Sumário

Os líquenes são organismos simbiontes que produzem produtos metabólicos secundários distintos. No presente estudo, foi testada a actividade citotóxica de 17 espécies de líquenes contra várias células de cancro humano e ainda mais investigados os mecanismos moleculares subjacentes à sua actividade anti-cancro. Descobrimos que entre 17 espécies de líquenes,

F. cucullata

exibiu citotoxicidade a mais potente em várias células cancerosas humanas. A análise por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o extracto de acetona de

F. cucullata

contém ácido úsnico, ácido salazinic, ácido Squamatic, ácido Baeomycesic, ácido d-protolichesterinic e ácido lichesterinic como subcomponentes. ensaio MTT mostrou que as linhas celulares de cancro eram mais vulneráveis ​​aos efeitos citotóxicos do extracto de linhas de células não-cancerosas. Além disso, entre os subcomponentes identificados, tratamento ácido úsnico teve um efeito citotóxico semelhante em linhas celulares de cancro, mas com potência mais baixa do que o extracto. A uma dose letal, o tratamento com o extracto ou com ácido úsnico aumentou muito a população de células apoptóticas e especificamente activada a via de sinalização de apoptose; no entanto, o uso de doses sub-letais, extrair e tratamento com ácido úsnico diminuição da motilidade de células cancerosas e inibidas

em

vitro

e

em

vivo

potenciais tumorigênicos . Nestas células, observou-se níveis significativamente reduzidos de transição epitelial-mesenquimal (EMT) e marcadores de fósforo-Akt, enquanto que os níveis de fósforo-c-Jun e fósforo-ERK1 /2 foram apenas marginalmente afectados. No geral, a actividade anti-cancro do extracto é mais potente do que a de ácido úsnico sozinho. Tomados em conjunto,

F. cucullata

e seu subcomponente, ácido úsnico em conjunto com o componente adicional, exercem efeitos anti-câncer em células cancerosas humanas através da indução de apoptose e inibição da EMT

Citation:. Nguyen TT, Yoon S, Yang Y, Lee HB, Oh S, Jeong MH, et al. (2014) Lichen metabólitos secundários em

Flavocetraria cucullata

para exposições anti-câncer efeitos sobre as células cancerosas humanas através da indução de apoptose e Repressão da tumorigenos potenciais. PLoS ONE 9 (10): e111575. doi: 10.1371 /journal.pone.0111575

editor: Chengfeng Yang, Michigan State University, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Julho, 2014; Aceito: 26 de setembro de 2014; Publicação: 31 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Nguyen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609) e pela Coreia do Programa Nacional de Recursos Centro de Pesquisa (NRF-2012M3A9B8021726). Este estudo também recebeu apoio de uma bolsa de investigação financiado pelo Centro de Pesquisa Sunchon de Medicina Natural. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro é uma das principais causas de morte no mundo. Como um grupo, os cânceres são responsáveis ​​por aproximadamente 13% de todas as mortes a cada ano com o câncer ser mais comum do pulmão (1,37 milhão de mortes), câncer de estômago (736,000 mortes), cancro do fígado (695.000 mortes), o câncer colorretal (608.000 mortes), e câncer de mama (458.000 mortes) [1]. cancro invasivo é a principal causa de morte no mundo desenvolvido e a segunda principal causa de morte no mundo em desenvolvimento [2], de modo que, por estas razões, várias terapias de cancro têm sido desenvolvidos, incluindo uma ampla gama de agentes anti-cancro com o conhecido efeitos citotóxicos em células cancerosas.

Os líquenes são organismos simbióticos, geralmente compostas por um parceiro de fungos (micobionte) e um ou mais parceiros fotossintéticos (photobiont), que é na maioria das vezes, quer uma alga verde ou uma cianobactéria [3] . Embora a natureza dual da maioria dos líquenes é agora amplamente reconhecida, é menos conhecido que alguns líquenes são simbioses envolvendo três (líquenes tripartidos) ou mais sócios. Em geral, existem líquenes como talos discreto e são tratados implicitamente como indivíduos em muitos estudos, mesmo que eles podem ser uma entidade simbiótica envolvendo espécies a partir de três reinos. De uma perspectiva genética e evolucionária, líquenes não pode ser considerada como indivíduos, mas sim como compósitos, e isso tem implicações importantes para muitas áreas de investigação como o desenvolvimento e reprodução.

Muitos líquen produtos secundários são desagradáveis ​​e podem servir como compostos de defesa contra herbívoros, bem como decompositores. Por este motivo, estes produtos secundários são frequentemente utilizados pela indústria farmacêutica como compostos antibacterianos e antivirais [4], [5]. Além disso, líquenes e seus metabólitos secundários de longa têm sido estudados para a terapia anti-cancro [6] – [15]. No presente estudo, foi testada a atividade citotóxica de 17 espécies de líquenes recolhidos das montanhas romeno Cárpatos contra várias células de câncer humano e investigou os mecanismos moleculares subjacentes à sua actividade anti-câncer para identificar compostos potenciais para agentes anti-câncer inovadoras.

Materiais e Métodos

Preparação de extractos de líquen

Talos de

F. cucullata

foram coletadas da Roménia em 2011, durante a viagem de campo no Parque Calimani Nacional e do Parque Natural Bucegi organizado pelo Dr. Crişan na Universidade Babeş-Bolyai, Cluj-Napoca, Roménia. A autorização para recolher amostras de liquens a partir desses locais foi emitido pela Administração do Parque Calimani Nacional e da Administração do Parque Natural Bucegi, com a aprovação da Comissão para a Protecção dos Monumentos Naturais (Romanian Academy). Os estudos de campo não envolve quaisquer espécies ameaçadas ou protegidas. As duplicatas foram depositados no Instituto Coreano Lichen Research (KoLRI), Universidade Nacional Sunchon, na Coréia. Finamente seca talos chão do líquen (150 g) foram extraídos usando acetona num extractor de Soxhlet. Os extractos foram filtrados e, em seguida, concentrada sob pressão reduzida num evaporador rotativo. Os extractos secos foram armazenados a -25 ° C até à sua utilização. Os extractos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) para todas as experiências.

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) análise de materiais líquen

líquen extractos secos foram novamente dissolvido em 2 ml de acetona e, em seguida, submetidos a HPLC (Shimadzu, LC-20A). análises de HPLC foram realizadas em coluna YMC-Pack ODS-A (150 x 3,9 milímetros I.D.) de fase reversa em coluna C18 de material de revestimento numa posição terminal totalmente (tamanho de partícula, de 5 um, tamanho de poro, 12 nm). A eluição foi realizada a um caudal de 1 mL /min sob as condições seguintes: temperatura da coluna, 40 ° C; sistema de solventes, metanol: ácido fosfórico (80:20:1, v /v /v) antes da injecção subsequente: água. A análise foi monitorizada por um detector de arranjo de diodos (SPD-M20A) com uma gama de 190-800 nm, durante todo o prazo de HPLC. picos observados foram verificados entre 190 e 400 nm. O volume de injecção da amostra foi de 10 ul. Os padrões utilizados foram obtidos a partir das seguintes fontes: ácido salazinic (t

R = 2,27 ± 0,2 min) isoladas de líquen

Lobaria pulmonaria, ácido úsnico

(t

R = 11,3 ± 0,3 min) de

Usnea longissima

e ácido protolichesterinic (t

R = 22,3 ± 0,2 min) e ácido lichesterinic (t

R = 26,5 ± 0,2 min) a partir de líquen

Cetraria islandica

.

cultura celular

O linhas celulares de cancro humano HT29 (cancro do cólon), a AGS (câncer gástrico), A549 (cancro do pulmão) e CWR22Rv-1 (cancro da próstata) foram mantidas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gen Depot, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gen Depot, EUA) e 1% de penicilina e estreptomicina (meio RPMI completo) (Gen Depot, EUA). células HaCaT (queratinócitos humanos), NIH 3T3 (rato células de fibroblastos embrionários), HEK293T (rim embrionário humano), RIE (rat intestinal epithelial) células, e Madin-Darby células (MDCK) de rim de canino foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM ) (Gen Depot, EUA) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina e estreptomicina. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 numa atmosfera humidificada a 37 ° C. As linhas celulares foram adquiridos a partir da linha celular coreana Bank (https://cellbank.snu.ac.kr), Coreia.

MTT

extratos Lichen foram dissolvidos em DMSO (Sigma-Aldrich , St. Louis, EUA) e diluídos em série com meio DMEM ou RPMI 1640 para se obter concentrações de 6,125, 12,5, 25, 50, 100 ug /mL. As células (2 x 10

4 células /cavidade) foram semeadas numa placa de 96 poços, cultivadas durante a noite, e, em seguida, tratado com o extracto de acetona ou principais compostos de

F. cucullata

em concentrações de 100 ug /mL ou uM a 10 ug /mL ou uM durante 48 horas. Uma vez que o tratamento foi completado, as culturas foram suplementadas com MTT. Após a incubação com MTT a 37 ° C, as células foram lisadas com tampão de lise contendo 50% de DMSO e 20% de SDS, e foi medida a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de microplacas (VERSAmax, Molecular Devices, Minnesota, USA). A percentagem de células viáveis ​​foi calculada utilizando a seguinte fórmula: viabilidade celular percentual = (densidade óptica (DO) das amostras experimentais /OD do controlo) × 100. IC

50 valores foram calculados utilizando o Statistical Package for Social Science (SPSS).

A microscopia de fluorescência da morfologia apoptótica

As células foram cultivadas em lâminas de câmara a uma densidade de 4 × 10

5 células /poço e deixadas a ligar durante a noite, seguido de tratamento com o

F. cucullata

extracto de acetona ou ácido úsnico, durante 24 horas ou 48 horas. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas com solução de etiquetagem Anexina V FITC durante 15 min. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em PBS e analisadas usando uma Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japão) microscópio fluorescente.

As células foram cultivadas tal como descrito acima. Depois de 24 horas ou 48 horas de tratamento com o

F. cucullata

extracto de acetona ou ácido úsnico, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas em paraformaldeído a 4%, à temperatura ambiente, em seguida, incubadas em 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) durante 30 min . Subsequentemente, as amostras foram coradas com Hoechst 33257 (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) à temperatura ambiente após a lavagem três vezes em solução fixadora em PBS. As células foram lavadas duas vezes em PBS e montadas numa lâmina de vidro. As lâminas foram analisadas usando uma Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japão) e microscópio de fluorescência avaliada como a percentagem de células com núcleos fragmentados ou condensados ​​a partir de um número total de 300 células.

citometria de fluxo ensaio para ciclo celular

Depois de 24 horas de incubação, Extrato não tratada e acetona ou úsnico MDCK tratadas com ácido, HEK293T, HT29, AGS, A549 e células CWR22Rv-1 foram tratadas com tripsina. Em seguida, foi adicionado um inibidor de ARNase e incubaram-se durante 15 min à temperatura ambiente. Finalmente, as amostras foram centrifugadas para remover o sobrenadante, e células de pelotas foram diluídos em 100 ul de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e incubou-se durante mais 30 min a 4 ° C. A citometria de fluxo foi realizada com um FACS Caliber (BD Biosciences, San Diego, EUA).

-cicatrização de feridas ensaio

AGS e células A549 foram semeadas a uma densidade de 2,5 × 10

5 células /poço em placas de 6 poços de cultura de tecidos (Corning, Nova Iorque, EUA) e cultivadas durante a noite até à confluência. células em monocamada foram riscados com uma ponta de pipeta para criar uma ferida. As células foram então lavadas duas vezes com RPMI 1640 sem soro para remover as células flutuantes e incubadas em meio com 5 ug /ml de o

F. cucullata

extrair ou 10 mM de ácido úsnico. De fotografias de células foram retiradas aos 0, 24, 48, e 72 horas após o ferimento para medir a largura da ferida. A distância migrada pelas células foi calculada como a diferença entre os bordos da ferida em um ponto de tempo e no ponto de tempo 2. Para cada linha celular, uma média de oito ensaios de ferida foi feita para determinar a taxa média de migração em um dado concentração do extracto de acetona ou ácido úsnico. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

ensaio de invasão

a invasão de células de tumor foi analisada utilizando uma câmara de Transwell (Corning Coster, Corning, NY, EUA) com um ensaio de 8 um topchamber pore- membrana de policarbonato de tamanho revestidos com gelatina a 1%. AGS e células A549 foram plaqueadas a 2,5 x 10

5 células /poço em meio de cultura contendo 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) no compartimento superior da câmara. O compartimento inferior foi preenchida com o meio de cultura contendo 0,2% de BSA e 1 ug /mL de fibronectina como um quimio-atractor. As células foram cultivadas na ausência ou na presença de 5 ug /mL de extracto de acetona ou ácido úsnico 10 uM durante 24 horas. As câmaras superiores foram fixadas e coradas com Diff kit rápida (Sysmex, Kobe, Japão). As células invadidas foram analisados ​​em microscópio de luz em cinco campos selecionados aleatoriamente. Cada experiência foi realizada em triplicado. Os resultados são expressos como o número médio de células que migram por campo de alta potência.

clonogénicas ensaio

células A549 e AGS foram lavadas, tratadas com tripsina, e ressuspensas em meio RPMI 1640. As células (500 células /poço) foram semeadas em placas de 6 poços em 2,5 ml de RPMI 1640 por poço e foram incubadas durante anexo. Subsequente ao tratamento de 48 horas, o meio contendo extracto de acetona ou ácido úsnico foi substituído com meio fresco durante 12 dias. Colónias foram fixadas em paraformaldeído a 4%, coradas com 0,5% de violeta de cristal e contadas sob um microscópio estereoscópico. A eficiência de plaqueamento (PE) de células não tratadas e a fracção de sobrevivência (SF) de células tratadas foram então determinados (n = 3) [16].

colónias de agar mole formação ensaio

AGS (1 × 10

4) e A549 (1 × 10

4) As células foram suspensas em 1,5 ml de agar mole (0,35% de agarose em meio RPMI completo), plaqueadas em 1,5 mL de agar solidificado (0,6% de agarose em meio RPMI completo) em placas de 6 poços e foram cultivadas durante 3 semanas. As células foram alimentadas duas vezes por semana com meio de cultura de células contendo o extracto de acetona ácido (1 ug /ml ou 5 ug /mL), úsnico (5 ^ M ou 10 uM), ácido lichesterinic (10 uM), ou DMSO (0,01%) . de intensidade de pixel de área colónia foi medida pelo software iSolution IMT (IMT-I Solução Inc., Northampton, NJ, EUA), em campos microscópicos escolhidos ao acaso em cada placa. Para medir a área percentual de colônia, quantidade de pixels da área colónia foram normalizados para pixels × quadrado pixel. Os dados representam a média de três experiências.

A detecção de proteínas em células lisados ​​

As células tratadas com várias concentrações do extracto de acetona ou subcomponentes durante 48 h foram colhidos e analisados ​​por Western blot como descrito anteriormente [17]. Os anticorpos utilizados foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (PARP, caspase-3, Bax, Bcl_xL, α-tubulina), e BD Biosciences (E-caderina). Todos os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. Para analisar o grau de fosfoproteínas, ensaio multiplex baseadas em esferas (ensaio fosfoproteína Bio-Plex, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante [18], [19]. Resumidamente, este ensaio mediu sinais múltiplos de uma única fosfoproteína lisado [20].

qRT-PCR análise

O ARN total (1 ug) de cada grupo de células tratadas foi convertido em cDNA usando um M-MLV kit da transcriptase reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e SYBR verde (Enzynomics, Seoul, Coreia do Sul). Os iniciadores utilizados para PCR em tempo real foram E-caderina (directo) 5′-cagaaagttttccaccaaag-3 ‘e (inverso) 5′-aaatgtgagcaattctgctt-3′; N-caderina (directo) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ‘e (inverso) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; Snail (directo) 5’-gaggcggtggcagactag-3 ‘e (inverso) 5′-gacacatcggtcagaccag-3′; Torção (directo) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ‘e (inverso) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; GAPDH (para a frente) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ‘e (reverso) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. reação e análise de qRT-PCR foram realizadas utilizando CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

In vivo tumorigenicidade ensaio

O protocolo experimental foi aprovado pelo Chonnam National University Medical School Pesquisa Institucional Care Use Comitê. Manutenção dos animais e todas as experiências in vivo foram realizadas de acordo com os Princípios Orientadores do Cuidado e Uso de Animais (publicação DHEW, NIH 80-23). As células A549 foram preparadas em meio RPMI 1640 (1 × 10

6 células /rato) e as células em suspensão foram pré-tratados com um décimo da concentração letal de

F. cucullata

extracto de acetona, ácido úsnico, ácido lichesterinic, ou DMSO (Veículo) imediatamente antes da injecção. As células foram injectadas subcutaneamente na região do flanco de ratinhos Balb /c nu rato e do tumor foi medido depois de duas semanas.

A análise estatística

Todas as experiências foram analisadas em triplicado (n = 3). Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 17. Os efeitos do tratamento foram determinadas usando ANOVA one-way análise post-hoc. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo salvo indicação em contrário

Resultados

Flavocetraria cucullata

extracto de acetona tem efeitos citotóxicos potentes sobre as células cancerosas

Para. identificar a substância citotóxica de líquenes romenos, medimos a IC

50 valores de extractos de acetona de 17 espécies de líquenes no HT29 (células de câncer colorretal) e AGS (células de câncer gástrico) células. Entre as espécies de líquenes,

F. cucullata

exercida os efeitos citotóxicos mais potentes em ambos HT29 (IC

50 = 10,9 ug /mL) e a AGS (IC

50 = 11,6 ug /ml) em comparação com outras espécies de líquenes (IC

50 valores variaram em torno de 25-100 mg /mL, Tabela S1 no arquivo S1). Para verificar se a citotoxicidade do

F. cucullata

extracto foi específica para as células cancerosas, conduzimos testes adicionais sobre as células cancerosas adicionais, tais como células A549 (células de cancro de pulmão) e CWR22Rv-1 (células de cancro da próstata) e de células não-cancerosas, incluindo células MDCK (rim canino de Madin-Darby ) e RIE (células epiteliais de intestino de rato), NIH 3T3 (fibroblastos de ratinho embrionário), HaCaT () células de queratinócitos humanos. Os resultados mostraram que o

F. cucullata

extracto de acetona afectada especificamente a viabilidade de células cancerosas enquanto as células não cancerosas não foram gravemente danificadas (Fig. 1A).

(A) percentagem de viabilidade das células tratadas com o extracto de acetona de

F.

cucullata. As células foram tratadas com o

F. cucullata

extrair numa concentração na gama 10-50 ug /ml durante 48 h, e a viabilidade celular foi medida através de um ensaio MTT. (B) de desempenho cromatogramas alto cromatografia líquida do

F. cucullata

extrato. A identidade de cada subcomponente é observado no pico correspondente. (C-D) A percentagem de viabilidade das células tratadas com ácido úsnico (C) ou ácido lichesterinic (D). As células foram tratadas com o subcomponente indicado de

F.

cucullata numa concentração que varia 12,5-50 ^ M durante 48 h, e a viabilidade celular foi medida através de um ensaio MTT. Os dados representam a média ± S.E.M. (Erro padrão da média), n = 3.

Para identificar os subcomponentes do

F. cucullata

, por HPLC foi realizada no extracto de acetona de

F. cucullata

; os cromatogramas resultantes e análise de espectrometria de massa de cada pico são apresentadas na Figura 1B e Tabela S2 em S1 Ficheiro. Como mostrado na Figura 1B, ácido salazinic (Tr = 2,268 min), ácido squamatic (Tr = 2,855), ácido baeomycesic (Tr = 4,646), ácido úsnico (Tr = 11,327), d-protolichesterinic ácido (Tr = 22,315), e ácido lichesterinic (Tr = 26,595) foram detectados no extrato de acetona de

F.

cucullata. Entre os subcomponentes, ácido úsnico teve o pico mais alto (intensidade% = 91,49 ± 0,0025), enquanto que o ácido d-protolichesterinic e ácido lichesterinic apresentou picos mais baixos (% intensidade = 2,27 ± 0,1, 2,22 ± 0,1, respectivamente) (Tabela S2 no arquivo S1 ). Depois de identificar os subcomponentes líquen, dois metabolitos principais, ácido úsnico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e ácido lichesterinic (isolado a partir de

F. Cucullata extracto

que partilham a sua estrutura química com ácido d-protolichesterinic excepto uma ligação carbono insaturado) foram utilizadas para outras experiências. Para determinar qual o subcomponente foi responsável pela citotoxicidade de líquen, medimos a citotoxicidade de ácido úsnico e ácido lichesterinic e descobriram que o ácido úsnico mostrou efeitos citotóxicos semelhantes em células não-cancerosas e cancerosas, ácido lichesterinic exibiu nenhum efeito citotóxico aparente em qualquer um dos células testadas (Fig. 1C e 1D). Na Tabela S3 no ficheiro S1, o IC

50 valores de extracto de acetona, ácido úsnico, e ácido lichesterinic em várias células são apresentados. Curiosamente, dado o peso molecular (PM = 344) e intensidade% de ácido úsnico no extracto de acetona de

F. cucullata

, IC

50 valores de ácido úsnico em HEK293T, HT29, A549 e as células foram provavelmente mais elevados do que aqueles da concentração de ácido úsnico calculado no extracto. Estes resultados sugerem que os subcomponentes não identificados do

F. cucullata

extrair provável potenciar a citotoxicidade de ácido úsnico. No entanto, é importante notar que IC

50 valores de ácido úsnico, especialmente em células não cancerosas, tais como MDCK, RIE, NIH 3T3, e as células HaCaT, eram muito mais baixos do que os de concentração de ácido úsnico em

F. cucullata

extracto, sugerindo que pode haver um mecanismo resistente subjacente à citotoxicidade de ácido úsnico em células ou que outra sub-componente (s) pode reduzir a citotoxicidade de ácido úsnico para as células. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o extracto de acetona de

F. cucullata

tem citotoxicidade seletiva para células cancerosas e que o ácido úsnico pode agir como um grande efetoras destes efeitos.

As concentrações letais

de Flavocetraria cucullata

e ácido úsnico induzir a apoptose das células cancerosas

Para determinar se a citotoxicidade de

F. cucullata

e ácido úsnico era devida à indução de apoptose, as células tratadas com uma concentração letal de

F. cucullata

foi observado (50 ug /mL) ou ácido úsnico (100 uM) foram corados com Hoechst 33258 e a sua morfologia nuclear. Como mostrado na Figura 2A, a morfologia nuclear de condensado foi observada em células tratadas com AGS

F. cucullata

extrair ou ácido úsnico. Na Figura 2B, quantificações do número de células em várias linhas de células são mostradas. Curiosamente, a indução de condensação nuclear foi significativamente aumentado nas células cancerosas tratadas mas não foi observado na linha celular não cancerosa MDCK, sugerindo que

F. cucullata

e ácido úsnico são selectivamente citotóxicos para células de cancro através da indução de apoptose.

(A) coloração Hoechst 33258 de AGS (linha celular de cancro gástrico humano) as células tratadas com o

F. cucullata

extrair ou de seus subcomponentes, ácido úsnico e ácido lichesterinic. As setas indicam células que apresentam morfologia nuclear condensados ​​ou fragmentados. Imagens representativas são mostradas a partir de três experiências independentes. (B) Análise quantificacional da morfologia nuclear condensado ou fragmentado em várias células tratadas com

F. cucullata

extrair ou de seus subcomponentes. Os dados representam ± médios S.E.M. (Erro padrão da média), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, não houve diferença significativa em comparação com o grupo tratado com dimetilsulfóxido.

Para confirmar isto, as células coradas com FITC-anexina V para detectar a exposição de fosfatidilserina na membrana plasmática externa, o que é uma característica encontrar em células que sofrem apoptose. Como mostrado na Figura 3A, as células cancerosas tratadas com

F. cucullata

extrair ou ácido úsnico mostrou FITC positividade. Para determinar a percentagem de células apoptóticas, análise de citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio foi efectuada. Como mostrado nas Figuras 3B e 3C, a população de células em fase G1 sub aumentada após 24 horas de tratamento em células cancerosas. Esta análise de quantificação revelou que a indução de apoptose pela

F. cucullata

extracto foi dependente da dose, excepto em células MDCK, com aumentos significativos observados em AGS, HT29, A549 e células (Fig. 3B). No entanto, como mostrado na Figura 3C, a eficácia do ácido úsnico no aumento do número de células apoptóticas foi significativamente menor do que a do

F. cucullata

extrato. Estes achados sugerem novamente que subcomponente não identificado (s) de

F. cucullata

pode potenciar os efeitos do ácido úsnico embora o ácido úsnico desempenha um papel importante na indução de apoptose em várias células de cancro.

(A), FITC-anexina V a coloração de células tratadas com o

F. cucullata

extrair ou ácido úsnico. As setas indicam células que apresentam positividade FITC. (B-C) citometria de fluxo e distribuição do ciclo celular após o

F. cucullata

extrair (B) ou tratamento com ácido úsnico (C) e uma representação gráfica dos resultados. Imagens representativas ou resultados são mostrados a partir de três experimentos independentes.

Para confirmar ainda mais as mudanças no nível de proteínas apoptóticos, foi realizada a análise western blot para poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), caspase 3, Bax e Bcl-xL. Como se mostra nas Figuras 4A e 4D, e extracto de tratamento ácido úsnico aumentou os níveis de PARP clivada e caspase-3 clivada em CWR22Rv-1, AGS, HT29, A549 e células. Além disso, o nível de proteína pro-apoptótica, Bax, foi significativamente aumentada nestas células tratadas, mas não em células MDCK e células HEK293T (Figs. 4B e 4E). Por outro lado, o nível da proteína anti-apoptótica, Bcl-xL, foi significativamente reduzida apenas em células de cancro tratadas (Figs. 4C e 4F). Consistentemente,

F. cucullata

foi mais eficaz na indução de apoptose do que o ácido úsnico e foi mais eficaz em células cancerosas do que células não-câncer. Tomados em conjunto, os resultados demonstram que as concentrações letais de o extracto de acetona de

F. cucullata

e o subcomponente de ácido úsnico induzir a apoptose das células cancerosas.

(A e D) Análise de transferência de Western de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e caspase-3 nas células tratadas com o

F. cucullata

(A) ou ácido úsnico (D). As setas indicam os fragmentos clivados de cada proteína. (B-C e E-F) Análise quantificacional de Bax (B e E) e Bcl-xL (C e F), os níveis de expressão de proteína em células tratadas com o ácido ou cucullata F. úsnico, respectivamente. Os dados representam ± médios S.E.M. (Erro padrão da média). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, não houve diferença significativa em comparação com o grupo tratado com dimetilsulfóxido.

concentrações sub-letais de

Flavocetraria cucullata

e ácido úsnico inibir a tumorigenicidade e motilidade das células cancerosas

Para explorar ainda mais a atividade anti-câncer do

F. cucullata

extrair e ácido úsnico, foi utilizado um décimo das concentrações letais destes compostos que não mostram a citotoxicidade (concentração sub-letais) e testou o

em

vitro

tumorigenicidade e motilidade de células A549 e AGS. Um ensaio clonogénico destas células em concentrações sub-letal de extracto (5 ug /mL) ou ácido úsnico (10