Abstract

O bloqueio da actividade do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) tem sido um alvo terapêutico primário para cancros de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Como os pacientes com EGFR de tipo selvagem demonstraram único benefício modesto de inibidores da tirosina-cinase EGFR (TKI), existe uma necessidade de abordagens terapêuticas adicionais em doentes com EGFR de tipo selvagem. Como um componente essencial de sinalização de integrina a jusante e receptor conhecido conversa cruzada com o EGFR, a hipótese de que a segmentação actividade quinase de adesão focal (FAK), que também tem sido demonstrado que se correlacionam com a fase agressiva em NSCLC, levaria a uma actividade aumentada de EGFR TKI . Como tal, as células resistentes NSCLC-TKI de EGFR (A549, H1299, H1975) foram tratados com o TKI de EGFR erlotinib e inibidores de FAK (PF-573,228 ou PF-562,271), ambos como agentes isolados e em combinação. Determinou-se a viabilidade celular, apoptose e crescimento de 3-dimensional

in vitro Comprar e crescimento do tumor avaliada

in vivo

. O tratamento de células NSCLC-resistentes TKI de EGFR com inibidor de FAK sozinho inibiu eficazmente a viabilidade celular em todas as linhas celulares testadas; No entanto, a sua utilização em combinação com o TKI de EGFR erlotinib foi mais eficaz na redução da viabilidade das células do que qualquer dos tratamentos sozinhos quando testado em ambos 2- e 3-dimensionais ensaios in

in vitro

, com benefício melhorada visto em células A549. Este aumento da eficácia pode ser devido, em parte, para a inibição observada de fosforilação de Akt quando as drogas foram usadas em combinação, onde as células novamente A549 demonstrou a inibição mais após o tratamento com a combinação de drogas. Combinando erlotinib com inibidor de FAK também foi potente

in vivo

como evidenciado pelo crescimento do tumor reduzida no modelo de xenotransplante rato A549. Nós ainda verificar que a maior sensibilidade foi independentemente do estatuto LKB1 mutacional. Em resumo, que demonstram a eficácia da combinação de inibidores erlotinib e FAK para utilização na conhecida de EGFR de tipo selvagem, as células resistentes TKI de EGFR, com o potencial de um subconjunto de tipos de células, que inclui A549, pode ser particularmente sensível a este tratamento de combinação. Como tal uma avaliação mais aprofundada desta terapia de combinação, se justifica e poderia provar ser uma abordagem terapêutica eficaz para pacientes com inerente resistente TKI EGFR NSCLC

Citation:. Howe GA, Xiao B, Zhao H, Al-Zahrani KN, Hasim MS, Villeneuve J, et al. (2016) quinase de adesão focal inibidores em combinação com Erlotinib Demonstrar reforçada Anti-Tumor Atividade em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0150567. doi: 10.1371 /journal.pone.0150567

editor: Jeremy J. W. Chen, do Instituto de Ciências Biomédicas, TAIWAN

Recebido: 28 de setembro de 2015; Aceito: 14 de fevereiro de 2016; Publicação: 10 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Howe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de CLA da Fundação Lung Cancer Research (https://www.lungcancerresearchfoundation.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados ou análise, decisão de publicar ou preparação deste manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviaturas: DMSO, sulfóxido de dimetilo; ECM, matriz extracelular; EGFR, receptor do factor de crescimento epidérmico; FAK, quinase de adesão focal; LKB1, quinase hepática B1; NSCLC, cancro do pulmão de células não-pequenas; PBS, solução salina tamponada com fosfato; PF-228, PF-573228; PF-271, PF-562271; TKI, inibidor da tirosina quinase

Introdução

Os cancros do pulmão são responsáveis ​​por mais mortes no mundo do que qualquer outro tipo de câncer [1] com ~ 80% dos cancros do pulmão a ser classificados como cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [2]. A proteína do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), é sobre-expressa em até 80% dos CPNPC, portanto, o EGFR tem sido um alvo terapêutico principal para NSCLC [3,4]. Para este fim, os agentes foram concebidos para atingir tanto o domínio extracelular e um domínio intracelular de cinase de EGFR. Inibidores de segmentação do domínio da cinase do EGFR, tais como gefitinib e erlotinib, mostraram-se promissores em pacientes com mutações de activação (isto é, em exões 18, 19 ou 21) em EGFR [5-8], embora estes inibidores têm demonstrado apenas modestos benefícios para pacientes abrigando EGFR de tipo selvagem [9,10]. Além disso, mutações secundárias em EGFR ou amplificação de c-met pode desenvolver, que confere resistência em pacientes sensíveis anteriormente [11]. À medida que a incidência de mutações de activação do EGFR é relativamente baixa na maior parte dos norte-americanos e europeus populações [12-15], existe uma necessidade de aumentar a sensibilidade aos inibidores da tirosina-cinase EGFR (TKI) para os pacientes com EGFR de tipo selvagem.

quinase de adesão focal (FAK) é uma tirosina-quinase não receptora que se localiza em locais de adesão celular à matriz extracelular (ECM) e medeia eventos a jusante de integrina engate da ECM sinalização. FAK é conhecido por regular a sobrevivência celular, a proliferação e a migração [16]. expressão de FAK também tem sido mostrado para ser sobre-regulada em muitos tipos de cancro, incluindo cancros do pulmão [17], posicionando, assim, a FAK como um alvo importante para a regulação em terapia do cancro. Para este fim, os inibidores de FAK têm sido desenvolvidos, incluindo inibidores farmacológicos de actividade de tirosina-quinase de FAK [18,19]. A inibição da FAK foi demonstrada para afectar uma série de processos celulares importantes para o crescimento tumoral e a progressão da doença, incluindo a angiogénese e metástase [20-22]. Adicionalmente, os inibidores de FAK têm sido mostrados para inibir eficazmente o crescimento do tumor em vários modelos de xenoenxerto subcutâneo [23,24] que mostra promessa como agentes individuais, bem como em combinação com outros inibidores de [24-26].

NSCLC, aumento dos níveis de expressão de FAK são observados no tecido do tumor em relação ao tecido pulmonar normal, e este aumento da expressão está associada a estádios de doença mais elevadas [27]. Estes resultados sugerem um papel importante para a FAK na progressão do NSCLC. Evidências recentes também implicado expressão integrina β1 na resistência ao TKI de EGFR gefitinib, com o aumento da sensibilidade a gefitinib ser visto após a depleção integrina β1 em células NSCLC [28]. Dado que a FAK é um dos principais quinases activadas a jusante da integrina β1, é indicada a importância da sinalização adesão complexo ECM-focal na resistência ao tratamento TKI de EGFR. Como se trata de uma prática estabelecida para tratar pacientes com NSCLC com EGFR TKI e há evidências crescentes de que FAK desempenha um papel importante no crescimento do câncer de pulmão e progressão, partimos para testar a utilidade de combinar o erlotinib inibidor EGFR com a inibição FAK em NSCLC. Foram investigados os efeitos de dois inibidores de FAK, PF-573228 (PF-228) e PF-562271 (PF-271) sobre o crescimento de células NSCLC na cultura e o crescimento do tumor em modelos de xenotransplante de rato como ambos os agentes isolados e em combinação com erlotinib. Os resultados de nosso estudo indicam que a combinação de inibição FAK com erlotinib reduz mais eficazmente a viabilidade celular NSCLC EGFR do tipo selvagem

in vitro Comprar e xenoenxerto crescimento do tumor

in vivo

do que qualquer tratamento medicamentoso sozinho, com especial eficácia no tipo de células A549. Assim, os nossos resultados identificaram uma estratégia de combinação droga promissora segmentação EGFR e FAK em NSCLC, e indicam que um regime de tratamento, incluindo um inibidor de FAK pode provar ser mais benéfico do que o tratamento com erlotinib isoladamente em pacientes albergam inerente resistente TKI de EGFR NSCLC.

Métodos

cultura celular e reagentes

Humano linhas de células A549 (EGFR de tipo selvagem) e H1299 (EGFR de tipo selvagem) foram adquiridas a partir da ATCC, enquanto H1975 (EGFR L858R e T790M mutações), HCC827 (EGFR ΔE746-E750) e HCC4006 (EGFR ΔL747-E749) linhas celulares foram um presente do Dr. Ming Tsao (Princess Margaret Hospital, Toronto, ON). As células A549 foram mantidas em DMEM (Mediatech, Manassas, VA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Medicorp, Montreal, QC), enquanto H1299, H1975, HCC827 e HCC4006 células foram mantidas em meio RPMI-1640 (Hyclone Laboratories, Logan , UT) com 10% de FBS. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2. O inibidor de FAK PF-573228 (PF-228) foi adquirido a Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido) e dissolveu-se em DMSO. Erlotinib ea FAK inibidor PF-562271 (PF-271) foram adquiridos a partir de Xangai Biochempartner Co. Ltd. (Xangai, China) e dissolvido em DMSO para

in vitro

trabalho de cultura de células.

geração de células resistentes erlotinib

HCC4006 células que foram originalmente sensível ao erlotinib, foram feitos resistentes à do erlotinib ao longo de 5 ciclos de aumento da dose começando com 0,005 uM erlotinib e o aumento da concentração por um factor de cinco até que as células resistentes a 3 uM erlotinib foram isolados. células parentais foram tratadas com quantidades equivalentes de DMSO para as células submetidas a selecção para a resistência para a duração da experiência de escalonamento de dose, e estes foram utilizados como controlos para todas as experiências subsequentes.

O plasmídeo de transfecção em células A549 LKB1

As células A549 foram transfectadas com pcDNA3-FLAG-LKB1 (plasmídeo 8590 [29], Addgene, Cambridge MA) para superexpressão LKB1 ou com pcDNA3.1 como controle de vetores utilizando GeneJuice reagente de transfecção (Novagen, Etobicoke, ON). As células transfectadas foram semeadas em placas de cultura de múltiplos tecidos e após 48 horas, dividir activamente células foram tratadas com 500 ug /mL de geneticina (Invitrogen, Burlington, ON) para facilitar a selecção de células que expressam o plasmídeo. As células em cada prato de cultura de tecidos remanescentes depois da selecção foram reunidas para criar uma série de clones reunidos de ambos LKB1 expressando e não expressando células A549. Confirmação da expressão em células transf ectadas LKB1 FLAG-LKB1 e continuou falta de expressão em células de controlo LKB1 foi confirmada por transferência Western para LKB1.

siARN transfecção

H1299 células foram transfectadas quer simulada (PBS) ou transfectada com siGENOME não-alvo de controle siRNA # 2 ou siGENOME SmartPool LKB1 siRNA (cat # M-005035-02, Dharmacon, Lafayette, CO) com o reagente Oligofectamine (Invitrogen, Burlington, ON). Eficiência de knockdown LKB1 foi confirmada através de Western blotting. Para os ensaios de MTT utilizando células siRNA-transfectadas, o tratamento medicamentoso começou às 48 horas após a transfecção. Para experiências que envolvem a estimulação das células com EGF para western blot, as células siRNA-transfectadas foram privadas de soro início durante a noite a 48 horas após a transfecção antes da estimulação do fator de crescimento.

MTT viabilidade celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 4000 células /poço e incubadas durante a noite. Para aumento da dose e combinação de drogas experiências, as células foram tratadas com erlotinib ou PF-228 sozinho ou em combinação em várias concentrações de medicamento em meio DMEM ou RPMI-1640 suplementado com 5% de FBS durante 48 horas. A viabilidade celular foi então avaliada com o reagente MTT (brometo de tetrazólio azul de tiazolilo; Sigma, Oakville, ON) tal como previamente descrito [30] com absorvância sendo determinada a 570 nm com um leitor de placas Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Rockford, IL). Os tratamentos foram realizados em réplicas de seis com os valores médios expressos como a percentagem da viabilidade em relação ao controlo tratado com DMSO (100% viável). A natureza do efeito de erlotinib em combinação com o inibidor da FAK PF-228 foi determinada pelo método de Chou-Talalay [31] utilizando o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Os dados para a viabilidade celular como medido por MTT para cada fármaco isoladamente e em combinação foi utilizada no programa CalcuSyn para produzir CI-afectados fracção (Fa-CI) parcelas, indicando o índice de combinação (IC) de valores para cada combinação de drogas. CI valores 1 indicam interações sinérgicas, valores 1 indicam interacções antagonistas e valores de CI = 1 indicam interacções aditivas.

imunoprecipitação FAK e in vitro de ensaio de cinase

Imunoprecipitação e quinase reacções foram realizadas como anteriormente descrito [32]. Resumidamente, quantidades iguais de lisado celular total (600 mg) foram imunoprecipitadas para FAK com anti FAK-anticorpo (BD Bioscience, Mississauga, ON) e 20 mL de /G sepharose contas de uma proteína (GE Healthcare, Uppala, Suécia) durante a rotação para 2 horas a 4 ° C. As pérolas foram então lavadas 3 vezes com NETN 200 mM (Tris-HCl a 20, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, 200 mM de NaCl, 0,5% de Igepal CA-630), seguido por uma lavagem em tampão de quinase (NAVO 0,25 mM

3, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaF 1 mM, β-glicerofosfato 10, ditiotreitol 1 mM, MgCl 15 mM

2). DMSO (controlo de veículo) ou FAK inibidor PF-228 a 1 uM ou 5 concentrações, em seguida, foram adicionados à reacção em 20 ul de tampão de quinase e incubadas durante 20 minutos a 30 ° C. O ensaio de cinase, em seguida, foi iniciada com 1 ul de [

32P] γATP (5 uCi /ul) e incubou-se durante 30 minutos a 30 ° C com agitação cada 10 minutos. A reacção foi terminada após a adição de tampão de amostra de SDS 4X. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 7,5% e transferido para membrana de PVDF. A membrana foi submetida a auto-radiografia para o desenvolvimento de eventos de fosforilação de FAK e sondada para os níveis totais de FAK por transferência de Western tal como descrito abaixo.

A citometria de fluxo

As células foram tratadas com controlo de solvente (DMSO), erlotinib , PF-228, ou ambos, erlotinib e PF-228 em meio contendo FBS a 5% durante 48 horas. Tanto as células não aderentes e aderentes foram recolhidas e combinadas, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em etanol a 70% para a permeabilização. As suspensões de células foram, em seguida, tratada com uma solução de iodeto de propídio (48 ug /mL de iodeto de propídio, 40 ug /ml de RNase A) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Um total de 1 x 10

4 células foram avaliadas por meio do fluxo da Beckman Coulter Epics XL citómetro (Beckman-Coulter, Mississauga, ON) e a percentagem de células apoptóticas foi calculada a partir de células com menos do que o conteúdo de ADN 2N utilizando fluxo de FCS expresso software de análise de citometria (de Novo software, Los Angeles, CA).

análise western blot

Após a extracção da proteína total, transferência de western foi realizada como previamente descrito [30]. Os anticorpos primários utilizados neste estudo eram como se segue: (Cat. # 9272) (. S473, Cat # 9271) de coelho anti-Akt, pAkt, LKB1 (Cat # D60C5.) e PARP anticorpos eram de celular (Cat # 9542). Signaling Technology (Danvers, MA), de ratinho anti-FAK (clone 77 /FAK) foi de BD Transduction Laboratories (Mississauga, ON), e anticorpo anti-actina β rato (clone AC-74) era da Sigma (St. Louis , MO). A seguir à incubação com o anticorpo primário durante a noite, as membranas foram lavadas 3 x 5 minutos e incubou-se em peroxidase de rábano (HRP) de cabra conjugado com anti-rato ou de cabra anti-coelho, o anticorpo secundário (Calbiochem, San Diego, CA) durante 1 hora. As membranas foram então lavadas 6 x 5 minutos e incubou-se em Immobilon Ocidental HRP quimioluminescente Substrato (Merck Millipore, Billerica, MA) antes do desenvolvimento da imagem utilizando o Sistema GeneGnome Bio Imaging and software GeneSnap (Syngene, Frederick, MD).

crescimento Colónia ensaio

Lab-Tek II lâminas de câmara 4 poços (Nalge Nunc International, Naperville, IL) foram revestidos com 100 ul de extracto de redução do factor de crescimento da membrana basal (BME; Trevigen, Gaithersburg, MD) que solidificou durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram então semeadas em BME a camada solidificada, a uma densidade de 5000 células /poço em meio contendo 10% de FBS e 2,5% de BME. Meio foi atualizado a cada três dias. tamanhos celular colónias foram determinados com o software ImageJ de um total de 4 imagens de cada um dos poços duplicados para cada experimento.

In vivo tumor crescimento

células cancerosas A549 pulmão (1 x 10

6) as células foram injectadas subcutaneamente em ambos os flancos traseiros direito e esquerdo de 6 semanas de idade ratinhos nus CD-1 (Charles River, Wilmington, MA). Os ratinhos foram alojados em condições específicas livres de agentes patogénicos, em 12 horas de luz /escuro com ciclo de alimentação ad libitum e água, para a duração da experiência. Três dias após a injecção, os ratinhos (4 ratinhos /tratamento) foram primeiro tratados por cânula oral com controlo de veículo, ou com o anteriormente demonstrado concentrações eficazes de erlotinib (50 ug /g) [33], PF-271 (50 ug /g) [ ,,,0],23], ou a combinação de ambos os fármacos em PBS com 5% Gelucire (controlo de veículo). Os fármacos foram então administradas por gavagem oral diária durante cinco dias consecutivos, seguido por dois dias sem tratamento e o processo foi então repetido para a duração da experiência. As medições do tamanho do tumor foram realizadas uma vez por semana, por medição de compasso de calibre e o volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: Volume do tumor = (largura)

2 x (comprimento) /2. Todos os experimentos com animais foram realizados e aprovados pela Universidade do Comitê Animal Care Ottawa e conformado com as diretrizes estabelecidas pela

Animais para o Canadian Council on Cuidados com Animais de Lei Research Comprar e

Guia para o Cuidado e Uso de Animais experimentais

(Vol. 1, 2ª ed., 1993), e atender aos padrões de prática nas disciplinas de ciência de animais de laboratório e com animais de laboratório medicina veterinária. De acordo com o protocolo aprovado, os animais foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical no pré-determinados pontos finais experimentais, incluindo a) a massa do tumor até ao ponto onde ele interfere significativamente com as funções corporais normais ou provoca dor, b) perda de peso corporal Consistente ou rápido superior a 20% do peso corporal c) ulceração /infecção no local do tumor (quebra de barreira da pele), e) carga do tumor . 10% do peso corporal do ratinho g) angústia respiratória grave ou h) sofrimento em ambulatório, por qualquer motivo

Ex vivo análise de tumor de pulmão

tumores NSCLC cirurgicamente ressecados e tecido pulmonar normal adjacente foram coletados após avaliação patológica de cinco pacientes que forneceram consentimento informado por escrito, conforme o protocolo aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa Ottawa Hospital ( Protocolo # 20120559-01H). As características dos pacientes estão descritos na Tabela 1. O tecido foi processado no mesmo dia para uso em

ex vivo

experiências. Um perfurador de biópsia (Miltex GmbH, Rietheim-Weilheim, Alemanha) foi utilizado para se obter 2 núcleos mm de diâmetro a partir de ambos os tecidos de tumor do pulmão e no tecido pulmonar normal e ainda seccionada em 1 mm de espessura com três fatias, em seguida, aleatoriamente distribuídas em poços em triplicado de uma 24 -bem placa de cultura de tecidos. fatias de tecido foram mantidas em DMEM suplementado com FBS a 10% e 100 U /solução de antibiótico /antimicótico ml (Gibco, Waltham, MA) a 37 ° C e 5% de CO

2. À medida que cada fatia de tecido não é necessariamente idêntico em termos da sua densidade celular ou a viabilidade no momento do isolamento, no dia a seguir ao isolamento, a viabilidade das fatias de tecido foi avaliada numa base por cavidade antes da adição do fármaco a seguir à incubação durante 4 horas com um 10 % de solução alamarBlue (ABD Serotec, Raleigh, NC). Pós leituras de tratamento de drogas foram então normalizados para essas leituras iniciais de viabilidade para cada poço. fatias de tecido foram tratados no dia a seguir ao isolamento ou com controlo de veículo (DMSO), erlotinib (10 uM), PF-271 (5 uM), ou a combinação de ambas as drogas durante 48 horas e a viabilidade celular foi então avaliada por solução alamarBlue 10% . A fluorescência foi medida (excitação 530 nm /emissão 590 nm) com um leitor de Fluoroskan Ascent fluorescência placa (Thermo Scientific, Rockford, IL) 4 horas após a adição de alamarBlue.

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). As comparações múltiplas foram realizadas pelo ANOVA enquanto comparações individuais foram realizadas pelo

t

testes de Student não pareado. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas como

P Art 0,05 a partir de um mínimo de dois experimentos realizados de forma independente.

Resultados

A inibição da FAK reduz a viabilidade celular em células NSCLC-resistentes TKI EGFR

A fim de avaliar a eficácia do tratamento -resistentes TKI de EGFR linhas celulares de NSCLC com FAK TKI, utilizou-se duas linhas de EGFR de tipo selvagem de células (A549, H1299) com a insensibilidade conhecida a EGFR TKI [34], bem como a linha celular mutante de EGFR H1975, com a resistência adquirida TKI de EGFR devido a uma mutação T790M no gene de EGFR [35]. Estes três linhas de células fornecida nos exemplos, assim, com razoáveis ​​para testar a eficácia da adição de um inibidor de tirosina-quinase de FAK para erlotinib, a fim de inibir de forma mais potente do crescimento de células NSCLC-resistentes TKI de EGFR.

o primeiro testado FAK inibidor PF-228 [36] e avaliados para a sua capacidade dependente da dose (0,001-25 uM) inibe o crescimento de linhas celulares de NSCLC

in vitro

. O tratamento de células com doses crescentes de PF-228 indicaram que todos os TKI resistente três linhas de células de EGFR (A549, H1299, H1975) foram sensíveis a esta droga em concentrações superiores a 1 uM (Fig 1A). valores de IC50 para PF-228 determinado a partir do gráfico foram: 5,6? M (R

2 = 0,92) em A549, 6,6 mM (R

2 = 0,95) em H1299 e 10,4 mM (R

2 = 0,80 ) em H1975. Curiosamente, a viabilidade das duas linhas de células de TKI de EGFR-sensíveis (HCC827, HCC4006) [34] era muito maior (~ 75% das restantes células viáveis ​​comparado com o controlo tratado) do que as linhas celulares resistentes a TKI EGFR (~ 10% de células restantes viáveis ​​comparado com o controlo tratado) na maior dose de PF-228 testada (25 pM) (Fig 1A), embora a razão para esta diferença na viabilidade ainda não é compreendido. Como as duas linhas de células que tinham resistência inerente ao erlotinib e foram ambos EGFR de tipo selvagem pareceu ser mais sensível ao inibidor de FAK do que as células H1975 que apresentavam mutações de EGFR resultando em sensibilidade adquirida, nós examinamos se a células inicialmente sensíveis ao erlotinib também se tornou mais sensíveis à FAK após a conquista da resistência aos medicamentos adquiridos. HCC4006 células que foram tornadas resistentes ao erlotinib seguinte passagens em série em concentrações crescentes de erlotinib até 3 um, resultou em clones celulares com significativamente menos sensibilidade para erlotinib com valores de IC50 de 1,3 uM (R

2 = 0,87) e 16,8 pM (R

2 = 0,73) para os clones resistentes 1 e 2, respectivamente, em comparação com células de controlo que foram passados ​​em série em volumes iguais de controlo de DMSO, com uma IC50 de 0,21 ^ M (R

2 = 0,91) (Figura 1B). Deve notar-se que ambos estes clones exibiram resistência erlotinib em níveis semelhantes ou superiores às linhas parentais resistentes escolhidos (com valores de IC50 variando de 1.2μM, 5.3μM 5.9μM e para A549, H1299 e H1975, respectivamente). Erlotinib células HCC4006 resistentes apresentaram um aumento da sensibilidade à FAK inibidores com valores de IC50 de 8,0 uM (R

2 = 0,96) e 8,7 uM (R

2 = 0,95) para os clones 1 e 2, respectivamente, comparado com o controlo clone HCC4006 com um IC50 de 12,3 uM (R

2 = 0,90) (Fig 1C). Enquanto clones celulares resistentes erlotinib mostrou aumento da sensibilidade à FAK inibidores, eles permaneceram menos sensível a PF-228, em comparação com EGFR de tipo selvagem A549 inerentemente resistente ao erlotinib ou H1299 células. Assim, é pouco provável que o principal mecanismo de resistência adquirida ao erlotinib em EGFR mutante NSCLC depende significativamente da actividade da FAK.

(A) a viabilidade celular foi avaliada após o tratamento com PF-228 em doses variadas durante 48 horas em completa meios de comunicação com 5% de FBS. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT com a viabilidade das células tratadas com DMSO estabelecida como 100%. Os dados indicam a média ± SEM para log [inibidor] vs resposta normalizada a partir de duas experiências realizadas independentemente. células (B) HCC4006 cultivadas em série em concentrações de erlotinib aumentando até 3 uM foram confirmados resistente em comparação com as células parentais seguintes ensaio MTT de células tratadas com concentrações crescentes de erlotinib. Os dados são representados graficamente como a média de log [inibidor] vs resposta normalizada ± EPM (N = 2). células (C) erlotinib HCC4006 resistente são mais sensíveis ao inibidor de FAK PF-228 do que as células parentais HCC4006. As células foram tratadas com concentrações crescentes de PF-228 e a viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT. Os dados são apresentados como a média do log [inibidor] vs resposta normalizada ± EPM (N = 2). (D) a expressão da proteína relativa entre erlotinib resistente (A549, H1299, H1975) e sensível (HCC827, HCC4006) linhas celulares parentais. (E) Os lisados ​​de células A549 foram imunoprecipitados por FAK endógena e submetido a

In vitro

ensaios de quinase, na presença de quer DMSO (controlo de veículo) ou FP-228 (1 uM ou 5 uM). Autoradiografia revelou fosforilação de FAK (FAK AUTORAD) e western blot indicaram níveis totais de FAK (IB: FAK).

Também avaliamos se a sensibilidade à FAK inibidores observados nas linhas de células NSCLC dos pais foi associado com expressão basal das principais proteínas nessas vias fármaco alvo. A sensibilidade à droga FAK não pareceu correlacionar-se com os níveis globais de FAK, EGFR ou proteínas b1 integrina, uma vez que estes níveis apareceu variável em ambas as linhas de células sensíveis e insensíveis (Figura 1D). Dado que as linhas celulares de NSCLC resistentes-TKI três EGFR tinham valores de IC50 para a FP-228 que varia de 5 a 10 um, e que o nosso laboratório tinha anteriormente observada inibição de tanto a actividade autofosforilação e quinase de FAK em 5 uM PF-228 [20] , que confirmou a actividade deste inibidor em células A549 seguinte

in vitro

ensaios de quinase de FAK autofosforilação. A adição de PF-228 para a reacção da cinase FAK inibiu significativamente a autofosforilação em células A549 (Figura 1E) com resultados semelhantes sendo observada em linhagens de células H1299 e H1975 (dados não mostrados). Assim, as experiências subsequentes foram realizadas utilizando concentrações de PF-228 na gama de 1-10? M.

inibidor de FAK PF-228 sinergiza com erlotinib para reduzir mais eficazmente a viabilidade das células em células do tipo selvagem NSCLC EGFR

como o tratamento com FAK TKI sozinha pareceu inibir a viabilidade das células NSCLC-resistentes TKI de EGFR testados na figura 1, o próximo queria para determinar se a adição de PF-228 poderia sensibilizar as células a erlotinib, ou pelo menos , resultar em uma redução na viabilidade das células aditivo acima e para além de que o tratamento apenas com erlotinib. As células foram assim tratados com erlotinib (1-25 | iM) ou FP-228 (1-10 ^ M) sozinho e em combinação e a viabilidade celular foi avaliada pela actividade de MTT. Todas as três linhas celulares testadas exibiram resistência a erlotinib sozinho, mesmo a concentrações muito elevadas (isto é, 25 uM, Fig 2A) confirmando os resultados de estudos anteriores sobre o EGFR resistência TKI em ambos o EGFR de tipo selvagem e linhas celulares contendo mutação T790M [34, 35,37-39]. Quando erlotinib e PF-228 foram utilizados em combinação foi observado um efeito citotóxico aumentou em A549, H1299 e H1975 células como tínhamos hipótese (Fig 2A). O método de Chou-Talalay foi usada para determinar a natureza do efeito da combinação de drogas [31]. O índice de combinação (CI) foi determinada por meio de plotagem a fração afetada, onde CI valores menores que 1 são considerados sinérgica, CI valores maiores que 1 são considerados antagônicos, e os valores IC iguais a 1 são considerados aditivos. A combinação de erlotinib e PF-228 resultando numa reduzida viabilidade das células foi encontrado para ser sinérgica em todas as três linhas celulares testadas (Fig 2B). Como um sistema secundário que empregue o uso de explantes de cancro do pulmão humanas tumorais do paciente para testar a eficácia da FAK TKI em células de cancro de pulmão. explantes de tumores de pacientes não selecionados submetidos à toracotomia para o câncer de pulmão em estágio iniciais foram tratados

in vitro

com erlotinib ou FAK TKI isoladamente ou em combinação. O tratamento do tumor pulmonar explantado com erlotinib isoladamente demonstrou um decréscimo modesto, mas não estatisticamente significativa na viabilidade celular (figura 2C, painel esquerdo). Foram também observadas reduções similares modestas de viabilidade celular em tecidos pulmonares normais adjacentes seguintes erlotinib isoladamente (Figura 2C, painel da direita). Observou-se que os cancros do pulmão do paciente também foram sensíveis à inibição da FAK TKI com uma tendência para a inibição mais eficaz quando usado em combinação com erlotinib (Fig 2C). Apesar do pequeno tamanho da amostra e da variabilidade associada com os testes em tecidos heterogêneos (ou seja, diferentes proporções de tumor de estroma pode ocorrer em cada amostra), fomos encorajados pela vantagem óbvia da combinação de drogas mais erlotinib sozinho, semelhante ao que observamos nas nossas experiências linha celular. De importância adicional, o tecido de pulmão normal adjacente pareceu ser afectada pela FAK TKI tratamentos isolados ou em combinação com erlotinib (Figura 2C), o que sugere um potencial de inibição selectiva de tumores NSCLC.

(A) células foram tratadas com PF -228 e erlotinib durante 48 horas e ensaiadas quanto à viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT. Os dados indicam a média ± SEM para a viabilidade celular apresentados como uma percentagem de células tratadas com DMSO de controlo (100% viável) a partir de duas experiências realizadas independentemente. (B) O índice de Fracção afectada /combinação (CI) parcelas, indicando a citotoxicidade sinérgica de erlotinib e PF-228. IC 1 são considerados sinérgica, IC 1 são considerados antagonistas, e cis = 1 são considerados aditivo. (C) FAK inibição reduz a viabilidade das células no tecido do tumor de pulmão humano, mas não tecido pulmonar normal

ex vivo

. Os tecidos de cinco pacientes não seleccionados foram tratadas durante 48 horas com o controlo de veículo (DMSO), erlotinib (10 uM), PF-271 (5 uM), ou a combinação de erlotinib e PF-271. A viabilidade celular foi avaliada tanto para o tecido tumoral e tecido normal por alamarBlue a partir de três poços por condição com cada uma das cavidades contendo três 1 mm x 2 mm pedaços de tecido. A fluorescência foi normalizada para as leituras de fluorescência de linha de base para cada tratamento medicamentoso antes bem feita. A experimentação foi realizada de forma independente em cada amostra fluorescência média é indicado para cada condição como uma linha horizontal e diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por análise de variância e indicado como

P

valores acima da comparação.

a fim de determinar se o decréscimo observado na viabilidade celular está relacionada com um aumento do nível de apoptose em células tratadas, foi analisada a população SubG1 de células após o tratamento com qualquer um erlotinib ou PF-228 sozinho ou em combinação com coloração com iodeto de propidio de conteúdo de DNA e análise de citometria de fluxo. Nas células A549, o tratamento de combinação de erlotinib e PF-228 (5 tratamento fiM) resultou num aumento estatisticamente significativo na população SubG1 de células comparado com o controlo (aumento de ~ 6 vezes), para além de exibir um aumento significativo na percentagem de células em comparação com SubG1 tanto o erlotinib isoladamente (

P

0,001) e tratamento da FP-228 sozinho (

P

0,001) (Figura 3A).