Abstract
Fundo
O estudo foi desenhado para detectar o nível de oligopeptidase thimet (THOP1) proteína no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) expressão e investigar a sua correlação com as características clínico-patológicas e prognóstico.
Métodos
coloração imuno-histoquímica foi utilizada para determinar a expressão de proteína THOP1 em 120 espécimes NSCLC e 53 tecidos pulmonares normais distantes. Quantitativa PCR em tempo real e western blot foram utilizados para medir a expressão de THOP1 em 16 pares de NSCLC primário e tecidos normais correspondentes.
Resultados
Análise de coloração imuno-histoquímica sugeriu baixo THOP1 expressão foi encontrado em 71 (59,2%) das amostras de NSCLC 120 e significativamente correlacionada com metástases em linfonodos positivos (
P
= 0,048). No entanto, a baixa expressão THOP1 foi encontrada em 22 (41,5%) dos 53 tecidos pulmonares normais. O teste do qui-quadrado sugeriu que a expressão de THOP1 foi significativamente mais elevada nos tecidos pulmonares normais do que nas amostras de NSCLC (
P
= 0,032). Real-Time PCR e transferência de Western mostrou que as amostras de NSCLC tinha diminuído THOP1 ARNm e a expressão da proteína em comparação com os tecidos normais correspondentes. A análise univariada demonstrou que a baixa expressão THOP1 significativamente previu diminuiu 5 anos de sobrevida livre de doença (
P
= 0,038) e sobrevida global (
P
= 0,017). Além disso, positivo metástase ganglionar (
P
= 0,025) e estágio TNM avançada (
P
= 0,009) predisseram significativamente menor sobrevida global em 5 anos. No entanto, a análise de regressão multivariada de Cox mostrou que apenas baixa expressão THOP1 manteve a sua importância como um fator independente de prognóstico para a sobrevida livre de doença em 5 anos desfavorável (
P
= 0,046) e sobrevida global (
P
= 0,021).
Conclusões
THOP1 pode ter potenciais clínicos a serem empregados como um biomarcador promissor para identificar indivíduos com melhor prognóstico e um novo agente antitumoral para a terapia de pacientes com NSCLC.
Citation: Qi L, Li Sh, Si Lb, Lu M, Tian H (2014) Expressão de THOP1 e sua relação com o prognóstico em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (9): e106665. doi: 10.1371 /journal.pone.0106665
editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de maio de 2014; Aceito: 30 de julho de 2014; Publicação: 02 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Qi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30571844), o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia Fundação da província de Shandong (Sem . 2009GG10002007) e da National Science Foundation Natural da província de Shandong (No. ZR2009CM090). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é uma das neoplasias pulmonares mais comuns em todo o mundo devido à sua apresentação clínica tardia e rápida progressão [1], [2]. Apesar de alguns avanços na detecção precoce e ressecção cirúrgica radical combinada com a terapia adjuvante sobre a última década, o prognóstico de pacientes com NSCLC permanecem relativamente pobre [3]. É geralmente reconhecido que a heterogeneidade genética e fatores ambientais levam a tumorigênese do câncer de pulmão em simultâneo. Portanto, a identificação de novos biomarcadores de prognóstico com possível relevância terapêutica e prognóstico é importante para otimizar o tratamento de NSCLC
oligopeptidase Thimet (THOP1; EC 3.4.24.15 ou EP 24.15). É um metalopeptidases características com um zinco HEXXH e motivo de ligação associados com o metabolismo de vários neuropéptidos que contêm de 5 a 17 aminoácidos, tais como bradiquinina, hormona libertadora de gonadotropina, opióides e neurotensina [4], [5], [6]. As evidências acumuladas sugerem que THOP1 foi predominantemente expresso no citosol, retículo endoplasmático, mitocôndria e núcleo de diferentes tecidos humanos normais e células de tumores [7], [8], [9]. Além disso, a análise imuno-histoquímica indicou que THOP1 estava presente em 90% da linha de células NSCLC H1299 e segregada pelas células para clivar e activar DTS-201 [10]. estudo recente demonstrou que a alta THOP1 nível de expressão de mRNA em segundo plano normal do fígado de carcinoma hepatocelular (HCC) foi significativamente correlacionada com melhor sobrevida [11]. Além disso, THOP1 poderia inibir angiogénese de tumor e a proliferação do tumor promovido por BK em células de melanoma [12]. Estes resultados indicam THOP1 pode ser um potencial agente anti-tumoral para a terapia de tumores.
Expressão de THOP1 e o seu papel no prognóstico de NSCLC não foi investigada até agora. Portanto, foram detectados níveis de expressão de THOP1 proteína em pacientes com NSCLC, empregando método imuno-histoquímico para investigar a sua correlação com as características clínico-patológicas, recidiva tumoral pós-operatório e prognóstico.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Qilu Hospital de Ética. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente para publicar os detalhes do caso, e aquisição de amostras de tecido foi realizada como prescrito pelas diretrizes institucionais.
Os pacientes
amostras de tumor (n = 120, média idade 61 ± 4,35 anos) e distantes tecidos pulmonares normais (n = 53, 5 cm da margem do tumor) foram coletadas de pacientes com NSCLC submetidos à ressecção completa do tumor (lobectomia ou pneumonectomia) com dissecção de linfonodos regionais entre janeiro de 2006 e Dezembro de 2007, o departamento de Cirurgia Torácica, Qilu Hospital. O exame histológico e grau de diferenciação de células de câncer foram baseados no sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde revisto em 2004 e sistema de estadiamento TNM da UICC de 2009. Nenhum dos pacientes tinham sido submetidos a ressecção incompleta e recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. As características clínicas desses 120 pacientes são apresentados na Tabela 1.
Imunohistoquímica
coloração imuno-histoquímica para THOP1 foi realizada utilizando o método de estreptavidina-peroxidase. Resumidamente, secções de 4 um de espessura foram cortadas de blocos embebidos em parafina, desparafinadas em xileno e desidratadas através de uma série de álcool graduado. As secções foram incubadas em tampão de citrato (pH 6,0) com um forno de micro-ondas. Depois de ser arrefecida até à temperatura ambiente, as lâminas foram incubadas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena e incubadas com um anticorpo monoclonal de ratinho contra THOP1 (Abcam, Cambridge, MA, EUA, diluição 1:50) durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, aplicou-se o anticorpo secundário biotinilado e o reagente complexo de estreptavidina conjugado com peroxidase, seguido de contracoloração com hematoxilina de Mayer. Os controlos positivos e negativos foram incluídos em cada etapa.
Avaliação de THOP1 Protein Expression
As lâminas imunocoradas foram avaliados por dois investigadores independentes de forma cega e reavaliados por estes investigadores sob um microscópio multihead no casos discordantes para chegar a um consenso. A expressão da proteína THOP1 foram avaliados através do cálculo de uma pontuação total imunocoloração como o produto de ambos o marcador intensidade (0, coloração negativa; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; 3, coloração forte) e pontuação proporção (0, 0- 5%; 1, 6-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; 4, ≥76%), respectivamente. Assim, a pontuação total variou de 0 a 7. O valor de corte para a expressão alta e baixa THOP1 foi determinado com base em um valor heterogeneidade medido através de uma análise estatística log-rank em relação à sobrevida global. O percentual que rendeu o mínimo
P valor
foi escolhido como ponto de corte [13]. Em breve, os 120 pacientes foram dispostos em ordem da pontuação total coloração detectados por análise imuno-histoquímica de grande a pequeno. Em cada percentil de 10 a 90, os dados foram divididos em dois grupos e as diferenças na sobrevivência global foram analisados utilizando o teste de log-rank. O percentil 41 correspondente à pontuação total coloração de 4 produziu o mínimo
valor P
(
P
= 0,017) e foi escolhido como ponto de corte. Portanto, a pontuação total coloração de 4 foi escolhido como ponto de corte para a discriminação entre alta e baixa expressão THOP1. Tumores com uma pontuação total de coloração ≥4 foram todos definidos como alta THOP1 expressão e tumores com uma pontuação total de coloração. 4 foram todos definidos como de baixo THOP1 expressão
Extração de RNA, transcrição reversa Polymerase Chain Reaction e Quantitative PCR em Tempo real
os ARNs totais foram extraídos a partir de tecidos usando o Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado por SuperScript III Síntese da primeira cadeia do sistema (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, EUA) para THOP1 de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de THOP1 RNA mensageiro (mRNA) foram normalizados para o nível de expressão β-actina humana e calculada usando a 2
– o método (△△ CT). Os iniciadores foram utilizados como se segue: sentido: Os iniciadores para β-actina foram: 5′-GCATCCACGAAACTACCT-3 ‘(directo) e 5′-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3′ (inverso). THOP1 iniciadores foram: 5’-CAT GGC CAA GAC CAG CCA GA-3 ‘(para a frente) e 5′-CGC ACG CTT CAG CTC CAG AA-3’ (reverso)
SDS-PAGE e Western Blot.
As proteínas foram extraídas com tampão de lise RIPA. Quantidades iguais (20 ug) de proteína foram sujeitos a análise de SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e sondadas com anticorpos primários. Anticorpo contra THOP1 foi comprado de Abcam (Abcam, Cambridge, MA, EUA, diluição 1:1000). Anti-β-actina anticorpo foi adquirido de Sigma (Sigma, St. Louis, EUA). As bandas de proteína foram detectadas usando o método de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, MA, EUA). A densidade de banda óptica foi quantificada (Imager da Alpha Corporation, San Leandro).
Acompanhamento
Todos os pacientes que receberam alta do hospital foram acompanhados no ambulatório a cada 3 a 6 meses. avaliação de seguimento dos pacientes constou de exame físico, exames de sangue, tomografia computadorizada, ultra-som, raio-X, e fibrobroncoscopia, se necessário. O local eo horário de recidiva tumoral foram registrados. Follow-up foi concluída em todos os pacientes até dezembro de 2013, eo período médio de acompanhamento foi de 48 meses (variação: 15~96 meses).
Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi realizada pelo sistema SPSS 17.0. O teste do qui-quadrado foi realizado para examinar a associação de THOP1 e vários fatores clínico-patológicas. O tempo de seguimento foi censurado se o paciente foi perdidos para follow-up. As curvas de sobrevida foram desenhados utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. A análise de regressão multivariada de Cox foi utilizado para identificar fatores prognósticos independentes significativos. Todos os dados são média ± desvio padrão (DP) a partir de ensaios independentes. Outras análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student.
P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
1.. Expressão de THOP1 em NSCLC e sua correlação com fatores clínico-patológicas
Detectamos a expressão de THOP1 proteína em 120 espécimes NSCLC e 53 tecidos normais do pulmão utilizando imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig. 1, imuno-histoquímica com anticorpos THOP1 mostrou uma reacção positiva no citoplasma de células NSCLC. De acordo com os nossos critérios anteriormente definidos, de expressão elevada THOP1 foi encontrada em 49 (40,8%) dos espécimes tumorais 120 e baixo THOP1 expressão foi encontrada em 71 (59,2%) dos espécimes tumorais 120. Além disso, como controlos negativos, sem a imunocoloração anticorpos primários não resultou em nenhuma coloração. Como mostrado na Fig. 2, THOP1 foi altamente expressa no citoplasma das células epiteliais brônquicas normais e pneumócitos. expressão alta THOP1 foi encontrada em 31 (58,5%) dos 53 tecidos pulmonares normais e baixo THOP1 expressão foi encontrada em 22 (41,5%) dos 53 tecidos pulmonares normais. A expressão de THOP1 foi significativamente maior nos tecidos pulmonares normais do que nas amostras de NSCLC (teste do qui-quadrado,
P
= 0,032).
Vários intensidades de THOP1 expressão da proteína em adenocarcinoma, expressão negativa (A), com a fraco (B), moderada (C), e expressão forte (D). Várias intensidades de expressão THOP1 proteína no cancro de células escamosas, expressão negativa (E), com fraca expressão (F), moderada (G), e forte (H).
As relações entre THOP1 expressão de proteínas e fatores clínico-patológicas foram examinados pelo teste do qui-quadrado, e os nossos dados mostraram que a menor expressão THOP1 foi significativamente correlacionada com metástases em linfonodos positivos (
P
= 0,048). Não houve significância estatística nas relações entre THOP1 expressão e outras variáveis clínico-patológicas (
P Art 0,05, Tabela 1).
Para investigar a expressão do gene THOP1 em NSCLC, usamos quantitativa real -tempo de PCR para medir a expressão de níveis de mRNA THOP1 em 16 pares de tumores primários e tecidos normais correspondentes. Em comparação com os tecidos normais correspondentes, NSCLC espécimes tinham diminuído THOP1 expressão de ARNm (Figura 3A). Consistentemente, análise de transferência de Western mostrou que 12 dos 16 espécimes de NSCLC tinha diminuído THOP1 expressão da proteína em comparação com os seus correspondentes tecidos normais (Figura 3B).
. Expressão de ARNm THOP1 nos tecidos NSCLC foi menor do que nos tecidos pulmonares normais (
P
0,01). análise de mancha ocidental B. sugeriu que os espécimes tinham diminuído NSCLC THOP1 expressão da proteína em comparação com os tecidos normais correspondentes. N: tecido pulmonar normal, T:. Espécimes NSCLC
2. análise de sobrevivência uni e multivariada para a sobrevida livre de doença em 5 anos
reincidência do tumor desenvolvido dentro do período de acompanhamento em 82 (68,3%) dos 120 pacientes: recorrência local em 18 pacientes, metástases à distância em 52 pacientes , e ambos recorrência local e metástases à distância em 12 pacientes. A análise univariada (-log rank test) demonstraram que a baixa THOP1 expressão (25,4% versus 40,8%,
P
= 0,038, Figura 4A) previu diminuiu significativamente a sobrevida livre de doença em 5 anos. Além disso, os resultados da análise de regressão de Cox multivariada mostrou que a baixa THOP1 expressão manteve a sua importância como um fator independente de prognóstico para a sobrevida livre de doença em 5 anos desfavorável (
P
= 0,046, Tabela 2).
3. análise de sobrevivência uni e multivariada para 5 anos a sobrevida global
Dos 120 pacientes, 73 (60,8%) casos morreu de causas relacionadas com o cancro dentro de 5 anos após a operação, a sobrevida global em 5 anos foi de 39,2%. A análise univariada (-log rank test) demonstraram que a baixa THOP1 expressão (29,6% versus 53,1%,
P
= 0,017, Figura 4B), metástases em linfonodos positiva (29,0% versus 50,0%,
P
= 0,025, Figura 4C) e estágio avançado TNM (30,1% versus 53,2%,
P
= 0,009, Figura 4D) predisseram significativamente pior sobrevida global em 5 anos (Tabela 3). Os resultados da análise de regressão de Cox multivariada mostrou que o efeito prognóstico significativo de metástase em linfonodo positivo (
P
= 0,653, Tabela 3) e estágio TNM avançada (
P
= 0,218, Tabela 3) observados na análise univariada desapareceu, e só baixo THOP1 expressão manteve a sua importância como fator prognóstico independente para a sobrevida global desfavorável (
P
= 0,021, Tabela 3).
Discussão
Apesar de ser considerado para desempenhar um papel no sistema neuroendócrino [14], THOP1 tornou-se um foco de investigação recente em tumor. estudos de fraccionamento celular demonstraram que THOP1 está presente nas fracções subcelulares de partículas do tecido nervoso central [15] e segregado a partir de linhas celulares distintos, tais como o glioma C6 de rato [16] e do rato AtT-20 [17]. Além disso, THOP1 alta expressão de ARNm em tecidos normais do carcinoma hepatocelular (HCC) correspondente foi correlacionada com uma melhor sobrevivência geral [11]. No entanto, poucos estudos têm detectado a expressão de THOP1 proteína em tecidos tumorais e sua relação com o prognóstico do tumor.
No presente estudo, foi investigada a expressão de THOP1 em NSCLC e correspondentes tecidos normais, e depois analisou as relações entre a expressão THOP1 e outras variáveis clínico-patológicas em NSCLC. Os resultados do nosso estudo mostraram que THOP1 foi universalmente expressa em NSCLC e tecidos normais correspondentes, e expressão de THOP1 em tecidos normais de NSCLC foi significativamente elevado em ambos os níveis de mRNA e proteína. Além disso, a menor expressão THOP1 em NSCLC foi significativamente correlacionada com metástases em linfonodos positiva. A análise de Kaplan-Meier neste estudo mostraram que a expressão de baixo THOP1 predisseram significativamente diminuída de 5 anos de sobrevida livre de doença e sobrevida global. Além disso, metástases em linfonodos positivos e estágio TNM avançado significativamente previu redução da sobrevida global em 5 anos. Para eliminar o impacto de fatores mistos correlacionados com o prognóstico na análise estatística, a análise multivariada de regressão de Cox foi realizada para determinar os fatores prognósticos independentes. A análise multivariada mostrou que apenas THOP1 mantido seu valor prognóstico como fator prognóstico independente para pobres doença-livre e sobrevida global. A nossa análise de sobrevivência demonstrado que a expressão da proteína THOP1 poderia ser um marcador de diagnóstico útil para pacientes com NSCLC. Como afirmado acima, os nossos resultados implicaram que THOP1 proteína pode ter um efeito anti-tumoral em carcinogénese e progressão do tumor de NSCLC.
estudo anterior sugeriu que THOP1 foi capaz de hidrolisar vários tipos de péptidos bioactivos, tais como bradicinina (BK) [ ,,,0],18]. BK é um importante mediador responsável por angiogénese associada a tumores e o crescimento de tumores [19], [20], [21]. Além disso, BK foi envolvido na carcinogénese e progressão do cancro, aumentando a expressão da integrina α2β1 através da via de sinalização do receptor BK [22]. Além disso, como um factor de antagonista de BK, THOP1 poderia inibir o crescimento tumoral e angiogénese promovido por BK [12]. angiogénese patológica é um acontecimento relativamente precoce na carcinogénese e aumento da angiogénese tumoral correlaciona-se com a invasão do tumor, metástase e prognóstico pobre [23], [24]. Portanto, a diminuição da expressão de THOP1 em NSCLC pode ser responsável pelo desenvolvimento do câncer, malignidade e taxa de sobrevivência pobres devido à sua redução na função anti-BK.
progresso emocionante foi feita em empregar THOP1 para imunoterapia em cancros. Foi relatado que THOP1 segregada pelas células tumorais era um candidato muito provável para a activação extracelular de CPI-0004Na que foi uma prodroga de doxorubicina, e o índice terapêutico melhorado de CPI-0004Na em comparação com a doxorrubicina livre foi confirmada em três modelos de xenoenxerto de tumor de de próstata, mama e cancro do pulmão [10], [25]. Outro estudo sobre os linfócitos T citotóxicos (CTLs) sugeriu THOP1 pode fortalecer a defesa imunológica contra agentes patogénicos intracelulares e cancro, por contribuir para o corte C-terminal de epitopos de CTL [26]. Portanto, THOP1 pode ter um potencial clínico para ser empregue como um agente mais útil de terapia anti-tumoral em doentes com NSCLC.
Em conclusão, a nossa análise retrospectiva forneceram provas de que a expressão de THOP1 foi significativamente mais elevada nos tecidos pulmonares normais do que nas amostras de NSCLC e baixa expressão THOP1 foi significativamente correlacionada com positiva metástase linfática em NSCLC. Além disso, a alta expressão THOP1 proteína exibiram propriedade antitumoral e mostrou influência positiva sobre a sobrevida livre de doença e global. Portanto, THOP1 pode ter potenciais clínicos a serem empregados como um biomarcador promissor para identificar indivíduos com melhor prognóstico e um novo agente antitumoral para a terapia de pacientes com NSCLC.