sinalização como um gatilho de todas as facetas da cascata metastática incluindo adesão [11] – [12]. Além disso, TLR-4 expressão em células de câncer de cólon está associada com um risco aumentado de formação de metástases hepáticas em pacientes com câncer de cólon e confere um pior prognóstico [13] – [15].

Como evidência recente sugere, bem sucedido metástase das células tumorais é promovido pelos efeitos destrutivos da ROS exógena. Testar a hipótese de que os níveis endógenos não-tóxicos de ROS também pode desempenhar um papel importante na orquestração de metástases de células tumorais. Aqui, demonstramos como um eixo de sinalização LPS-Nox1 dá origem a um aumento significativo na capacidade adesiva das células cancerosas do cólon. a activação por LPS de actividade Nox ocorre de um modo dependente de NF-kB, que resulta em um aumento transitório de intracelular ROS. Este aumento transitório de ROS intracelular causa a fosforilação de Akt redox sensível. No seu conjunto, estes dados sugerem que o eixo de sinalização redox LPS-Nox1 desempenha um papel crucial na facilitação da adesão celular do cancro do cólon, aumentando assim o potencial metastático de células de cancro do cólon.

Materiais e Métodos

Cultura de células

as linhas de células cancerígenas do cólon humano, SW480, SW-620 e CT-26 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram mantidas num estado de sub-confluência utilizando meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) meio de cultura suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, 1% de penicilina /estreptomicina e 4 mmol /L de L-glutamina todos de Sigma Aldrich, Dublin, Irlanda . As células foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. As células foram cultivadas durante a noite antes do tratamento LPS para permitir a ligação

Anticorpos e reagentes

LPS derivado

E.coli

estirpe 055:. B5 foi adquirida da Sigma-Aldrich. Neste estudo foram utilizados os seguintes anticorpos – Nox1, p22phox, p47phox (Santa-Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, EUA), Nox2 (Upstate, Milton Keynes, Reino Unido), p-Akt (Cell Signaling), IkB-α , p-IkB-alfa (Sinalização celular), GAPDH (Immunochemicals avançadas, Long Beach, CA, EUA). inibidor de IKK (dicloridrato) foi adquirido a Sigma e inibidor de PI3K (LY294002) foi adquirido a Merck Chemicals (San Diego, CA, EUA). knockdown alvo de Nox1 foi realizada utilizando siRNA. Duas construções foram utilizadas diferentes (Ambion, # s25726, s25727).

A citometria de fluxo

5 × 10

4 células por poço durante a noite foram plaqueadas numa placa de 24 poços. As células foram tratadas com LPS na concentração de 1 ug /ml para 0,10,20,30,40,50,60 minutos e 24 horas. produção de ROS a seguir ao tratamento com LPS foi monitorizada usando 2 ‘, 7’ diacetato dichlorodihydrofluorescin (DCF) (Molecular Probes, Leidin, Países Baixos). As células foram tripsinizadas, centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm e em seguida recolhido. DCF foi então adicionada a uma concentração final de 50 uM e as amostras foram incubadas durante 15 minutos a 37 ° C antes da análise num citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). Dichlorofluorescin (DCF) de fluorescência, é gerado quando interage com DCF ROS. ROS, assim, foi medido no canal de fluorescência 1 (FL-1) (530 nm) com excitação a 488 nm. software CellQuest (Becton Dickinson) foi usado para a análise de dados.

Western Blotting

Western Blotting foi realizada para medir o teor de proteína de células tratadas com 1 ug /ml de LPS para 0,10,20, 30,40,50,60 minutos e 24 horas. As células foram então centrifugadas e trysinised para recolha. Os extractos celulares totais foram então obtidos. Os sedimentos celulares foram lavados com PBS gelado e depois ressuspensas em tampão de lise celular mM de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 150 mMNaCl, 1 mMNa3VO4, 1 mMNaF, 1 mMEGTA, 1% de Nonidet, 0,25% de desoxicolato de sódio, contendo inibidores de protease P-40 ( Roche Diagnostics, Lewes, UK) e 0,2 mM de 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo cloridrato de fluoreto] e incubou-se em gelo durante 20 min. Todos os detritos foram removidos por centrifugação a 4 ° C e a concentração de proteína foi quantificada utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK), utilizando albumina de soro bovino como padrão. quantidades equivalentes de proteína foram resolvidos utilizando electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio-, seguido de transferência para membranas de nitrocelulose (Schleicher Schuell, Whatman, Dassel, Alemanha). As membranas foram bloqueadas com 5% (w /v) de leite seco não gordo, em solução salina tamponada com Tris /0,1% de Tween-20 durante 1 h à temperatura ambiente. Eles foram incubados a 4 ° C durante a noite com uma diluição adequada de anticorpo primário (1:1000 a menos que indicado de outra forma). Após 4 × lavagens de 5 minutos com solução salina tamponada com Tris /0,1% de Tween-20, as transferências foram incubadas com os conjugados de peroxidase correspondentes anticorpo secundário (diluição 1:1000) durante 1 hora. Eles foram, em seguida, lavou-se novamente e desenvolvido com reagente de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Probing para GAPDH (1:5000) foi utilizado para determinar o carregamento igual de proteína.

imunofluorescência e microscopia

De forma a localizar ROS gerado por tratamento com LPS em células SW480, as células foram cultivadas durante 48 horas antes do experimento no fundo de vidro pratos (35 mm placas de petri com micropoços 14 mm; Mattek Corporation, Ashland, MA, EUA). As células utilizadas para imagens ao vivo foram incubadas em 50 uM e 1 uM DCF corante ER rastreador (Molecular Probes, Leiden, Países Baixos) durante 1 hora a 37 ° C. LPS Uma micro-molar foi adicionado às células que contêm os corantes 30 minutos antes da imagiologia. Onde indicado, as células foram tratadas com 10? M de DPI com DCF e corantes de rastreador de ER durante 1 hora a 37 ° C e 1 uM de LPS foi adicionado às células 30 minutos antes da imagiologia. Após esta incubação com os corantes, as células foram enxaguadas e fotografada em qualquer meio de crescimento contendo LPS ou LPS e DPI ou meio de crescimento sozinho. As concentrações de DPI e de LPS foram mantidas no meio de crescimento e de lavagem, enquanto imagens de células. células SW480 foram também corados com 8 uM Menadiona durante 1 hora em conjunto com 10 uM e 1 uM MitoPY MitoTracker vermelho escuro (Invitrogen). Menadiona foi usada como um controlo positivo. Além disso, as células coradas com MitoPY foram tratados com LPS de 1 ug /ml antes da imagiologia. células SW480 foram fotografadas com um microscópio de exploração de laser multiphoton Flouview1000 MPE (Tecnologia Mason, Dublin, Irlanda) com um Ti vermelho infravermelho: Sapphire Laser, que é o modo bloqueado. As imagens foram adquiridas e visualizados usando um XLPLN 25 × WMP objectiva de imersão em água (1,05 abertura numérica: Olympus Optical GmbH, Hamburgo, Alemanha) e as imagens foram armazenadas com um flouview1000 software Olympus (Mason Tecnologia, Dublin, Irlanda). Durante aquisições, configurações de detecção foram mantidas constantes para DCF para permitir a comparação direta dos níveis de ROS, onde as células tratadas com LPS foram comparados com não tratada ou LPS e DPI células tratadas. Imagens foram representados como uma única fatia a partir de uma projecção Z-pilha.

PCR quantitativa

quantitativa por PCR foi realizada em oligo-dT gerado ADNc utilizando o sistema de detecção de 2 MJ Research Opticon em combinação com Quantitect a mistura SYBR Green PCR master (Qiagen, Crawley, Reino Unido). Os iniciadores para Nox1, Nox2 e β-actina foram adquiridos como ensaios Quantitect Primer (Qiagen). Os seguintes parâmetros de PCR foram utilizados para cada conjunto de iniciadores: desnaturação a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos, a temperatura de recozimento de 56 ° C durante 30 segundos e extensão a 72 ° C durante 30 segundos . As amostras de RNA foram analisadas em triplicado, e Nox1 ou Nox2 expressão em relação ao p-actina foi determinada através do 2

-ΔΔCt método.

ensaio de adesão

placas de 96 poços foram revestidas com 150 ul /poço de colagénio I a 0,01% durante a noite a 4 ° C e, em seguida, bloqueadas com BSA a 1% durante 1 hora a 37 ° C antes de semear as células. 5 × 10

4 células foram ressuspensas em 100 ul de meio de cultura e semeadas em cada poço. As células foram incubadas a 37 ° C durante 1 hora. Cada cavidade foi então lavada com PBS e, em seguida, 1% de violeta de cristal foi usado para corar as células durante 20 minutos. Placa foi lavada 3 vezes e em seguida deixada durante a noite a secar à tempeture ambiente. violeta de cristal de coloração foi em seguida dissolvido em ácido acético a 10% e a concentração foi determinada medindo a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de microplacas espectrofotométrico.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o programa SPSS 18.1 para versão Windows (SPSS, Dublin, Irlanda). Os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student para as comparações entre os grupos, e a análise de variância (ANOVA). Densitometria em Western blot foi realizada utilizando o ImageJ programa (de https://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Os gráficos foram construídos usando o Microsoft Excel 2010. Todos os valores do gráfico representam valores médios +/- desvio padrão. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

LPS induzida TLR-4 sinalização aumenta os níveis de ROS intracelulares em células de cancro do cólon

SW480, SW620 e CT. -26 células expressam TLR-4 e foram, portanto, escolhido para examinar o efeito de produção de ROS induzida por LPS [16]. Conforme determinado por análise de FACScan, um aumento transitório dos níveis de ROS intracelulares é vista em resposta ao tratamento com LPS, após 40 minutos, em todas as linhas de células (Figura 1 (a)). os níveis endógenos de ROS são quase a níveis de controle em 60 minutos. Estes dados foram quantificados usando o programa de computador CellQuest para medir as médias geométricas das curvas (Figura 1 (b)). células SW480 gerar consistentemente níveis mais elevados de ROS intracelular em comparação com as células SW620 e CT-26. Nesta base células SW480 são o principal foco de experimentos posteriores.

(a) LPS induziu uma transitória, aumento significativo na atividade ROS em SW480, SW620, Ct-26 células cancerígenas do cólon. SW480, SW620 e células TC-26 foram tratadas com LPS (1 ug /ml) a vinte, quarenta e sessenta minutos. DCF fluorescência foi medida usando o citómetro de fluxo FACScan e o software CellQuest. Estes resultados são compilados nos histogramas acima. O eixo y representa as contagens de células e as medidas do eixo-x, o nível de fluorescência. A mudança para a direita ao longo do eixo x representa um nível mais elevado de DCF fluorescência e, assim, a produção de ROS. Todos os histogramas mostram um controle (linha preta sólida) com uma linha de cor que representa um aumento de DCF fluorescência. O efeito de LPS sobre a actividade de ROS em SW480, SW620 e TC-26 do cancro do cólon células foi quantificada utilizando CellQuest para medir as médias geométricas das curvas e comparadas com controlos não tratados testadas no mesmo dia, e em comparação num gráfico de barras. (B) LPS induz uma dose dependente ROS estourar em 40 minutos. Um histograma de citometria de fluxo demonstra um deslocamento dependente da dose na actividade de ROS. (Linha preta sólida = não tratados, verde = 0,1 ug /ml, vermelho = 1 ug /ml, azul = 10 ug /ml, o efeito dependente da dose foi quantificada e comparada num gráfico de barras * P … 0,05 Estes dados são representativos de 3 experiências independentes.

próxima procurou examinar se este aumento induzido por LPS em ROS endógena foi sensível a variações na dose de LPS. mostra-se que como a dose de LPS aumenta, o ROS resposta aumenta (Figura (1b)). Estes resultados indicam que as células SW480 gerar endógena de ROS em resposta à sinalização de TLR-4 de um modo dependente da dose em células cancerígenas do cólon.

induzida por LPS a produção de ROS em células SW480 é revogada por um inibidor da enzima de Nox

Dado que TLR-4 sinalização induz um aumento significativo nos níveis endógenos de ROS, o próximo procurado para estabelecer a fonte de ROS intracelular induzida por LPS. actividade ROS induzida por LPS-se sabe envolver TLR-4 mediada por interacção com Nox4 em células embrionárias de rim [17]. no entanto, a fonte intra-celular de ROS induzida por LPS em células do cancro do cólon é em grande parte desconhecida. Outras fontes plausíveis de geração de ROS endógena lado de enzimas Nox incluem mitocôndrias e enzimas COX. Com isto em mente que usamos inibidores direcionados para evitar a geração de ROS em células SW480 de todas essas fontes, incluindo um inibidor mitocondrial (rotenona), um inibidor da COX (diclofenac) e um inibidor da proteína Nox (DPI). Pré-tratamento com rotenona foi associada com um ligeiro aumento nos níveis de ROS, de acordo com relatos recentes que podem activar a actividade rotenona Nox [18]. Diclofenac provoca nenhuma diminuição significativa nos níveis intracelulares ROS induzida por LPS (Figura 2 (a) e (b)). Interessantemente, o pré-tratamento com o DPI resulta na anulação completa da actividade ROS induzida por LPS em 40 minutos (Figura 2 (c)). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que as enzimas de NOx são a mais provável fonte intra-celular de ROS seguinte RST4 sinalização em células cancerígenas do cólon.

(a) Uma atenuação significativa da fluorescência foi observada em amostras tratadas com o DPI ( 2 uM). DCF fluorescência foi medida usando o citómetro de fluxo FACScan e o software CellQuest. linha preta sólida (controlo). linha vermelha (tratado LPS). linha verde (tratado LPS + DPI). (B, c) e rotenona diclofenac não conseguiu inibir LPS (1 ug /ml) actividade de ROS induzidas em 40 minutos. * P 0,05. Estes dados são representativos de 3 expericias independentes.

tratamento com LPS das células SW480 aumenta os níveis de expressão e Nox1 Nox2

Como DPI resultou na abolição completa da actividade ROS induzida por LPS, nós pretendia investigar o papel das enzimas de NOx na geração de ROS induzida por LPS em células SW480. Western blot foi utilizada para identificar a expressão da enzima Nox. Nox1 bem como Nox2 foram encontrados a ser expresso (Figura 3 (a), (b)). Curiosamente, o nível de Nox1 e aumenta a expressão Nox2 em resposta ao tratamento com LPS. expressão da proteína Nox1 aumenta significativamente superior ao nível de expressão não tratada em 40 minutos (Figura 3 (a)). Um aumento semelhante é observada no padrão de Nox2 (Figura 3 (b)) expressão. A elevação da expressão da proteína Nox1 Nox2 e coincide com o aumento significativo dos LPS induzida por geração de ROS em 40 minutos, visto na citometria de fluxo.

(a) Utilizando a técnica Western Blot que mostram que a expressão em células SW480 Nox1 aumenta em resposta a LPS (1 ug /ml). (B) Transferência Western também mostra que o LPS aumentou a expressão de Nox2 em 40 minutos. (C) p22phox é mostrado a ser expresso e expressão aumenta mais cedo do que Nox1 e Nox2. (D) p47phox é mostrado a ser expresso, mas a expressão é estável ao longo dos pontos de tempo. (E) A análise quantitativa por PCR de ARNm e Nox1 Nox2 em células SW480 tratados com LPS (1 ug /ml) durante uma hora. Os dados são representados como vezes de alteração em relação às células de controlo não tratadas horas como determinado pelo método 2-ΔΔCt. Os resultados são expressos como média ± DP e são representativos de três experiências independentes. * P 0,05. Estes dados são representativos de 3 experiências independentes.

Nox ativação enzimática é dependente em cima de montagem de sub-unidades individuais. Estamos, portanto, também analisou o efeito do tratamento com LPS na expressão da proteína de p22phox e p47phox (Figura 3 (c, d)). Não houve alteração na expressão de p47phox, no entanto, houve um aumento na expressão p22phox em vinte minutos e manteve-se sustentada por 60 minutos.

Nós investigamos ainda mais o aumento da expressão da proteína Nox1 e Nox2 em resposta ao tratamento LPS utilizando RT-PCR para quantificar os níveis de mRNA e Nox1 Nox2 em resposta ao LPS (Figura 3 (e)). Um aumento de seis vezes dramático nos níveis de ARNm Nox1 e um aumento de 5 vezes nos níveis de ARNm Nox2 em comparação com controlos não tratados ocorre em 20 minutos após o tratamento com LPS. Este aumento nos níveis de ARNm é transiente e há uma redução significativa de 40 minutos e 60 minutos após o tratamento com LPS. Estes resultados sugerem que o LPS activa um factor de transcrição, o mais provável de NF-kB, o que aumenta Nox1 e ARNm Nox2 em resposta a LPS. Isso, então, facilita um aumento na expressão Nox1 e Nox2 em 40 minutos, que se manifesta com um aumento significativo nos níveis de ROS endógenos em SW480 células. A fim de verificar esta teoria, nós necessária para provocar o papel de NF-kB em LPS atividade ROS endógena induzida.

LPS induzida ROS é NF-kB dependente

Como há uma ligação estabelecida evidente entre LPS e a activação de NF-kB por meio da via MyD88, nós investigamos se a NF-kB desempenhou um papel na actividade de ROS induzida por LPS. I-kappa B-quinase (IKK) é uma enzima que é necessária para activar o NF-kB. Um inibidor de IKK foi usada para inibir a actividade de NF-kB (Figura 4 (a)). Pré-tratamento com o inibidor de IKK-resultou na abolição completa da actividade ROS induzida por LPS em 40 minutos. IKB-α é uma sub-unidade inibitória de NF-kB. A fosforilação de IKB-α é necessário para a activação de NF-kB. Nesta base observarmos a expressão pIKB-α em resposta ao tratamento LPS. Curiosamente, o nível de pIKB-α é significativamente elevada em 20 minutos após tratamento com LPS (Figura 4 (b)). É provável que a activação de NF-kB em 20 minutos após tratamento com LPS permite a transcrição de ARNm necessário para o aumento da expressão e Nox1 Nox2 visto em 40 minutos.

(a) quantificação de fluorescência DCF utilizando o software CellQuest demonstra um redução significativa da actividade induzida por LPS ROS 40 minutos na presença de inibidor de IKK (40 ug /ml) após tratamento com LPS (1 ug /ml). (B) p-IkB aumento na expressão de 20 minutos após o tratamento com LPS. * P 0,05. Estes dados são representativos de 3 expericias independentes. (C) LPS (1 ug /ml) aumentou a expressão induzida Nox1 em 40 minutos após o tratamento com LPS, no entanto, pré-tratamento com inibidor de IKK durante 1 hora reduziu o nível de expressão a níveis não tratados. (D) LPS Nox2 expressão induzida em 40 minutos, é também reduzido por o inibidor de IKK. * P 0,05. Estes dados são representativos de 3 expericias independentes.

De forma a provar que a activação de NF-kB foi necessária para um aumento na expressão e Nox1 Nox2 a seguir ao tratamento com LPS, um inibidor de NF-kB foi novamente utilizado. a expressão da proteína induzida por LPS Nox1 em 40 minutos, foi reduzida por o inibidor de IKK (Figura 4 (c)). Induzida por LPS a expressão da proteína Nox2 também diminuiu significativamente em 40 minutos, na presença do inibidor de IKK (Figura 4 (d)). Assim, parece que a geração de ROS induzida por LPS é dependente da activação do NF-kB o qual resulta num aumento da expressão Nox1 e Nox2 em SW480.

induzida por LPS DCF fluorescência co-concentra em retículo endoplasmático em células SW480

recentes terapias anti-oxidantes são mais eficazes devido à maior biodisponibilidade e a capacidade de direcionar organelas que geram ROS específicas, tais como as mitocôndrias. Como não houve diminuição nos níveis de ROS com o uso de rotenona, que questionou o compartimento subcelular que foi responsável pela geração de ROS em resposta a LPS. Nós primeira co-coradas células SW480 com DCF e um corante ER rastreador e depois examinou fluorescência usando microscopia multiphoton. DCF exibe um padrão de coloração peri-nuclear distinta em células SW480, em resposta ao tratamento com LPS (Figura 5a). Este padrão é muito semelhante ao que observamos com um corante ER rastreador e co-localises com DCF. Isto sugere que o aumento da ROS a seguir ao tratamento com LPS é gerado no ER. Quando as células SW480 foram tratadas com DPI, este atenua a fluorescência DCF no ER, proporcionando assim mais provas de que a actividade de ROS induzida por LPS está associado com a expressão da enzima Nox. Estas experiências indicam que as ROS gerado em resposta ao LPS localizar ao ER e em conjunto com a evidência recente que mostra que os TLR-4 /MD2 sinais complexos através do ER, demonstram que o ER desempenha um papel central em TLR-4 sinalização

As células foram cultivadas durante 48 horas no fundo de vidro pratos. (A) As células foram tratadas com DCF e um corante ER rastreador durante 1 hora a 37 ° C com LPS (1 ug /ml) 30 minutos antes da imagiologia com um microscópio de varrimento a laser multifotônica. (B) As células foram coradas com MitoTracker vermelho escuro (1 uM) e (10 uM) MitoPY, e tratou-se com Menadiona (8 uM) ou LPS (1 ug /ml) durante 1 hora a 37 ° C. A barra de escala representa 20 um.

A seguir, quis examinar as mitocôndrias como fonte intracelular de LPS induzida ROS. Um estudo anterior por Dickenson et ai demonstraram que a peroxi-amarelo (MitoPY), uma sonda fluorescente, de forma eficaz pode ser utilizado para a imagem H

2O

2 dentro da mitocôndria de células vivas [19]. Aqui, nós co-coradas com MitoTracker MitoPY vermelho escuro e depois tratou-se as células SW480 com Menadiona a 8 uM durante 1 hora a 37 ° C (Figura 5b) [20]. Nós confirmou que MitoPY é direcionado para a mitocôndria e detecta mitocondrial ROS quando as células foram tratadas com Menadione. Nós, em seguida, tratada com LPS células SW480 e observados níveis mínimos de ROS gerado nas mitocôndrias, em comparação com o controlo positivo, onde as células foram tratadas com Menadiona.

TLR-4 induzida ROS regulam vias de transdução de sinal em células metastáticas SW480

regulação das vias de sinalização celular é uma de uma série de efeitos intra-celulares derivadas de TLR-4 sinalização. percursos individuais de sobrevivência, incluindo a via PI3K /Akt, que é conhecida por facilitar a metástase de tumor, pode ser activado por TLR-4 sinalização. As proteínas inibidoras desta via, tais como PTEN, são conhecidos por serem sensíveis redox. Tendo estabelecido que SW480 células geram ROS endógeno a partir do RE de uma forma dependente de NF-kB em resposta à sinalização de TLR-4, que, assim, investigaram se induzida por LPS endógena ROS poderia desempenhar um papel na regulação destas vias sensitivas redox. Vemos um aumento de pAkt em 40 minutos a seguir ao tratamento com LPS, que corresponde com o aumento da actividade de ROS induzida por LPS também visto em 40 minutos (Figura 6 (a)). expressão de pAkt em 40 minutos, é inibida pelo DPI (Figura 6 (b)). Estes resultados demonstram como TLR-4 induzida actividade ROS pode regular vias de sinalização metastáticos, tais como PI3K /Akt.

(a), LPS (1 ug /ml) de tratamento causa um aumento transiente na fosforilação de Akt, máxima a 30- 40 minutos. (B) a expressão de pAkt é aumentada em resposta a tratamento com LPS em 40 minutos e completamente inibida pelo DPI (2 uM). * P 0,05. Estes dados são representativos de 3 experiências independentes.

LPS induzida adesão é facilitado em um Nox

forma dependente

Estudos recentes têm relatado que a LPS pode aumentar as células cancerosas a adesão, um passo essencial para metástases bem sucedida [21]. LPS facilita este através de regulação positiva de proteínas, tais como β1-integrina [22]. A via de sinalização principal responsável é a via PI3K /Akt que temos mostrado para regulada por activação LPS de ROS Nox-derivadas. Assim nós desejamos estabelecer se Nox sinalização aderência celular facilitado LPS câncer de cólon em resposta a LPS. Um aumento significativo na adesão de células SW480 de colagénio que é visto em 1 hora (Figura 7 (a, b)). Este aumento da aderência é inibida pelo DPI e um inibidor de PI3K, LY294002. Isto sugere que o mecanismo responsável é dependente da sinalização de Nox. Tendo mostrado que LPS induz ROS através de um mecanismo Nox, queríamos continuar a investigar qual membro da família Nox foi responsável por este aumento na atividade ROS e adesão de células tumorais. A eficácia do agente de ARNip foi testada utilizando citometria de fluxo. A segunda siARN fornecida a melhor redução e, de facto provocou uma anulação quase completa de ROS induzida por LPS (Figura 7 (c)). Assim, parece Nox1 contribui a maioria das ROS e talvez tem um papel mais funcional do que Nox2 em resposta ao tratamento com LPS. Western Blotting foi usada para confirmar a eficácia da transfecção cada siRNA (Figura 7 (c)).

(a, b) tratamento com LPS, resultou num aumento significativo na adesão celular SW480 ao colagénio I depois de 1 hora. Este foi inibida usando um inibidor reconhecido Nox, DPI (2 uM) e um inibidor de PI3K, LY294002 (5 uM). (C) Nox1 siRNA anula LPS induzida ROS e Nox1 knockdown é confirmada por Western Blotting. (D) O aumento da adesão celular SW480 câncer de cólon foi completamente inibida por Nox1 siRNA. * P 0,05. Estes dados são representativos de 3 expericias independentes.

Nox1 siRNA células tratadas foram então usadas para investigar o papel de Nox1 na adesão de células de cancro do cólon. Curiosamente, uma redução significativa na adesão de células tumorais foi observado nas células Nox1 siRNA a seguir ao tratamento com LPS, indicando que Nox1 derivado ROS são essenciais para a potenciação da adesão de células de cancro do cólon, em resposta ao LPS (Figura 7 (d)).

Discussão

A ligação entre inflamação e promoção de metástase de tumor sistêmica tem sido bem estabelecida [23]. Neste estudo, demonstramos como Nox derivado ROS fornecer um “elo perdido” na compreensão de como a inflamação ativa as vias de sinalização responsáveis ​​pela recorrência de tumores e metástases. Este estudo demonstra que LPS regula PI3K /Akt sinalização de via ROS Nox derivado em células de câncer de cólon. mecanismo redox Consequentemente, esta activados com LPS é responsável por promover a adesão do tumor, potencializando o risco de metástase bem sucedido.

inflamação cirúrgico potencializa a metástase das células tumorais através de PI3K sinalização /Akt. Estudos anteriores têm demonstrado um aumento significativo nas metástases após cirurgia pulmonar e este efeito é inibido por um inibidor de PI3K [24]. Da mesma forma, Hsu et ai demonstraram recentemente que a adesão de células de tumor é dependente de sinalização de PI3K em resposta a LPS [11]. Com efeito, o LPS foi mostrado para activar directamente PI3K /Akt sinalização, no entanto, os nossos resultados mostram, ROS-Nox derivado desempenhar um papel importante na regulação redox desta via [25] – [26]. Curiosamente, estudos anteriores mostraram que as ROS Nox-derivados são activados a jusante de PI3K /Akt sinalização [27].