Abstract

MAb 4C5 é um anticorpo da célula impermeável, anti-HSP90 monoclonal murino, originalmente produzido usando tecnologia de hibridoma. Nós mostramos anteriormente que o mAb 4C5 reconhece especificamente tanto o α- e, em menor medida, a β-isoforma de HSP90. Além disso,

In vitro

e

In vivo

estudos revelaram que por inibir selectivamente a função de HSP90 de superfície celular, o mAb 4C5 prejudica significativamente a invasão de células cancerosas e metástases. Aqui nós descrevemos a reconstituição de mAb 4C5 em uma quimera ratinho-humano. Mais importante que relatam que mAb 4C5 e, consequentemente, o seu homólogo quimérico são completamente desprovidos de cadeia pesada e consistem apenas de uma cadeia de dímero leve kappa funcional. O anticorpo quimérico é mostrado para reter propriedades de especificidade e funcionais do anticorpo original. Assim, é capaz de inibir a função de superfície de HSP90, com prejuízo para a invasão de células de cancro

In vitro

. Por fim, apresentamos

in vivo

evidências mostrando que a 4C5 quimérico inibe significativamente a formação de depósitos metastático de células MDA-MB-453 para os pulmões de ratos SCID. Estes dados sugerem que um anticorpo kappa de cadeia leve quimérica pode ser potencialmente usada como um agente anti-câncer, introduzindo assim um novo tipo de fragmento de anticorpo, com reduzidas possíveis efeitos imunogénicos adversos, na terapêutica do câncer

Citation:. Sidera K, El Hamidieh A, Mamalaki A, Patsavoudi E (2011) O 4C5 Cell-impermeável Anti-HSP90 anticorpo com Anti Cancer-Activity, é composto de uma cadeia leve Individual Dimer. PLoS ONE 6 (9): e23906. doi: 10.1371 /journal.pone.0023906

Autor: Paul C. Driscoll, do Instituto Nacional de MRC para a Investigação Médica, Reino Unido

Recebido: 11 de maio de 2011; Aceito: 28 de julho de 2011; Publicação: 01 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sidera et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteína de choque térmico 90 (HSP90) é considerado um muito atraente droga-alvo para terapia de câncer, uma vez que a maioria das suas proteínas clientes desempenham papéis fundamentais na aquisição e /ou manutenção do fenótipo maligno [1] – [4]. Recentemente, nós e outros identificaram um conjunto de HSP90 na superfície da célula [5] – [8], em que foi demonstrado que participam na invasão de células de cancro e metástase [9] – [11]. Cada vez mais provas continua a reforçar a noção de um fenômeno amplo de chaperoning HSP90 extracelular, implicados na progressão do câncer e metástase [12] – [16], assim, apoiar o desenvolvimento de inibidores que visam especificamente a superfície da célula HSP90. MAb 4C5 é um anticorpo monoclonal de murino célula impermeável produzidos utilizando tecnologia de hibridoma [17], que reconhece especificamente tanto o α e em menor medida a isoforma β de HSP90 [8]. MAb 4C5 foi inicialmente demonstrado inibir os processos de migração de células

in vitro

durante o desenvolvimento do sistema nervoso [18], [19], afetando actina do citoesqueleto re-arranjo e formação de estruturas motilidade tais como lamellipodia [8], [20]. Posteriormente foram apresentadas evidências que mostra que, ao ligar-se selectivamente para a superfície da piscina de HSP90, o mAb 4C5 reduz significativamente a invasão de células de melanoma e metástase [11]. Além disso, o mAb 4C5 foi demonstrado inibir a interacção entre HSP90 extracelular e o receptor do factor de crescimento de erbB-2 em células MDA-MB-453 células cancerígenas da mama, levando a sinalização a jusante auditivos e reduzida motilidade celular e invasão do cancro [21]. Finalmente, o mAb 4C5 foi demonstrado inibir uma interacção funcional entre HSP90 segregada e as formas inactivas de metaloproteinases 2 e 9, necessárias para a activação das enzimas, que é essencial para a invasão de células de cancro e extravasamento de [14]. Estes dados combinados sugeriram que a capacidade única de mAb 4C5 para inibir especificamente a piscina extracelular de HSP90 sem afectar a grande variedade de importantes papéis intracelular deste chaperona poderiam ter benefícios clínicos no tratamento de malignidades humanas. No entanto, os mAbs murinos não constituem agentes terapêuticos ideais, uma vez que a sua imunogenicidade potencial representa uma limitação à sua utilização clínica. A aplicação de mAbs de ratinho para terapia em seres humanos tornou-se viável pelo advento das tecnologias de DNA recombinante, o que levou ao desenvolvimento de anticorpos quiméricos e humanizados, que exibem uma reduzida imunogenicidade [22], sem uma perda significativa da afinidade, especialmente no caso de quimérico anticorpos [23], [24].

no presente trabalho, descrevemos a clonagem e sequenciação do mAb 4C5 genes a partir da linha celular de hibridoma de origem e a construção bem sucedida de uma quimera ratinho-humano funcional, que é mostrada a conservar as propriedades do anticorpo parental. Mais importante ainda, relatam que o mAb 4C5 é completamente desprovido de pesada (H) e cadeia consiste em apenas um dímero de imunoglobulina de cadeia leve kapa funcional e suas propriedades pode ser recapitulado em uma proteína recombinante que contém apenas este leve (L) cadeia polipeptídica. Por fim, demonstrar o potencial eficácia terapêutica deste novo tipo de fragmento de anticorpo.

Resultados

MAb 4C5 é um fragmento de anticorpo completamente desprovido de uma cadeia pesada

A mobilidade eletroforética de mAb 4C5 estudado sob condições redutoras e não redutoras de SDS-PAGE revelou que não é uma molécula de IgG convencional. Mais especificamente, quando purificado mAb 4C5 foi sujeito a SDS-PAGE redutora, seguida de imunotransferência com um anti-Fab, não observamos o típico de 25 kDa e 50 kDa correspondentes à cadeia-H L- e, respectivamente, de um convencional anticorpo IgG, mas em vez de uma única banda a aproximadamente 25 kDa (Fig. 1A). Curiosamente uma banda de 25 kDa idêntico foi obtido após imunotransferência com um anticorpo anti-Kappa cadeia-L (Fig. 1A). Assim, após electroforese não redutor imunotransferência com ambos estes anticorpos padrão, mostra o mAb 4C5 a ser significativamente menor do que uma molécula de IgG1 convencional, uma vez que migrou a aproximadamente 50 kDa. (Fig. 1A). Finalmente, nenhuma imunorreactividade foi detectada após a electroforese de mAb 4C5, tanto sob condições redutoras e, seguido de imunotransf erência utilizando um anti-Fcy (Fig. 1A) não redutora. Estes dados combinados indicaram que o mAb 4C5 pode ou não possuem uma parte da sua cadeia-H, ou que é completamente desprovido de cadeia-H. A fim de explorar ainda mais estas possibilidades que próxima realizada análise de transferência de Northern utilizando uma sonda da cadeia H de IgG1. ARN derivado a partir de células de hibridoma que produzem uma imunoglobulina IgG1 intacta denominado 2D10 serviu como controlo positivo. Em contraste com o controlo positivo, nenhuma radioactividade foi detectado após hibridação dos ARNs derivados de o mAb 4C5 hibridoma e as células de mieloma NSO (controlo negativo) (Fig. 1B), indicando que o mAb 4C5 pode faltar completamente um gene da cadeia H. Isto foi ainda confirmado por experiências de amplificação da cadeia H de PCR. Para a amplificação do ADNc da cadeia H do mAb 4C5, um painel de oito primers universais de ratinho e um poliA + iniciador, respectivamente, dirigidos contra o 5’and extremidades 3 ‘do ARNm, foram testados em várias reacções de PCR separadas. Em todas as condições testadas sem amplificação de um produto específico da cadeia H foi observada (dados não mostrados). Estes dados combinados sugeriram que o mAb 4C5 é desprovido de cadeia H e que, por conseguinte, procedeu-se à expressão recombinante do anticorpo sozinho cadeia-L, a fim de explorar as suas propriedades.

. A análise electroforética do mAb 4C5, seguida de imunotransferência com um anti-cadeia kappa de rato, um fragmento Fab anti-ratinho e um anticorpo anti-Fcy. Intacta de imunoglobulina IgG1 produzidos pelas células de hibridoma 2D10 serve como controlo positivo. Sob a redução de electroforese seguido por Western blot com o anticorpo anti-Fab, uma única banda de 25 kDa imunorreativa é observada, em vez dos 25- e 50-kDa bandas correspondentes à cadeia-H L- e, respectivamente, de uma IgG1 intacta . Esta banda de 25 kDa é idêntico com a banda correspondente ao kapa da cadeia L, como mostrado por Western blot com o anticorpo de cadeia kapa anti-rato. Sob non-electroforese de redução seguido por Western blot com ambos os anti-kapa e os anticorpos anti-Fab, o mAb 4C5 é mostrada a migrar a aproximadamente 50 kDa, e não a 150 kDa, tal como esperado para uma molécula de IgG1 intacta. Nenhuma mAb 4C5 imunorreactividade é detectado após electroforese sob condições redutoras e tanto seguido por Western blot com um anticorpo anti-Fcy não redutoras. No caso da imunoglobulina IgG1 sob as mesmas condições de 50 kDa e uma banda de 150 kDa é observado, respectivamente. B. Sem radioactividade é detectada após análise de transferência de Northern de 4C5 RNA derivado do hibridoma com uma sonda marcada radioactivamente da cadeia H. ARN derivado das células de hibridoma 2D10-IgG1 e produzir as células de mieloma NSO serviu como controlo positivo e negativo, respectivamente.

Construção de anticorpo quimérico de cadeia L-

A amplificação inicial do gene da cadeia kapa de mAb 4C5 a partir do primeiro molde de ADNc de cadeia foi efectuada utilizando iniciadores de rato de cadeia L universais de acordo com Barbas [25]. O produto de PCR correspondente ao comprimento completo mAb 4C5 cadeia-L, foi depois subclonado no vector pComb3H. A análise da sequência da cadeia-L recombinante (rec-4C5) revelou que ela pertence ao subgrupo I de cadeia kappa [26] (Fig. 2).

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável da cadeia L de mAb 4C5.

quimérico de anticorpos de cadeia L (ch-4C5) foi construído substituindo a região LCκ rato codificação com a inserção LCκ humano correspondente. A análise da sequência de vários clones recombinantes confirmou a construção bem sucedida do anticorpo quimérico humano-ratinho.

Ambos rec-4C5 e 4C5 foram CH-expressa no espaço periplasmático bacteriana e purificado como descrito em Materiais e Métodos. Os rearranjos electroforéticos dos anticorpos purificados foram testados sob condições redutoras e não redutoras e foram encontrados para ser similar à motilidade correspondente do original anticorpo mAb 4C5 (Fig. 3A).

.

Painel esquerdo:

SDS-PAGE dos anticorpos purificados sob condições redutoras, seguido de coloração com Coomassie Brilliant Blue R-revelado em todos os casos, uma banda de aproximadamente 25 kDa correspondentes à cadeia-L.

Painel direito:

Sob condições não redutoras os anticorpos estão apresentados a migrar como um dímero de cadeia L. B. mancha de Western de lisados ​​de células MDA-MB-453 utilizando mAb 4C5, 4C5 rec-, CH-4C5 e um anticorpo anti-HSP90α comercial, que serve como controlo positivo. Em todos os casos, observa-se uma única banda imunorreactiva de 90 kDa correspondente a HSP90. C. imunoprecipitação de lisados ​​de células MDA-MB-453, com anti-HSP90α, seguida de imunotransferência com quer murino ou anticorpos recombinantes. Em todos os casos, observa-se uma única banda imunorreactiva. D. reverso experiências de imunoprecipitação em lisados ​​de células MDA-MB-453 utilizando mAb 4C5, 4C5 e rec-CH-4C5, seguido por Western blot com anticorpos anti-HSP90α. Em todos os casos, uma única banda imunorreactiva é observada indicando que ambos os anticorpos recombinantes reconhecem HSP90.

ch-4C5 reconhece especificamente HSP90

A fim de explorar a especificidade dos anticorpos, western blot a análise foi realizada em células MDA-MB-453 lisados ​​de células do cancro da mama utilizando um anticorpo policlonal comercial anti-HSP90α (Chemicon International, EUA), o mAb 4C5, 4C5 e rec-CH-4C5. Em todos os casos, foi observada uma única banda imunorreactiva idênticos (Fig. 3B), confirmando que ambos rec-4C5 e 4C5-CH reter a especificidade do mAb 4C5 paterno. Este resultado foi ainda confirmado por experiências de imunoprecipitação realizadas em lisados ​​de células pré-apagada MDA-MB-453 utilizando anti-HSP90α, seguido por imunotransf erência com o mAb 4C5, 4C5 ou rec-CH-4C5. Em todos os casos, foi observada uma única banda imunorreactiva, indicando que a cadeia L quimérica reconhecer especificamente HSP90 (Fig. 3C). O mesmo resultado foi obtido quando foi realizada imunoprecipi tacão utilizando mAb 4C5, 4C5 e rec-CH-4C5 seguido por Western blot com o anticorpo anti-HSP90α (Fig. 3D). Em todos os experimentos um IgG irrelevante rato foi utilizado como controle negativo.

ch-4C5 é a célula-impermeável e não afeta a função de HSP90 intracelular

A fim de investigar se ch-4C5 se liga a superfície de HSP90, as células não fixadas, MDA-MB-453 foram incubados com rec-4C5 ou 4C5-CH, enquanto na cultura. Assim, os anticorpos apenas tiveram acesso à superfície externa das células. Após a incubação, as células foram processadas por imunofluorescência indirecta utilizando um anticorpo secundário marcado fluorescentemente. A imunocoloração pontuar típico observado confirmou a marcação da superfície celular (Fig. 4A). Foram obtidos resultados semelhantes quando se utiliza anti-HSP90α e o mAb 4C5 (Fig. 4A). É digno de nota que de forma semelhante ao mAb 4C5, 4C5-CH, bem como rec-4C5 reconhecem igualmente o conjunto intracelular de HSP90 como demonstrado por imunofluorescência após fixação e permeabilização de células MDA-MB-453 (Fig. 4B). Finalmente, a ligação de anticorpos a viver MDA-MB-453 células foi monitorizada a vários intervalos de tempo. Como mostrado na Fig. 4C, de forma semelhante ao mAb 4C5, rec-4C5 e ch-4C5 não foram internalizadas e permaneceu ligada na superfície celular por até 24 h em cultura.

A. rotulagem imunofluorescência de células MDA-MB-453 utilizando tanto o rec-4C5 e 4C5-CH. A imunomarcação pontuar indica a piscina superfície de HSP90. Os controlos negativos foram realizados usando um anticorpo contra a proteína intracelular β tubulina (dados não mostrados). Barra de escala: 20 ^ M B. imunofluorescência detecção intracelular de HSP90 em células MDA-MB-453 fixos, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100. Da mesma forma que o anticorpo murino, rec-4C5 e ch-4C5 reconhecem o pool intracelular de HSP90. Barra de escala: 20 ^ M C. Para a detecção de anticorpos de internalização, as células vivas foram incubadas com os anticorpos para vários intervalos de tempo, em seguida, fixo, permeabilizadas e marcado por fluorescência. Sem internalização de mAb4C5, rec-4C5 e ch-4C5 é observada mesmo após 24 h de incubação. Em contraste, o anticorpo anti-HSP90α poderia ser detectada intracelularmente após 24 h de incubação. Barra de escala: 20 ^ M D. lisados ​​de células MDA-MB-453, tratado com o mAb 4C5, 4C5 rec-, CH-4C5 e anti-HSP90α foram analisadas por transferência de Western utilizando anticorpos contra ErbB2, Akt, cRaf e HSP90α. Actina serviu como um controlo de carga. Presença de mAb 4C5, rec-4C5 e ch-4C5 não afetou os níveis das quinases comparados aos controles. Em contraste, o anticorpo anti-HSP90α permeável celular reduziu significativamente os níveis de ErbB2, Akt e cRaf.

O significado de célula-impermeabilidade-CH 4C5 foi investigada através da monitorização dos níveis de um subconjunto de HSP90 intracelular proteínas clientes. Até à data, mais de 100 proteínas intracelulares cliente HSP90 foram identificados. inibidores de HSP90 celular permeável ao induzir a degradação destas proteínas por causa da sua estabilidade depende da função intracelular de HSP90 [3]. Uma vez que nossos dados sugerem que o mAb 4C5 e, posteriormente, rec-4C5 e ch-4C5 são células impermeável, examinamos a sua capacidade de afetar a estabilidade do três proteínas clientes HSP90 bem caracterizados, Akt, Craf e erbB-2. Após a incubação de células MDA-MB-453 células com diferentes concentrações de mAb 4C5, 4C5 e rec-CH-4C5, os níveis de Akt, cRaf e ErbB2 foram monitorizadas por Western blotting. Como mostrado na Figura 4D estes anticorpos não afectou os níveis de estado estacionário de qualquer uma das cinases estudados. Em contraste, quando as células foram incubadas com o anti-permeável HSP90α, os níveis de expressão destas quinases foram significativamente reduzidos (Fig. 4D) de células.

CH-4C5 inibe a invasão de células de cancro

Estudos anteriores mostraram que o mAb 4C5 inibe a MDA-MB-453 do cancro da mama e B16 F10 invasão de células de melanoma em um ensaio de cicatrização da ferida [11], [21]. A fim de confirmar que ch-4C5 exibe a mesma propriedade funcional, foi realizada

in vitro

ferida ensaios de cura usando células cancerígenas B16 F10 MDA-MB-453 e. As culturas de controlo foram cultivadas em meio de cultura, quer sozinho, ou em meio de cultura contendo 200 ug /ml do anticorpo BM88 irrelevante. Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os dois tipos de controles usados. O valor médio dos dois tipos de controlo foi considerado como 100% de encerramento de feridas. Como mostrado na Fig. 5A, B, a presença de CH-4C5 no meio de cultura a estender significativamente reduzida de MDA-MB-453 a invasão de células do cancro dentro do intervalo de 24 h após a migração, em comparação com culturas de controlo. Mais especificamente, a presença de CH-4C5 resultou numa inibição de 46% de encerramento da ferida, o que foi semelhante ao obtido quando o anti-HSP90α, bem como o mAb 4C5 e rec-4C5 foram incluídas no meio de cultura (Fig. 5A , B). As barras na fig. 5B representam a média de três experiências independentes ± SEM. Dentro de uma única experiência, cada condição foi testada em triplicado. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando células de melanoma B16 F10 e concentrações crescentes de CH-4C5 que produziram uma inibição dependente da dose da invasão de células (Fig. 5C, D). É importante notar que, no ensaio de cicatrização da ferida o efeito de CH-4C5 é dirigida para a invasão de células e não a proliferação celular, tal como avaliado por um ensaio MTT independentes (dados não mostrados). Isto está de acordo com dados previamente publicados que demonstram que a presença de mAb 4C5 no meio de cultura de células B16 F10 [11] e MDA-MB-453 [21], não afecta a proliferação celular, uma vez que baixa incorporação de BrdU foi observado sem aparente diferenças na presença ou ausência do anticorpo.

a. Wound healing ensaio. As fotografias representam imagens de contraste de fase obtido no tempo zero (painel da esquerda) e em 24 horas (painel da direita) após a formação do zero, que mostra a migração de células MDA-MB-453, quer em culturas de controlo ou culturas, incluindo anti-HSP90α, o mAb 4C5, rec- 4C5 ou ch-4C5. Barra de escala: 200? m. B. Efeito quantitativa de anticorpos sobre o encerramento da ferida. A adição de 200 ug /ml de anti-HSP90α mAb 4C5 e no meio de cultura resultou numa redução de 48% e 55% de encerramento de feridas, respectivamente, quando comparadas com culturas de controlo que foram consideradas como resultando num encerramento da ferida 100%. A adição de 200 ug /ml de rec-4C5 e 4C5-ch no meio de cultura resultou numa inibição de 46% e 46% de encerramento de feridas, respectivamente. significância estatística das diferenças foi avaliada pelo teste t de Student. A presença de anticorpos anti-HSP90α, o mAb 4C5, 4C5 ou rec-CH-4C5 tinha um efeito estatisticamente significativo sobre o encerramento da ferida (p 0,01 em cada caso). C. imagens de contraste de fase obtido no tempo zero (painel da esquerda) e 24 h após a formação de zero (painel da direita), mostrando B16 F10 invasão de células de melanoma numa ferida ensaio de cura na presença de 200 ug /ml de CH-4C5. Barra de escala: 200? m. D. efeito quantitativo de concentrações crescentes de CH-4C5 sobre o nível de invasão de células de melanoma B16 F10. Presença de 50 ug /mL de CH-4C5 resultou numa inibição de 15% da invasão, enquanto que a adição de 100 ug /mL e 200 ug /mL de CH 4C5 resultou em 21% e 43% de inibição da migração, respectivamente, quando em comparação com culturas de controlo que eram considerado como resultando num encerramento da ferida 100%. E. A visualização de células mortas utilizando corante azul de tripano. Em 4C5 ch-culturas tratadas, a incidência de morte celular é semelhante ao observado nas culturas de controlo. Em contraste, nas culturas tratadas com o anticorpo anti-HSP90α, um número muito maior de células são coradas com azul de tripano, indicando um aumento na incidência de morte celular Barra de escala, 30