Abstract

rearranjo genético do

ROS1

receptor tirosina quinase foi recentemente identificado como uma assinatura molecular distinta para o cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC). No entanto, a evidência direta da carcinogênese pulmonar induzida por

ROS1

genes de fusão continua a ser verificada. O presente estudo mostra que

EZR-ROS1

desempenha um papel essencial na oncogênese do NSCLC abrigando o gene de fusão.

EZR-ROS1

foi identificada em quatro pacientes do sexo feminino de adenocarcinoma de pulmão. Três deles nunca eram fumantes. deleção intersticial do 6q22-q25 resultou na fusão de genes. A expressão da quinase de fusão em células NIH3T3 induzida crescimento independente de ancoragem

In vitro

, e tumores subcutâneos em ratinhos nus. Esta capacidade transformando era atribuível à sua actividade quinase. A ALK /MET /ROS1 inibidor de quinase, crizotinibe, suprimiu o crescimento independente de ancoragem induzida por fusão de células NIH3T3. Mais importante ainda, linhagens de camundongos transgênicos criados especificamente expressam EZR-ROS1 no pulmão células epiteliais alveolares desenvolvido múltiplos nódulos de adenocarcinoma em ambos os pulmões em uma idade precoce. Estes dados sugerem que o

EZR-ROS1

é um oncogene fundamental no NSCLC humana, e que este modelo animal pode ser valiosa para explorar agentes terapêuticos contra o

ROS1

-rearranged câncer de pulmão.

Citation: Arai Y, Totoki Y, Takahashi H, Nakamura H, Hama N, Kohno T, et al. (2013) Modelo rato para ROS1-Rearranjado câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (2): e56010. doi: 10.1371 /journal.pone.0056010

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de outubro de 2012; Aceito: 04 de janeiro de 2013; Publicação: 13 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Arai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Biomedical Inovação, Câncer Centro Nacional de Pesquisa e Fundos de Desenvolvimento (23-a-7 e 23-B-28), Research Grant do Cancer Research princesa Takamatsu Fundo e Grants-in-Aid do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar para o 3º prazo abrangente estratégia de 10 anos de Controle do Câncer. National Cancer Center Biobank é apoiado pelo Fundo de Investigação e Desenvolvimento Cancer Center Nacional, Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. Adenocarcinoma pulmonar (LADC), a forma mais comum de câncer de pulmão de células não pequenas-(NSCLC), compreende vários subgrupos genômicas diferentes definidos por alterações oncogênicos únicas, e uma proporção considerável de casos LADC abrigar alterações driver no

EGFR, KRAS Comprar e

ALK

genes na forma mutuamente exclusiva com raras exceções [2] – [5]. Compreender a base molecular do câncer nos permite desenvolver agentes terapêuticos que visam aberrações druggable genéticas identificadas em genomas do câncer. Os inibidores de tirosina cinase (TKI) que têm como alvo as proteínas de EGFR e alq são particularmente eficazes no tratamento de realização LADC

EGFR

mutações e

ALK

fusões, respectivamente [2] – [6]. No entanto, o desenvolvimento de um inibidor da tirosina quinase eficaz requer validação experimental das aberrações genéticas como accionável e druggable. modelos de ratos transgénicos portadores

EGFR

mutações ou

EML4-ALK

fusões de genes demonstraram com sucesso o potencial oncogênico das alterações e a eficácia da terapia TKI [7], [8]. rearranjo genético do

ROS1

foi recentemente identificada como uma assinatura molecular distinta para LADC humana [9] – [16]. No presente estudo, nós estabelecemos um modelo de mouse

ROS1

de fusão, e mostrou que

EZR-ROS1

como um oncogene motor essencial na carcinogênese de pulmão.

Resultados

Identificação do gene de fusão EZR-ROS1 em LADC de Never-fumantes

Whole transcriptoma high-throughput seqüenciamento dos fragmentos tumorais é um dos métodos mais eficazes para a identificação de oncogenes de fusão [17]. Análise de cinco casos LADC de nunca fumaram sem

EGFR /KRAS /ALK

alterações utilizando sequenciamento do transcriptoma identificados 56 lê substituindo o em-frame

EZR-ROS1

ponto de fusão de genes que liga

EZR

exão 10 a

ROS1

exon 34 em um tumor. A análise de RT-PCR de tecidos não-cancerosas correspondentes confirmaram a expressão específica de tumor do transcrito de fusão (Figura 1A). Além disso, transcriptoma sequenciamento demonstrou claramente um aumento específico na expressão da “porção fundida 3 de

ROS1

(exons 34 a 43), após o ponto de interrupção, o que sugere que o

EZR-ROS1

fusão transcrito faz com que a sobre-expressão aberrante de

ROS1

domínio da tirosina quinase juntamente com a porção 5 ‘de

EZR

(Figura 1B). dados de matriz SNP comparativos hibridação genómica (matriz CGH) mostraram que esse gene de fusão foi gerado por uma grande deleção intersticial abrangendo ~41.5 Mb no cromossoma 6q22-q25 (Figura 1C). Genomic PCR e análise de sequenciação revelou também a eliminação de 41,5 Mb causando fusões somáticas do

EZR

intron 10 em 6q25 com o

ROS1

intron 33 em 6q22 (Figura S1).

(A) junção lê representando

EZR-ROS1

transcrições de fusão em amostra LCY66T (esquerda). Sanger de sequenciação do produto de RT-PCR validado transcrição específico de tumores em grelha de fusão (à direita). m: marcador molecular. perfis (B) a expressão de

EZR

e

ROS1

em LCY66T. expressão ativa do gene

ROS1

foi observada após o ponto de fusão. (C) SNP matriz análise de CGH do LCY66T. número de cópias em todo cromossomo 6 é representada como a razão log2.

RT-PCR e Sanger análise de sequenciação de 569 espécimes LADC de indivíduos japoneses, incluindo os casos acima mencionados (343 casos com estágio patológico precoce e 226 casos com estágio avançado), identificou quatro casos que abrigam esta transcrição de fusão (figura S2). Todos os quatro

EZR-ROS1

casos de fusão-positivos eram do sexo feminino, e abrigava nem

EGFR

/

KRAS /HER2

mutações nem

EML4-ALK /KIF5B-RET

fusões. Três casos foram adenocarcinomas pouco diferenciados de não fumantes, e o outro era um adenocarcinoma moderadamente diferenciado de um fumante.

Transformar Atividade de EZR-ROS1

EZR-ROS1

cDNA isolado a partir da amostra de tumor codificado uma proteína de 858 aminoácidos (Figura 2a; número de acesso GenBank /DDBJ AB698667). A proteína liga o domínio FERM [18] de ezrina (EZR) com os domínios de transmembrana e quinase de ROS1, mas não tem a maioria do domínio de filamento helicoidal do EZR.

(A) Representação esquemática de EZR, ROS1 , EZR-ROS1 e exclusões /mutações de genes EZR-ROS1. A organização de domínio é exibido. C-C: domínio de hélice enrolada; TM: transmembranar; C-ERMAD: ERM C-terminal de domínio associado. (B) a fosforilação ROS1 no tipo selvagem e mutante EZR-ROS1 (E /R) -expressing clones NIH3T3. Os lisados ​​celulares a partir de cada clone foram coradas imunologicamente com anti-V5-tag (em cima) e anti-fosforilado ROS1 anticorpos (Tyr-2274, parte inferior). (C) Supressão de ROS 1 actividade de cinase de EZR-ROS1 por crizotinib inibe a ativação STAT3. As células NIH3T3 transfectadas com 1: Vector vazio, 2: de tipo selvagem EZR-ROS1, 3: KD 4: DL1, 5: DL3 foram privadas de soro e tratadas durante 2 horas com DMSO ou 1 uM de crizotinibe, e coradas imunologicamente com os anticorpos relevantes . β-actina foi utilizado como um controlo de carga. E /R: EZR-ROS1, p-E /R: fosforilada EZR-ROS1 detectado com um anticorpo anti-fosfotirosina 2274 de ROS1. (D) de ágar macio a formação de colónias de tipo selvagem e mutante EZR-ROS1 expressar clones de NIH3T3. Uma imagem representativa de formação de colónias para cada clone é traçada na parte superior (barra de escala, 100 uM). O número de colónias obtidas para cada clone é traçada na parte inferior. * P 0,05. supressão do crescimento independente de ancoragem de células NIH3T3 que expressam EZR-ROS1 (E) Crizotinibe-induzida. Gráfico de barras mostrando a percentagem de colónias NIH3T3 induzidas por

EZR-ROS1

ou

CCDC6-RET

após o tratamento com 200 nM de crizotinibe ou vandetanibe com respeito aos formados por células tratadas com DMSO. EZ-ROS: EZR-ROS1, C6-RET: CCDC6-RET. * P 0,05. (M) representativos de imagens de ratinhos transplantados subcutaneamente com células NIH3T3 que expressam o tipo selvagem, cinase do domínio mutado, ou amino-terminal delecionado EZR-ROS1. Um clone de células NIH3T3 EML4-ALK-expressando foi usada como um controlo positivo. O número de tumores por injecção em cada transfectante é mostrado abaixo as fotografias.

Para examinar a actividade oncogénica do

EZR-ROS1

fusão

in vitro

, estabelecemos clones de NIH3T3 estáveis ​​que expressam o tipo selvagem EZR-ROS1 e cinase morta mutante EZR-ROS1 (KD), em que o resíduo de lisina de ligação de ATP foi mutado para metionina (K491M), bem como mutantes com amino-terminal suprimido em série domínios FERM (DL1, DL2 e DL3; Figura 2A). A autofosforilação dos resíduos de tirosina específicos é um acontecimento essencial na activação de vias de transdução de sinal distintos, e Tyr-2274 de ROS1 é um local específico autofosforilação essencial para induzir a actividade de quinase para a transformação [19]. Em ensaios de transformação, a fosforilação da Tyr-2274 (correspondendo a Tyr-785 na fusão Tipo EZR-ROS1 selvagem) foi observada em um de tipo selvagem EZR-ROS1-clone de expressão, mas não foi detectada em cinase morta (KD) e apagados (DL) mutantes; isto implica que a porção amino-terminal de FERM (1-88 aminoácidos) é necessário para a activação da cinase ROS1 (Figura 2B). De tipo selvagem

EZR-ROS1

mas não KD mutantes /dl induzida especificamente a activação da STAT3 para a sinalização a jusante, e produziu um crescimento significativamente ancoragem-independente (Figura 2C, D). O crescimento independente de ancoragem induzida por

EZR-ROS1

foi suprimido por tratamento com crizotinibe, um inibidor da tirosina quinase ALK contra /MET /ROS1, ao passo que o crescimento induzido por outro oncogene do pulmão,

CCDC6-RET

[11] não foi (Figura 2E). Pelo contrário, vandetanibe, um inibidor da tirosina quinase RET contra EGFR //VEGFR foi eficaz na inibição da formação de colónias de CCDC6-RET células que expressam, mas não nas células que expressam EZR-ROS1. Tal como mostrado na Figura 2C, o tratamento crizotinibe suprimida fosforilação de EZR-ROS1, e inibem a activação da STAT3.

Em seguida, as células NIH3T3 foram injectados subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos. Do tipo selvagem EZR-ROS1 expressando clones tumores invariavelmente produzidos (6/6), enquanto nenhum dos KD e DL mutantes que expressam clones produzidos tumores (Figura 2F), confirmando que

in vivo

actividade tumorigénica de

EZR-ROS1

requer uma atividade ROS1 quinase.

Desenvolvimento de LADC em Ratos EZR-ROS1 transgênicas

Para avaliar melhor o papel da

EZR-ROS1

em carcinogénese pulmão, geramos ratinhos transgénicos que expressam o gene de fusão sob o controlo de um promotor específico do tipo 2-alveolar epitélio gene surfactante C [20] (Figura 3A). Obtivemos quatro linhas independentes (TGA, B, C e D) com diferente número de cópias do transgene (Figura S3) e detectados nódulos adenocarcinoma pulmonar em todas as linhas examinadas, exceto TGD. Análise do nível de expressão da proteína de fusão entre eles revelaram nenhuma expressão no TGD (Figura S4). A taxa de natalidade de progênies transgene-positivos foi baixa em TGC (Transgene positivo número F1 progênie: número total F1; 1:03), e nós não conseguiu manter-se uma linha de TGC, em seguida, analisamos principalmente uma linha (TGA), que abriga cerca de quatro cópias do transgene. análise de imunotransf erência de RT-PCR e verificou

EZR-ROS1

expressão de ARNm e proteína específica do pulmão, e indicada a fosforilação da proteína de fusão EZR-ROS1 (Figura 3B). Embora endógena

Ezrin

foi ubiquamente expressa em muitos tecidos, endógena

Ros1

-transcript foi detectada apenas no estômago, rim e pulmão. os níveis de expressão da proteína endógena ROS1 eram muito fracas em comparação com os níveis de fusão do gene em ratinhos transgénicos (Figura S4). Mesmo nas quatro semanas de idade lesões, múltiplos mais de 1 mm de diâmetro foram detectados nos ratinhos transgénicos e tumores ocuparam mais de 40% da superfície em corte de pulmão (Figura 3C e Figura S5). exame de tomografia computadorizada detectou múltiplos nódulos em ambos os pulmões, e os ratos mostraram sobrevivência reduzida (Figura 3D, E). O exame histológico dos tumores de pulmão nas linhas de camundongos transgênicos em geral demonstrado adenocarcinomas com padrão papilar /crescimento lepídico (Figura 3C). Estas lesões mostraram ser adenocarcinomas invasivos com actividade mitótica moderada como revelado por positiva Ki-67 de coloração (Figura S6A). No entanto, em alguns casos de linhas TGB, observou-se acumulação de mucina citoplasmática em células de tumor (Figura S6B).

(A) Representação esquemática da

SP-C /EZR-ROS1 /poliA

transgene. (B) A expressão do

gene EZR-ROS1

exógena em camundongos transgênicos. RT-PCR (topo) e análise de imunotransferência (inferior) de tecidos de ratinho revelaram que EZR-ROS1 foi especificamente expresso nos pulmões dos dois ratinhos transgénicos (TgA21 e TgA25). HT: coração, LV: fígado, ST: estômago, SP: baço, KD: rim, LG: pulmão (C) análise histológica Representante de lesões pulmonares em ratinhos transgénicos. coloração com Hematoxilina-eosina mostra lesões difundida em ambos os ratinhos de fusão-positiva 4 semanas de idade e 15 semanas de idade. Tg: fusion-positivo, CR: fusion-negativo. barra de escala, 100 mm. Foram detectados (D) Tomografia computadorizada (à esquerda) dos pulmões em rato TgA04 na semana 19. lesões avançadas em ambos os pulmões. lesões nodulares múltiplas (à direita) foram observadas na superfície pleural do pulmão em TgC01 do mouse na necropsia. curvas (E) de sobrevivência para ratinhos transgénicos e de controlo gerado pelo método de Kaplan-Meier.

Apesar da presença de múltiplos tumores nos pulmões dos ratos transgénicos, que não conseguiu detectar metástases à distância na necropsia em TGA, B e C ratos. Assim, é provável que a expressão de

EZR-ROS1

por si só não é suficiente para tornar as células cancerosas metastático.

Discussão

O presente estudo identificou

EZR- ROS1

como um oncogene condutor central na carcinogénese do pulmão. Ezrin é expressa ubiquamente em muitos tecidos. Na

EZR-ROS1

fusão detectada por sequenciamento RNA de casos LADC, 5 ‘parte do

EZR

faz com que a sobre-expressão aberrante do domínio quinase de

ROS1

. Nenhum efeito evidente para os níveis de transcrição de a porção 3 ‘

foi observada EZR

. Isso pode ser imputável ao excesso de expressão do tipo selvagem

EZR

sobre o gene de fusão. Nós também revelado que a activação da cinase ROS1 nessa fusão requer o domínio FERM N-terminal de EZR. FERM associados com muitas proteínas diferentes, incluindo fosfolípidos, as proteínas de andaimes EBP50 e E3KARP, e outras proteínas associadas a membranas que podem regular a dimerização ou oligomerização de ezrina [21]. Muitas proteínas de fusão de cinase, incluindo ALK e Ret, apresentam actividade de tirosina quinase constitutiva atribuível aos domínios de dimerização do parceiro de fusão do terminal amino [6], [22]. No entanto, uma outra proteína de fusão ROS1, Fig-ROS1, que é encontrada no glioblastoma humano, colangiocarcinoma e adenocarcinoma do pulmão, não apresentou propriedades de dimerização, em vez existente como um monómero na proteína de fusão, apesar retendo os domínios em espiral espiralada e um fecho de leucina [19 ]. Portanto, os mecanismos moleculares subjacentes à activação ROS1 pelo domínio FERM permanece obscuro.

Os ratinhos transgénicos mostraram um surgimento de múltiplos nódulos de adenocarcinoma em um ponto de início e a progressão rápida dos tumores. Estas características são muito semelhantes ao

EML4-ALK modelo

rato [8]. Vários grupos relataram que o padrão cribriform mucinoso e celular anel de sinete são características histológicas características de E

ML4-ALK

cancro do pulmão humano positivo [23] – [25]. Recentemente, nós investigamos histopatologia do

ROS1

-fusion cancros do pulmão humanas positivas [16]. Embora outros pesquisadores relataram que o recurso de células anel de sinete não era comum em

ROS1

-rearranged cancros do pulmão [10], descobrimos que 53% dos casos abrigava cribriform mucinoso ou célula anel de sinete características semelhantes ao

ALK

cancros do pulmão -rearranged mas que o resto mostrou /padrão de crescimento lepídico papilar.

EZR-ROS1

tumores -positivas parecia menos bem diferenciado, e mostrou mais frequentemente características histológicas de cribriform mucinoso ou células em anel de sinete. Nosso modelo de mouse

EZR-ROS1

câncer de pulmão geralmente papilar demonstrou /padrão de crescimento lepídico, mas em alguns casos, observou-se acúmulo de mucina citoplasmática em células tumorais, que muito se assemelha à histologia característica relatada em

ROS1

câncer de pulmão -rearranged. De momento não temos nenhuma resposta por que apenas uma parte dos ratos abrigava tumores com a acumulação de mucina.

O

gene de fusão EZR-ROS1

foi especificamente detectado em amostras de câncer de pulmão de mulheres que nunca fumaram, sem

EGFR, KRAS,

e

ALK

alterações. Estima-se que ~ 2% dos pacientes em Branco e coortes de câncer de pulmão asiática teve

ROS1

-rearrangements, que ocorrem a taxas significativamente mais elevadas em não-fumadores, indivíduos mais jovens, do sexo feminino [10], [11], [16]. Embora cada alteração é pouco frequente,

ROS1

fusões com muitos tipos de 5 genes “parceiro (

CCDC6, CD74, Esdras, FIG, KDELR2, LRIG3, SDC4, SLC34A2 e TPM3

) foram relatados no pulmão, cérebro, do tracto biliar, cancro do ovário e [9] – [16], [26] – [28]. Estas

ROS1

-rearranged tumores pode ser alvo terapeuticamente com inibidores de quinase específicos, incluindo crizotinibe [10], [14], [27], [29]. Dois pacientes LADC tiveram uma resposta clínica notável para Crizotinibe [10], [14]. Assim, o nosso

EZR-ROS1

modelo animal do cancro do pulmão pode ser valiosa para avaliar o potencial terapêutico destes compostos e novos medicamentos, bem como características biológicas de

ROS1

-rearranged câncer de pulmão

in vivo

.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

as amostras de tecido de pacientes com câncer de pulmão foram fornecidos pelo Cancer Center Biobank Nacional, Japão. DNA genómico de alto peso molecular e de RNA foram extraídos a partir de amostras tumorais congelados frescos e tecidos pulmonares não-cancerosas. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Nacional do Câncer, Tóquio, Japão.

A análise dos dados de seqüência Whole-transcriptoma

bibliotecas de cDNA Insert (150-200 pb) foram preparados a partir de 2 ug de ARN total utilizando o kit de preparação de amostra mRNAseq (Ilumina). As bibliotecas foram submetidas a sequenciação-emparelhado final de 50 pb na HiSeq2000 (Ilumina), de acordo com as instruções do fabricante. Emparelhados-fim leituras foram mapeados para sequências de ARN conhecidos na RefSeq, bases de dados Ensembl, e LincRNA utilizando o programa de Bowtie como descrito anteriormente [30].

RT-PCR, PCR genómico e Sequenciação

O ARN total foi transcrito reverso-em ADNc utilizando Superscript III (Life Technologies). ADNc ou ADN genómico foi sujeito a amplificação por PCR utilizando Ex Taq-(Takara Bio) e iniciadores EZR-E10-CF1 (GAAAAGGAGAGAAACCGTGGAG) e ROS1-E34-CR1 (TCAGTGGGATTGTAACAACCAG). Os produtos de PCR foram sequenciados directamente pelo seqüenciamento Sanger usando o kit terminador BigDye (Life Technologies).

SNP array CGH Análise

cromossômica número de tumores foi determinado utilizando matrizes de alta resolução SNP copiar ( matriz GeneChip Mapping 250K-Nsp, Affymetrix). O ADN genómico foi marcado e hibridado com as matrizes de SNP de acordo com as instruções do fabricante, e copiar números foram calculados a partir dos sinais de hibridação, utilizando o programa de CNAG [31].

vector de clonagem, e a geração de deleção e mutantes Ponto

A região codificante de

ADNc EZR-ROS1

foi obtido por amplificação por PCR a partir de ADNc de tumor LCY66 Phusion utilizando Taq polimerase (New England Biolabs) e os iniciadores EZR-H1F1 (CACCATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTT) e ROS1-H1R1 ( ATCAGACCCATCTCCATATCCACTGTG).

EML4-ALK

cDNA e

cDNA CCDC6-RET

foram amplificados a partir de um

EML4-ALK

-positivo amostra de câncer de pulmão primário (E13; A20) e de um

CCDC6-RET

amostra -positivo primária do cancro do pulmão (C1; R12), respectivamente. Os produtos de PCR foram subclonados em um pcDNA3.1D-V5-His plasmídeo (Life Technologies). A substituição de lisina com metionina no codão 491 do gene

EZR-ROS1

foi realizada utilizando um kit de mutagénese dirigida ao local Primestar (Takara Bio). mutantes de deleção N-terminal do domínio FERM de

ADNc EZR-ROS1

foram construídos por PCR utilizando os iniciadores EZR-FERM-AF (CACCATGGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATC) e ROS1-H1R1 para DL1, EZR-FERM-BF (CACCATGATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAG) e ROS1-H1R1 para DL2 e EZR-FERM-CF (CACCATGACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGC) e ROS1-H1R1 para DL3. Os plasmídeos foram transfectados em células NIH3T3 utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Life Technologies), e os clones estáveis ​​foram isolados por selecção com G418 (0,7 mg /ml). Para o ensaio de formação de colónia, as células foram embebidos e cultivadas em agar mole de 0,4%, em triplicado, e o número de colónias foi contado após 21 dias. A quantificação do crescimento independente de ancoragem sob a condição de, com ou sem crizotinibe (S1068, Selleck) e vandetanibe (S1046, Selleck) após 9 dias foi realizado com 96 CytoSelect-kit (Cell Biolabs). A solução do composto foi adicionado à camada de topo de ágar macio a cada 3 dias.

A análise de imunotransferência

lisados ​​de células completas foram extraídas com reagente CelLytic M (# C2978, Sigma), e sujeitos a SDS -Página seguido de blotting sobre uma membrana de PVDF. A detecção de Western blot foi realizada com o kit WesternBreeze quimioluminescente imunodetecção (Life Technologies) utilizando anticorpos primários contra ROS1 (# 9202, Cell Signaling Technology), fosforilado-ROS1 (Tyr2274) (# 3078, Cell Signaling Technology), a STAT3 (# 610189, BD), fosforilada-STAT3 (Tyr705) (# 9138, Cell Signaling Technology), p44 /42 MAPK (# 4695, Cell Signaling Technology), fosforilada-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 9106, Cell Signaling Technology) , Ezrin (# 4135, Cell Signaling Technology), p53 (# 6243, Santa Cruz), e b-actina (# A5441, Sigma).

Supressão de ROS 1 Kinase Atividade de EZR-ROS1 por Crizotinibe

células transfectadas NIH3T3 (vector vazio, do tipo selvagem EZR-ROS1, mutantes KD /dL) foram privadas de soro durante 2 h, em seguida, adicionada, durante 2 h com 1% de DMSO ou crizotinibe 1 uM, em seguida, o meio de cultura eram mudado com meio padrão de 10% de FBS durante 10 min. lisados ​​de células inteiras foram submetidos a immunoblot análise.

Ratos subcutânea Transplantation em imunocomprometidos

Um total de 1 × 10

6 células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus (BALB /c- nu /nu, CLEA Japan). Os ratinhos foram monitorizados diariamente para a formação de tumores. Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação da comissão de ética de animais do Centro Nacional do Câncer.

Geração e Exame de

EZR-ROS1

ratinhos transgénicos

com etiquetas FLAG-

cDNA EZR-ROS1

foi subclonado em um

SPC-iNOS

plasmídeo (fornecido pelo Dr. Hagiwara), que incluiu uma

SPC

promotor e um sinal de poliadenilação, substituindo o

iNOS

fragmento com o cDNA. A cassete de expressão com o

SPC

promotor foi excisado a partir da construção e injectado em embriões de fase pronuclear-C57BL /6J (Unitech Japão). O número de cópias do transgene foi determinada por análise Southern blot de ADN a partir das caudas dos animais. As linhas transgénicas foram mantidas por retrocruzamento de ratos C57BL /6. RNA total foi isolado a partir dos órgãos de camundongos transgênicos e submetidos à análise de RT-PCR para detectar

EZR-ROS1

, endógena

Ros1

, endógena

Ezrin

e

GAPDH

mRNAs. Para detectar a proteína EZR-ROS1, ROS1 endógena e Ezrin em tecidos, homogenatos lisadas foram submetidas a análise de immunoblot utilizando anticorpos anti-ROS1, anti-Ezrin e anticorpos anti-β-actina. Exame de tumores pulmonares em animais vivos foi realizada com um aparelho de tomografia computadorizada de raios-X (explorar micro-CT, GE Healthcare). tecidos pulmonares foram fixados em 10% formalina e embebidos em parafina. coloração Hematoxilina-Eosina e imunohistoquímica para Ki67 foi realizada como descrito anteriormente [32].

Informações de Apoio

Figura S1.

Detecção de

EZR-ROS1

junção breakpoint genômica. Electrofograma para Sanger seqüenciamento de fragmentos genômicos englobando o

EZR-ROS1

junção ponto de interrupção de tumor LCY66. produtos Genomic PCR amplificados pelos iniciadores EZR-e10-CF1 e ROS1-E34-CR1 foram directamente sequenciados utilizando o iniciador EZR-e10-CF1. Números acima da electrofograma indicar a posição genômica no cromossomo 6 (genoma humano construir 37,3). Um fragmento genômico de 35 pb do

EZR

intron 10 foi invertida dentro do intron antes da fusão para

ROS1

intron 33.

doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s001

(PDF)

Figura S2.

detecção de transcritos de genes de fusão em amostras clínicas por RT-PCR. Os resultados de RT-PCR representativos que mostram casos de fusão-positivas e de fusão-negativos utilizando os iniciadores EZR-e10-CF1 e ROS1-E34-CR1. M: marcador molecular, NC: controle negativo. RT-PCR para o tipo selvagem

EZR

transcrição (primers EZR-e4-CF1 e EZR-e7-CR1) e para

GAPDH

(primers para GAPDH-F e GAPDH-R) é . também mostrado

doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s002

(PDF)

Figura S3.

Cópia de análise de número do transgene nos ratinhos transgénicos. O ADN genómico foi isolado a partir das caudas de ratinhos transgénicos gerados a partir pronuclear de fase C57BL /6J embriões. Este ADNg foi então sujeito a análise de mancha de Southern com um fragmento promotor SPC amplificado por PCR de 464 pb, gerado utilizando iniciadores de SPC-Pro-F e CPS-Pro-R, como uma sonda. As amostras de controlo à direita eram compostas de DNA genómico de ratinho com as cópias indicada do transgene por genoma diplóide. Os números de identificação dos ratos positivos para o transgene são mostrados no topo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s003

(PDF)

Figura S4.

expressão dos genes em ratinhos transgénicos. Expressão dos genes indicados no lado esquerdo foi investigada por análise de imunotransferência de RT-PCR ou. Em RT-PCR, os ciclos de PCR para amplificar genes alvo foram indicados no lado direito. Ezrin mostraram expressão endógena onipresente, no entanto expressão Ros1 endógena foi baixa. Nenhuma expressão de proteína de fusão EZR-ROS1 foi detectada em ratinhos de linha TGD (*). SW480 foi utilizado como um controlo negativo para a expressão de fusão. HT: coração, LV: fígado, ST: estômago, SP: baço, KD: rim, LG:. Pulmão

doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s004

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Figura S5. o desenvolvimento do tumor

pulmão em ratinhos transgénicos. tecidos pulmonares de camundongos TGA foram seccionadas transversalmente e histologicamente caracterizada. O número e tamanho das lesões foram pesquisados ​​em camundongos fusão positivo (TG) e ratos de fusão negativa (CR) em 4 semanas e 15 semanas após o nascimento. (A) lesões tumorais foram classificadas ao longo do seu tamanho de diâmetro (mm), e contadas. (B) de ocupação do tumor foi calculada a partir da área do tumor deduzida

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s005

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Figura S6.

caracterização histológica dos tumores de pulmão em camundongos transgênicos. (A) coloração de hematoxilina-eosina de um pulmão de rato mostrando adenocarcinoma pulmonar invasiva em torno de um vaso pulmonar (A1). Maior ampliação do tumor (A2). A coloração positiva Ki-67 no tumor (A3). barra de escala, 100 mm. (B) coloração de hematoxilina-eosina de um pulmão de rato mostrando mucina citoplasmática em células de adenocarcinoma de pulmão (B1). Maior ampliação do tumor (B2). barra de escala, de 200 um

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s006

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. K. Hagiwara (University Medical Saitama ) para fornecer o plasmídeo SPC-iNOS, Drs. Y. Nanya e S. Ogawa (Universidade de Tóquio) para fornecer o programa CNAG, e Ms. N. Okada, H. Shimizu, A. Kokubu, T. Urushidate, S. Ohashi e W. Mukai por sua excelente assistência técnica.