Abstract

O câncer de pulmão é muito heterogénea e é composto por vários subtipos que estão em diversas etapas diferenciais. As proteínas que interagem com integrina recentemente identificados Kindlin-1 e Kindlin-2 são os activadores de integrinas dos receptores transmembrana, que desempenham um papel importante na progressão do cancro. Neste relatório são apresentados os perfis de Kindlin-1 e Kindlin-2 expressão em cânceres de pulmão usando amostras de pacientes e estabeleceu sua correlação com a progressão do câncer de pulmão. Descobrimos que Kindlin-1 foi expresso em cancro do pulmão de células não pequenas, derivados de epitélios, especialmente no cancro do pulmão de células escamosas, mas expressa em níveis baixos no cancro do pulmão de células grandes fracamente diferenciado. No entanto, Kindlin-2 foi altamente expressa em câncer de pulmão de células grandes. Ambos Kindlin-1 e Kindlin-2 foram encontrados não expressa ou expressa em níveis muito baixos no cancro do pulmão de pequenas células derivadas de neuroendócrino. É importante ressaltar que o nível de expressão Kindlin-1 foi positivamente correlacionada com a diferenciação de câncer de pulmão de células escamosas. Surpreendentemente, descobrimos que as proteínas muito homólogos da família Kindlin, Kindlin-1 e Kindlin-2, exibido contrariar papéis funcionais em células de câncer de pulmão. A expressão ectópica de Kindlin-1 em células de câncer de pulmão de células não-pequenas inibida

in vitro

migração celular e

in vivo

o crescimento do tumor, enquanto Kindlin-2 promoveu essas funções. Mecanisticamente, Kindlin-1 proibida epithelail para mesenquimal em células de cancro do pulmão de não-pequenas células, enquanto Kindlin-2 aumentada para epithelail mesenquimal nestas células. Tomados em conjunto, nós demonstramos que Kindlin-1 e Kindlin-2 diferencialmente regulam a progressão de células de câncer de pulmão. Além disso, os níveis de expressão Kindlin-1 pode ser potencialmente utilizado como um marcador para a diferenciação de cancro do pulmão e segmentação Kindlin-2 pode bloquear o crescimento invasivo de cancro do pulmão de células grandes

citação:. J Zhan, Zhu X, Guo Y, Wang Y, Y Wang, Qiang L, et ai. (2012) papel oposto de Kindlin-1 e Kindlin-2 em cancros do pulmão. PLoS ONE 7 (11): e50313. doi: 10.1371 /journal.pone.0050313

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2012; Aceito: 18 de outubro de 2012; Publicação: 29 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation da China (NSFC) projeto chave 30.830.048, do Ministério da Ciência e Tecnologia da China 2010CB912203 e 2010CB529402, NSFC31170711, a 111 Projeto do Ministério da Educação e Pequim Natural Science Foundation 7.120.002 para HZ, e também por uma doação para Staffan Strömblad do Centro de Biociências no Instituto Karolinska. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução cancer

pulmão é uma doença complexa que pode ser histologicamente classificados em carcinoma do pulmão de pequenas células (CPPC), que representa cerca de 20% de câncer de pulmão, sendo que a maior parte é o cancro do pulmão -cell não pequenas (NSCLC), que representa mais de 80% do cancro do pulmão [1]. NSCLC abranger carcinoma epidermóide (CEC), adenocarcinoma (AC), e carcinoma de grandes células (LCC) [2]. carcinomas diferenciados e pouco diferenciados altamente diferenciados, moderadas pode ser visto na SCC e AC. O cancro do pulmão é bastante heterogéneos em crescimento de tumor, invasão e metástase, assim como nos resultados após o tratamento. câncer de pulmão em estado de diferenciação diferente exibido discrepância de malignidade, por exemplo, carcinomas pouco diferenciados pulmonares são mais maligna do que os cânceres de alto diferenciado, que está em rápido crescimento e altamente metastático.

membro da família Fermitin 1 (FERMT1) que codifica Kindlin -1 é um FERM (4,1-Ezrin-Radixin- moesin) molecular contendo proteína que pertence à família Kindlin. Kindlins são proteínas que interagem integrin- que regulam a activação da integrina através de interacção com a integrina β subunidade domínio citoplasmático [3], [4]. Kindlin-2 codificado por FERMT2 foi encontrado para controlar uma sinalização bidireccional através de integrina [5]. Kindlin foi designada de síndrome de Kindler que foi cunhado em 1954 caracterizado por uma combinação de atrofia epidérmica, ampliou capilares e pigmentação cutânea malhada [6]. Mutações de Kindlin-1 foi identificado como a causa da síndrome de Kindler [7], [8]. Até recentemente membro da família Kindlin ter sido ligado à progressão de tumores [9]. Kindlin-2 tem demonstrado ser expresso em mesotelioma maligno e regula a adesão e a migração [10], e o nível de expressão Kindlin-2 está relacionada com a sensibilidade de células de cancro da próstata para a morte celular induzida por cisplatina [11]. Kindlin-2 expressão foi encontrada correlação com a invasão tumoral, metástase linfonodal, e o resultado do paciente no câncer gástrico [12]. Kindlin-1 foi encontrado sobre-expresso em 60% do cancro do pulmão e 70% do cancro do cólon como examinado por níveis de expressão de ARN em cada dez pacientes [9]. Muito recentemente, Sin et ai demonstraram que Kindlin-1 desempenha um papel no crescimento do cancro da mama e de metástases do pulmão [13]. Além de expressão em células de tumor, Kindlin-2 também foi encontrada para ser altamente expressa no estroma tumoral em cancros da bexiga [14]. No entanto, enquanto Kindlin-1 e Kindlin-2 estão relacionados com a progressão do cancro, Kindlin-3 é que contribui para as desordens hematopoiéticas [15] – [19]. Kindlin-2 expresso em termos gerais no músculo liso endotelial e vesicular [3], [20], e é um componente essencial dos discos intercalados que é necessário para a estrutura e função cardíaca vertebrado [21]. Contudo, até agora pouco se sabe sobre os papéis dos Kindlin-1 e Kindlin-2 na progressão do cancro do pulmão.

Neste estudo pretendemos responder em primeiro lugar, que, se Kindlin-1 e Kindlin-2 desempenham um papel na a progressão do câncer de pulmão. Devido à alta heterogenecity de câncer de pulmão também queremos responder que, se Kindlin-1 e Kindlin-2 diferencialmente expressos em vários tipos de câncer de pulmão e funções claramente em células de câncer de pulmão. Para este efeito, foi investigada a expressão de Kindlin-1 e Kindlin-2 num painel de amostras de tecido de cancro do pulmão e atenção para comparar os níveis de expressão relativos de Kindlin-1 e Kindlin-2 no mesmo paciente. Curiosamente, foi identificado um papel recíproco de Kindlin-1 e Kindlin-2 na regulação da progressão do tumor, em ambas as células e animais. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem uma nova compreensão da Kindlin-1 e Kindlin-2 na progressão de células de câncer de pulmão e pode ajudar para o projeto futuro de drogas em direção terapêutica do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Ética

o Comitê de Ética da Universidade de Pequim Centro de Ciências da Saúde aprovou o estudo de experiências com ratos (número de autorização: LA2011-73). A Comissão de Ética da Sino-Japan Friendship Hospital aprovou o estudo atual usando o cancro do pulmão tecidos do tumor do paciente para fins de pesquisa (número de autorização: ZRLW-5) .Os procedimentos para lidar com ratos e materiais humanos estavam de acordo com o padrão ético da Helsinki declaração de 1975 e revisto em 1983.

vectores de expressão, de cultura de células e de células transfecção estável linhas

Kindlin-1 cDNA completo foi clonado a partir de uma biblioteca de cDNA de placenta humana usando primers: CAGAATCCATGCTGTCATCCACTGACTTTAC (primer forward) e GATCTAGATCAATCCTGACCGCCGGTCAA (iniciador inverso). produto de PCR foi clonado no vector pCRII e depois adicionalmente clonado no vector pCMV10-3 × Flag (Sigma) utilizando locais HindIII-EcoRI. U1752, H1299, linhas de células A549 e U1810 foram adquiridos da ATCC nos EUA ou celular Coleção Center of Peking Union Medical School, em China e foram cultivadas em meio RPMI1640 (Invitrogen) com 10% de FBS e 50 ug /ml de gentamicina. As células foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura ou pratos de 60 mm a 37 ° C em humidade, com 5% (v /v) CO

2. Os meios foram trocados a cada dois dias. Para o estabelecimento de clones estáveis ​​que expressavam Kindlin-1 e Kindlin-2 separadamente, as células H1299 foram transfectadas com Flag-Kindlin-1, Bandeira-Kindlin-2 e vazio vetor usando Lipofectamine. Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram passadas e G418 foi adicionado na concentração final de 1,200 ug /ml. Os clones individuais que expressam Kindlin-1 ou Kindlin-2 foram reunidas em conjunto para evitar efeitos clonal. células agrupadas expressar Kindlin-1 ou Kindlin-2 foram utilizados para estudos funcionais, como indicado no texto.

tecidos tumorais

Lung amostras de tecido de câncer foram obtidos do Departamento de Cirurgia Torácica Sino-Japão Hospital amizade, Beijing China, e foram seccionados no Departamento de Saúde Science Center University Patologia de Pequim, Beijing China. Entre as seções 140 tecido tumoral que foram usados ​​para análises de imuno-histoquímica, 65 são SCC, 43 são AC, 12 são LCC e 20 são SCLC (Tabela 1). Todas estas amostras foram submetidas a Kindlin-1 e Kindlin-2 coloração. Além disso, 7 tecidos de câncer de pulmão frescos com os tecidos tumorais arredores emparelhados incluem 3 SCC, 3 AC e 1 LCLC. Estes tecidos foram usados ​​para extrair o ARNm para a detecção de qPCR Kindlin 1-expressão.

Western blot análise

PBSTDS tampão de lise com a presença de cocktail inibidor de protease (Roche Diagnostics GmbH,) foi utilizado para extrair os lisados ​​de células totais. 80% dos lisados ​​de células foi adicionada a 20% de 5 x tampão de carga de SDS, em seguida, resolvido por gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para membranas de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um). Os anticorpos primários anti-Kindlin-1 de anticorpo monoclonal de ratinho (diluição 1:500; Clone 4A5.14, Milipore, EUA), anticorpo monoclonal de ratinho anti-Kindlin-2 (diluição 1:1000; clone 3A3, Milipore, EUA), anti -Vimentin anticorpo monoclonal de coelho (diluição 1: 2000; Epitomics, EUA), anticorpo monoclonal de coelho anti-Ecadherin (3000 1: diluição; Epitomics, EUA), anticorpo monoclonal de coelho anti-N-caherin (1: 10000 diluição; Epitomics, EUA ), anticorpo anti-Flag-monoclonal (1:10000 diluição; Clone M2, Sigma, EUA) e anti-actina β anticorpo monoclonal de ratinho (diluição 1:1000; clone C4, Santa Cruz, EUA) foram incubados com as membranas separadamente sob rotação. Após lavagem exaustiva, as membranas foram incubadas adicionalmente com anticorpos secundários que reconhecem qualquer um coelho ou Ig de ratinho (Jackson Laboratories, EUA) correspondente. Finalmente, as bandas foram visualizadas pela quimioluminescência aumentada (Pierce).

PCR quantitativa

PCR quantitativa (qPCR), os ensaios foram realizados para detectar a expressão de um Kindlin-ARNm em tecidos de tumor do pulmão. Em resumo, os tecidos tumorais e normais de pulmão total de ARNm foram isolados por Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e 2 mg de RNA total foi transcrito de forma reversa utilizando M-MLV de transcriptase reversa (Promega, CA, EUA). Em seguida, foi realizada por PCR utilizando Taq PCR MasterMix (TIANGEN, China) com as configurações como: 94 ° C 2 min; 94 ° C 30 seg, 60 ° C 30 seg, 72 ° C 30 s, durante 30 ciclos; 72 ° C 5 min. As sequências dos iniciadores foram os seguintes: para Kindlin-1 humano, para a frente: TCATGTTGGAGGAGTGATGC, inverta: AAGCCAGCAATGCTTCTGTT; para a actina, a frente: CTGAGCGTGGCTACTCCTTC, inverta: GCCATCTCGTTCTCGAAGTC. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2,5% na presença de brometo de etídio para visualização. Quantitative PCR também foi utilizado para identificar as alterações do nível de ARNm de MMP induzida por Kindlin-1 e Kindlin-2 na linha de células H1299. MMP-2 para a frente: AGCTCCCGGAAAAGATTGAT, inverta: GGTGCTGGCTGAGTAG- ATCC; MMP-7 para a frente: GTCTCGGAGGAGATGCTCAC; reversa: TACCCAAA-GAATGGCCAAGT; MMP-9 para a frente: TCTTCCCTGGAGACCTGAGA; reversa: ATTTCGACTCTCCACGCATC. alterações vezes relativamente em qPCR foram determinados pelo método ΔΔCt.

Cell ensaios de motilidade

Transwell câmaras (Costar) com 8 um de tamanho de poro foram usadas para executar o ensaio de migração celular. Em primeiro lugar, o colagénio do tipo I foram usadas para revestir a superfície inferior das membranas Transwell durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as células H1299 estáveis ​​transfectadas com Flag-BAP (fosfatase alcalina bacteriana), Flag-Kindlin-1 e Flag-Kindlin-2 foram semeadas sobre a superfície superior do Transwell. Após 6 horas de incubação em tampão de migração (RPMI1640, CaCl 2 mM de

, MgCl2 1 mM de

, MnCl2 0,2 ​​mM

2, e 0,5% de BSA) a 37 ° C em 5% humidificada de CO

2, as membranas Transwell foram fixadas com formaldeído a 4% durante 15 min e corados por violeta cristal durante 10 minutos. Por fim, 6 campos microscópicos foram escolhidos aleatoriamente para contar as células migraram.

Para celular ferida experiência de cura, 48 h após transfecção de células em monocamada foram riscado usando uma ponta padrão pipeta de 100 mL. As monocamadas foram lavadas duas vezes feridos para remover as células não-aderentes com PBS 0,1 M (pH 7,2). Doze horas mais tarde, o ferimento foi observada com uma objectiva de 20 x (Nikon, Japão) e medido para a largura das feridas de células. Seis campos microscópicos para cada prato foram observadas e fotografadas.

imuno-histoquímica (IHQ)

lâminas de tumor de pulmão obtidos a partir Sino-Japan Friendship Hospital eram todas fixadas em formol e paraffinembeded. A desparafinação hidratação e foram realizados e seguido de abolir a actividade da peroxidase endógena com 0,3% de peróxido de hidrogénio durante 30 min e micro-ondas para a recuperação de antigénio em tampão de 10 mM de citrato de sódio (pH 6,0) durante 20 min. Utilizou-se anticorpo policlonal purificado por afinidade anti-Kindlin-1 (PKU Facilidade animal) a 2 ug /ml e anticorpo monoclonal anti-Kindlin-2 (Milipore, EUA) a 2 ug /ml para realizar estas experiências. O anticorpo primário utilizado foi a 4 ° C durante a noite. Então PV9000 2-step mais Poly-HRP anti-ratinho /coelho Sistema de Detecção de IgG (Zhong Shan Jin Qiao) foi aplicado. O método de estreptavidina-peroxidase de biotina foi utilizado para a detecção e diaminobenzidina foi aplicado para substrato (ChemMate Detection Kit, DAKO). Hematoxilina foi usada para contracoloração. Os controlos negativos foram realizados por omitir o uso do anticorpo primário.

Avaliação da imuno-histoquímica

Dois patologistas independentes avaliadas todas as colorações imunológicas e uma justificação consenso com base na discussão foi gravada. A avaliação foi classificada em 4 graus: no reactividade marcado como 0, a reactividade fraca como 1+, reactividade moderada como 2+, e reactividade forte como 3+

In vivo

crescimento do tumor xenoenxerto. experimentar

ratinhos Balb /c nus foram implantadas subcutaneamente no flanco com 1 x 10

6 células que sobre-expressam de forma estável são Kindlin-1, Kindlin-2 e o vector de controlo separadamente. Os tumores foram medidos para seus tamanhos em dezoito dias e continuar a gravar durante o tempo indicado. Os ratinhos foram sacrificados utilizando a eutanásia quando o crescimento do tumor em 1 cm de diâmetro. Os tumores foram retirados e pesados.

analisa análise estatística

Estatística para materiais paciente foram realizadas com teste de Kruskal-Wallis e análises estatísticas para amostras pareadas empregados o teste t de Student. Todas as análises estatísticas foram usando SPSS version14.0. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos ao nível de

P

. 0,05

resultados

Kindlin-1 é expresso em tecido pulmonar normal e diferentes subtipos de câncer de pulmão

Kindlin-1 expressão no câncer de pulmão foi preliminarmente sugeriu

9,13. No entanto, nada é conhecido em detalhe para Kindlin-1 expressão em diversos subtipos de pacientes com câncer de pulmão. Para entender o involement posible de Kindlin-1 e Kindlin-2 na progressão do cancro do pulmão, primeiro analisou a expressão de Kindlin-1 em cancro do pulmão tecidos do paciente usando immnohistochemistry (IHC) com um policlonal purificada por afinidade Kindlin-1 anticorpo, com o normal pulmão tecidos como controle. Descobrimos que Kindlin-1 não era detectável nos alvéolos pulmonares normais e sinal fraco no pulmão vasos sanguíneos normais foi observada (Fig. 1A-A). Curiosamente, Kindlin-1 foi encontrada altamente expresso no citoplasma e núcleo de células em forma de cone e células fusiformes distribuídos no epitélio colunar (Fig. 1A-B). No entanto, Kindlin-1 foi encontrada fracamente expressos nas células colummar, células caliciformes e não manifestou no memberane porão. Em tecidos de tumor de pulmão, Kindlin-1 foi altamente expressa encontrado no citoplasma bem como membrana de SCC (Fig. 1A-C). Além disso, Kindlin-1 foi encontrada moderadamente expresso no citoplasma do epitélio glandular tumoral em corrente alternada (Fig. 1A-D) e fracamente expresso em LCC (Fig. 1A-E). Surpreendentemente, não se observou qualquer expressão de Kindlin-1 em tudo em CPPC (Fig. 1A-F) (Tabela 2).

a. Kindlin-1 expressão em tecidos de subtipos normais e diferentes de câncer de pulmão examinados pela IHC. Fotografias indicadas são pulmão normal (A), o epitélio colunar pseudo-estratificado ciliado (B), SCC (C), CA (D), LCC (E), e SCLC (F). b. Determinação dos níveis de mRNA de Kindlin-1 em espécimes clínicos frescos medido por qPCR. c. Re-análise de Kindlin-1 expressão no banco de dados Oncomine. Esquerda: Kindlin-1 expressão extraída no conjunto de dados de pulmão Hou; Direita: Kindlin-1 expressão extraída no conjunto de dados de pulmão Garber. Análise estatística entre os diferentes grupos de pacientes foram examinados por

t

teste de Student. ** Representa para

p

. 0,01

Além disso, examinamos a expressão de mRNA Kindlin-1, mesmo tecidos tumorais de SCC, AC e SCLC de pulmão recém-preparados pacientes com câncer. Descobrimos que SCC apresentaram maiores níveis de Kindlin-1 expressão do que AC e SCLC exibido o menor expressão de Kindlin-1 entre os vários tipos de doentes com cancro do pulmão examinados (Fig. 1b).

De forma encorajadora, o acima Kindlin -1 perfil de expressão como determinado quer por imuno-histoquímica ou qPCR foi ainda apoiada por re-analizing Kindlin-1 ARNm perfil de expressão em conjuntos de dados de pacientes da base de dados Oncomine (www.oncomine.com). Após a análise de conjuntos de dados do paciente Affymetrix cancro Hou e Garber pulmão, verificou-se que um Kindlin-expressão em diferentes tipos de NSCLC no nível de ARNm foi significanly aumentou (Fig. 1C), que está de acordo com os resultados acima IHC. Estes dados sugerem que Kindlin-1 é de facto altamente expessed no CEC por exame de diferentes co-Horts paciente.

Kindlin-1 está correlacionada com a expressão de diferenciação celular no SCC mas não em AC

Aforementioned resultados indicaram que, mesmo dentro SCC, Kindlin-1 expressão é heterogêneo. Isto sugere que a expressão Kindlin-1 pode variar com a variação da diferenciação celular no cancro do pulmão. Para este efeito, analisou-se a expressão Kindlin-1 em SCC com diferentes fases de diferenciação celular. Curiosamente, verificou-se que Kindlin-1 é altamente expressa nas CEC bem diferenciadas do que a moderadamente diferenciado SCC (Figura 2-A e -B.); e a moderada diferenciadas expressas SCC superior Kindlin-1 do que a pouco diferenciado SCC (Fig. 2-B e -C). No entanto, esta tendência de Kindlin-1 expressão encontrado em CEC não era aplicável a CA (dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a fase de diferenciação maior responde à expressão mais elevada de Kindlin-1 no CEC (Tabela 2).

fotos representativa que reflicta Kindlin-1 expressão em SCC foram seleccionados e as análises estatísticas podem ser encontrados na Tabela 2. a, bem diferenciado SCC. B, SCC diferenciada Moderado. C, SCC pouco diferenciados.

Kindlin-1 e Kindlin-2 são diferencialmente expressos em diferentes subtipos de câncer de pulmão

Até agora não há nenhum relatório sobre Kindlin-2 expressão no pulmão linhas celulares de cancro, bem como em pacientes com câncer de pulmão. É de interesse de saber se ambos Kindlin-1 e Kindlin-2 são expressos em pacientes com câncer de pulmão. Para este fim, foi examinada a expressão Kindlin-2 no mesmo painel de amostras de doentes acima referidos. Enquanto Kindlin-2 foi encontrado expresso em vasos sanguíneos dos tecidos pulmonares normais (Fig. 3a-A), Kindlin-2, verificou altamente expressos no citoplasma e núcleo de células em forma de cone (Fig. 3a-B) semelhantes às o Kindlin-1 coloração como mostrado na Fig. 1A-B. Isto indica que tanto Kindlin-1 e Kindlin-2 são expressos na epithilium brônquios normais. Curiosamente, Kindlin-2 padrão de expressão é bastante diferente da de Kindlin-1 em CEC. Em vez de expresso no CEC e AC, Kindlin-2 foi encontrado hihgly expressa no estroma do tumor (Fig. 3a-C e D), o que contrasta drasticamente com o padrão de expressão de Kindlin-1 nestes tipos de cancro do pulmão. Além disso, Kindlin-2 foi encontrado altamente expresso em LCC na membrana celular e o estroma tumoral circundante em comparação com a expressão fraca de Kindlin-1 em LCC (Fig. 3a-e). Além disso, pouca ou nenhuma coloração positiva de Kindlin-2 foi observada em CPPC (Fig. 3a-f), que é semelhante à que se Kindlin-1 coloração no mesmo tipo de células (Fig. 1A-F). Estes resultados IHC foram reforçadas pela re-análise de Kindlin-2 expressão de mRNA em bancos de dados Oncomine Hou pulmão e Garber pulmão (Fig. 3b). Na série de secções de tecido da SCC paciente, Kindlin-1 foi fortemente expressa nas células de tumor, enquanto Kindlin-2 foi encontrado expresso principalmente no estroma do tumor (Fig. 3C-A, -B). Estas observações indicam que Kindlin-1 e Kindlin-2 são diferencialmente expressos em células de câncer de pulmão.

a. Kindlin-2 expressão em tecidos de tecidos normais e câncer de pulmão examinados pela IHC. Fotografias indicadas são pulmão normal (A), o epitélio colunar pseudo-estratificado ciliado (B), SCC (C), CA (D), LCC (E), e SCLC (F). b. Re-análise de Kindlin-2 expressão em banco de dados Oncomine. Esquerda: Kindlin 2-expressão extraído do conjunto de dados de pulmão Hou; Direita: Kindlin-2 expressão extraída do conjunto de dados de pulmão Garber. Análise estatística entre os diferentes grupos de pacientes foram examinados por

t

teste de Student. ** Representa para

p Art 0,01. c. Comparação das expressões de Kindlin-1 e Kindlin-2 em CEC do mesmo paciente. Como apresentado Kindlin-2 é altamente expressa no estroma do tumor, mas não em células de cancro do pulmão.

Tabela 2 summerized a expressão de Kindlin-1 e Kindlin-2 nos tumores de vários doentes com cancro de pulmão. Kindlin-1 expressão foi positiva em 84% dos pacientes com câncer de pulmão. Para os vários subtipos de tumores, tanto Kindlin-1 e Kindlin-2 mostrou alta taxa positiva em NSCLC do que em SCLC (

p Art 0,0001). Curiosamente, no prazo de NSCLC Kindlin-1 expresso em níveis baixos na LCC, moderado em AC, e a maior expressão de Kindlin-1was encontrado em SCC (

p Art 0,0001). No entanto, Kindlin-2 tem um perfil recíproca expressão: o nível de Kindlin-2 é baixa em SCC expressão, moderada em AC e a maior expressão de Kindlin-2 foi observada em LCC (

p Art 0,0001) . Curiosamente, a expressão Kindlin-1 foi encontrada correlacionadas com a diferenciação de tumores. SCC, composta de epitélio escamoso, e AC composta de epitélio glandular foram exibiu maior expressão Kindlin-1 do que o LCC que é classificada como carcinoma indiferenciado (

P

0,0001). Além disso, SCC bem diferenciado tem uma maior expressão Kindlin-1 do que SCC pouco diferenciado (

p

= 0,0024). Em comparação, nenhuma correlação foi identificada para Kindlin-1 expressão com diferenciação para AC (

p

= 0,8523). Da mesma forma, Kindlin-2 expressão não foi encontrado para ser correlacionada com a diferenciação de diferentes subtipos de câncer de pulmão (

p

= 0,1759).

Kindlin-1 e Kindlin-2 oposta regular o cancro do pulmão progressão de células

in vitro

Dado que Kindlin-1 e Kindlin-2 são diferencialmente expressos em células de câncer de pulmão, é tentador para entender se Kindlin-1 e Kindlin-2 também funcionam diferentemente para regular a progressão de células de câncer de pulmão. Nós já descobriram que Kindlin-2 foi altamente expressa no front de invasão tumoral em mesotelioma maligno [10]. Para este fim, examinamos a expressão de Kindlin-1 e Kindlin-2 no

de novo

SCC que estão localizadas nos locais secundários de disseminação intra-pulmão de um paciente SCC. Como mostrado na Fig. 4a-A, Kindlin-1 foi fortemente expresso na massa tumoral do

de novo

SCC, mas fracamente expresso na frente invasiva do tumor. No entanto, Kindlin-1 coloração é concentrado nos núcleos das células do tumor em frente invasiva do

de novo

SCC, sugerindo um citoplasma para núcleo de transição podem existir em Kindlin-1 (Fig. 4a-A.Arrowed) . Em contraste, Kindlin-2 não foi encontrado expresso no tipo semelhante de estrutura a partir do mesmo paciente (Fig. 4a.B). Curiosamente, um citoplasma para núcleo de transição Kindlin-2 também foi encontrada em tumores da frente invasiva (Fig. 4a-B.Arrowed). Colectivamente, estes dados sugerem que Kindlin-1, mas não Kindlin-2 está envolvido na regulação da colonização pulmonar de células de cancro em CEC. Por isso, continuou a caracterizar o papel diferencial da Kindlin-1 e Kindlin-2 na regulação da progressão do câncer de pulmão. Nós detectado pela primeira vez as expressões de Kindlin-1 e Kindlin-2, bem como epitelial para mesenquimal (EMT) marcadores de E-caderina e vimentina em linhagens de células de câncer de pulmão derivados de SCC, AC e LCC e descobriu que Kindlin-1 e Kindlin- 2 foram diferencialmente expressos em linhas celulares de cancro de pulmão (Fig. 4B). Estabelecemos então H1299 células que sobre-expressos de forma estável Kindlin-1. Descobrimos que os marcadores EMT N-caderina e vimentina foram regulados negativamente em células H1299 cancro do pulmão que sobre-expressam de forma estável Kindlin-1, em comparação com as células de controlo que expressam Bandeira-BAP (Fig. 4C), sugerindo um papel de Kindlin-1 na inibição do programa EMT em células de adenocarcinoma do pulmão. Além disso, para examinar o papel diferencial da Kindlin-1 e Kindlin-2 na regulação da motilidade celular do cancro do pulmão, foi realizado o ensaio de migração hepatotactic sobre o colágeno tipo I que medeia β1 migração de células relacionadas com a integrina. Descobrimos que Kindlin-1 inibida enquanto Kindlin-2 promoveu a migração de células H1299 em um ensaio Transwell (Fig. 4d). Enquanto isso, o papel distinto de Kindlin-1 e Kindlin-2 na regulação da invasão de células de cancro do pulmão foi examinada através da determinação da expressão de metalloprotenases incluindo MMP7, MMP9 e MMP13. MMP7 e MMP9 foi encontrado para ser regulados negativamente com a expressão ectópica de Kindlin-1, ao passo que MMP7 e MMP13 foram regulados positivamente com a expressão ectópica de Kindlin-2 (Fig. 4E). Em uma transfecção transiente, a sobre-expressão de Kindlin-1 levou a regulação negativa de N-caderina (Fig. 4f painel esquerdo), sugerindo um papel inibitório de Kindlin-1 na ocorrência EMT. No entanto, de knockdown endógena Kindlin-2 diminuiu o nível de N-caderina (Fig. 4f painel esquerdo), um efeito que é equivalente à expressão excessiva de Kindlin-1. Além disso, foram examinados os níveis de Kindlin-2 Expressão em LCC primária e secundária e descobriram que Kindlin-2 foi fortemente expressa nos gânglios linfáticos de metástase LCC (Fig. 4G-B, seta) em comparação com o tumor primário do mesmo doente ( A Fig. 4g-A). Esta constatação sugeriu que elevado nível de expressão Kindlin-2 pode corresponder a um potencial elevado da LCC invasão. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a expressão diferencial de Kindlin-1 e Kindlin-2 em doentes com cancro do pulmão correspondem a uma regulação oposto sobre a migração celular, bem como na capacidade invasiva de células.

a. Expressão de Kindlin-1 e Kindlin-2 no secundário

de novo

SCC a partir de um paciente SCC invasivo. A. Kindlin-1 expressão no

de novo

SCC. B. expressão Kindlin-2 no

de novo

SCC do mesmo paciente como em A. b. Painel da esquerda: A expressão diferencial de Kindlin-1, Kindlin-2, E-caderina e vimentina em várias linhas celulares de cancro de pulmão controlados por Actin durante o carregamento. Painel direito: A quantificação dos níveis de expressão relativa de proteína. c. Painel da esquerda: A expressão estável de Kindlin-1 em células H1299. Indicado são misturados clones estáveis ​​que expressam Bandeira-Kindlin-1. Painel direito: Quantificação dos níveis de proteína relativos para Kindlin-1 regulamentada N-caderina e vimentina. d. Kindlin-1 e Kindlin-2 diferencialmente regular a migração em células H1299. Apresentado é a quantificação e trama como média ± SEM de três experiências independentes. Análise estatística entre os grupos de células diferentes foram examinados por

t

teste de Student. ** Representa para

p Art 0,01. e. Kindlin-1 e Kindlin-2 diferencialmente regular os níveis de ARNm de MMP analisadas por qPCR em H1299 células que expressam de forma estável Kindlin-1 e Kindlin-2. Inserir mostra a expressão de Kindlin-1 e Kindlin-2 nos clones mistos estáveis ​​aplicados em qPCR. f. painéis esquerdos: Expressão de Kindlin-1 regula negativamente N-caderina e Knockdown de Kindlin-2 regula negativamente N-caderina. painéis da direita: Quantificação dos níveis de proteína relativos para Kindlin-1 e Kindlin-2-regulada N-caderina. Análise estatística entre os grupos de células diferentes foram examinados por

t

teste de Student. ** Representa para

p Art 0,01. g. Expressão de Kindlin-2 em linfonodo metástase grande paciente com câncer de pulmão de células. A. primária do cancro do pulmão de células grandes; nó B. A linfa metástase de câncer de pulmão de células grandes do mesmo paciente.

Kindlin-1 e Kindlin-2 oposta regular o crescimento de células de câncer de pulmão em um

in vivo

mouse modelo de xenotransplante

com base na conclusão anterior de que Kindlin-1 e Kindlin-2 foram diferencialmente expressos em amostras de pacientes com câncer de pulmão, e migração de células de câncer de pulmão oposta regulamentada

in vitro

, estávamos ansiosos para saber se Kindlin -1 e Kindlin-2 desempenham um papel distinto na regulação do crescimento do tumor

in vivo

. Para este fim, os xenoenxertos de tumor de rato com Kindlin-1 sobre-expressão cresceram mais lenta e os tamanhos dos tumores eram menores do que a do controlo (Fig. 5a e b). No entanto, os tumores com sobreexpressão Kindlin-2 cresceu muito mais rapidamente e os tamanhos dos tumores eram muito maiores do que a do controlo (Fig. 5a e b). Curiosamente, os tecidos tumorais recuperado dos xenoenxertos de ratinho também mostraram aumento da N-caderina e expressão de vimentina no Kindlin-2 tumores que sobre-expressam, com nenhuma alteração para N-caderina e vimentina em Kindlin-1 sobre-expressos ou os tumores de controlo (Fig. 5c). Estes dados claramente demonstrado que Kindlin-1 e Kindlin-2 não só o crescimento do tumor oposta regulamentada, mas também o potencial de invasão do tumor no

in vivo

modelo de xenoenxerto mouse.

a. curva de crescimento do tumor. O volume do tumor de H1299 Bandeira-Kindlin-1 grupo é significativamente menor do que o grupo da Bandeira-BAP (

p Art 0,01 como analisado por Student

t

teste) no dia 22 e, entretanto, o volume do grupo Bandeira-Kindlin-2 é obviamente maior do que o grupo de sinalizadores-BAP (

P

0,01 como analisado por

t

teste de Student). b. Os tumores recuperados a partir de ratos no dia 27. c. Painel esquerdo: Determinação da expressão de N-caderina e vimentina a partir de xenoenxertos de tumores que expressam de forma estável Kindlin-1, Kindlin-2 e o controlo de BAP por análises Western blot. Painel direito: Quantificação dos níveis de proteína relativos para Kindlin-1 e Kindlin-2-regulada N-caderina e vimentina. Análise estatística entre os diferentes grupos de tumor foram examinadas por

t

teste de Student.