Abstract

Os microRNAs têm sido implicados na regulação de várias vias de sinalização celular de células (CRC) cancro colorectal. Embora a evidência emergente prova que microRNA (MIR) -106a é expressa altamente no tumor primário e amostras de fezes de pacientes com CCR; ou não miR-106a medeia a metástase do cancro é desconhecida. Mostramos aqui que miR-106a é altamente expressa em células de câncer colorretal metastático, e regula a migração de células cancerosas e invasão positivamente

in vitro

e

in vivo

. Estes fenótipos não envolvem influências de confusão sobre a proliferação de células cancerígenas. MiR-106a inibe a expressão de

transformando receptor do factor-β crescimento de 2

(

TGFBR2

), levando ao aumento da migração de células CRC e invasão. É importante ressaltar que os níveis de expressão de miR-106a em CRCs primários estão correlacionados com a progressão clínica do cancro. Estas observações indicam que miR-106a inibe o alvo anti-metastático diretamente e resulta na migração de células CRC e invasão

Citation:. Feng B, Dong TT, Wang LL, Zhou HM, Zhao HC, Dong F, et ai. (2012) Migração câncer colorretal e Invasion Iniciado pelo microRNA-106a. PLoS ONE 7 (8): e43452. doi: 10.1371 /journal.pone.0043452

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril de 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicação: 17 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Feng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As metástases levar a cerca de 90% de câncer colorretal ( CRC) relacionados com a mortalidade, mas os mecanismos subjacentes permanecem em grande parte não está claro [1]. A metástase é um complexo de vários processos, pelo qual as células CRC invadir os tecidos circundantes, intravasate na vasculatura, translocar através da circulação sistêmica, extravasamento para o parênquima de tecidos distantes (fígado e pulmões), estabelecer micrometástases e formar tumores secundários macroscópicos [2]. Nos últimos anos, têm sido realizados vários estudos para investigar os genes e seus produtos que estão envolvidos na metástase [3] -. [7]

MicroRNAs (miRRNs) compreendem uma classe evolutivamente conservada de pequenos RNAs que pode silêncio expressão gênica pós-transcricional por meio de interações específicas para a sequência com regiões não traduzidas a 3 ‘(UTRs) de alvos de mRNA cognato [8]. Recentemente, o papel de miRNAs no estabelecimento e progressão da CRC tornou-se evidente. Mais de 50% dos genes de miARN estão situados em regiões cromossómicas frágeis que são alterados durante a progressão tumoral [9], e alguns miARNs foram identificados como oncogenes ou genes supressores de tumores em CRC [10] – [14]. Além disso, a análise de perfil de expressão revelou assinaturas miRNA características que podem predizer os resultados clínicos de CRC [15], [16]

miR-106a. (MiRBase: MIMAT0000103) foi mostrado para ser altamente expressa em câncer tecidos e amostras de fezes de pacientes de CRC [16] – [18]; No entanto, o papel preciso desempenhado por miR-106 em CRCs é desconhecido. Nós, portanto, correlacionado miR-106a com a migração CRC e invasão, na esperança de que essa associação pode fornecer informações sobre os mecanismos pelos quais as células CRC metástase.

Resultados

miR-106a é altamente expresso no metastático as células CRC

em primeiro lugar, determinou os níveis de expressão de miR-106a em uma variedade de células CRC humanos. De acordo com relatórios anteriores [16] – [18], o miR-106a foi regulado para cima em todas as seis linhas celulares de CRC humanos quando comparado com imortalizada espontaneamente, células epiteliais de cólon humanas normais (NCM640; Fig. 1A). miR-106a foi mais altamente expresso em células mais invasivas em relação a células com capacidade de menos invasiva (Fig. 1A e B). Por exemplo, o nível de expressão de miR-106a era nove vezes mais elevada na linha celular SW480 mais invasiva do que a linha de células HT29 menos invasiva.

A, em tempo real A análise de RT-PCR de miR-106a expressão em células do cólon humano imortalizadas, normais epiteliais e de uma variedade de células de CRC. RNA nuclear pequeno U6 foi usada como um controlo interno. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, e as barras indicam o erro padrão. B, a capacidade invasiva de uma série de células de CRC determinado por ensaios de invasão de Matrigel. Uma experiência representativa em triplicado é apresentado, juntamente com os erros padrão. C, a análise Western blot de N-caderina, E-caderina, vimentina e expressão ZEB1 em células CRC. D, análise quantitativa com intensificador de imagem.

n

= 3,

bares,

± SD.

Além disso, a expressão de transição epitelial-mesenquimal (EMT) marcadores (E-caderina, N- caderina, vimentina, e ZEB1) foi determinada por análise de Western blot. EMT pode ser considerado como um processo patológico que contribui para a progressão do cancro, particularmente no que se refere à invasão e metástase. Como mostrado na Fig. 1C e D, os níveis de expressão de E-caderina e N-variada entre sete linhas celulares. E-caderina foi expressa em NCM640 e cinco linhas celulares de CRC, mas não SW480, e mais fortemente expressa em NCM640, HT29, SW620, LOVO e. N-caderina, vimentina e expressão ZEB1 foi menor nas quatro linhas celulares.

As duas linhas CRC celulares, RKO e SW480, que têm o maior potencial de invasão, exibidos consistentemente baixa expressão de E-caderina e alta expressão de N-caderina, vimentina, e ZEB1.

miR-106a Inicia migração e invasão

in vitro

a seguir, empreendeu

in vitro

perda de função de análises para determinar o papel desempenhado pelo miR-106a na migração de células CRC e invasão. miR-106a foi silenciada

In vitro

através de oligonucleótidos anti-sentido, em seguida, os níveis de expressão foram determinados por em tempo real de RT-PCR [19]. Verificou-se que a transfecção de miR-106a oligonucleótidos anti-sentido em células SW480 resultou em 7,3 vezes os níveis mais baixos de expressão de miR-106a (Fig. 2A). Os inibidores anti-sentido de miR-106a levou a uma redução de 2,5 vezes na migração de células SW480, tal como determinado por ensaios de migração

In vitro

, em relação aos oligonucleótidos de controlo (Fig. 2B). inibidores de miR-106a causou uma redução de 2,7 vezes na capacidade invasiva de células SW480 medidos por ensaios de invasão in

in vitro

comparado com oligonucleótidos de controlo (Fig. 2C). Mais importante, esta redução não podia ser atribuída à destruição de viabilidade celular (figura 2D, P . 0,05). Assim, estas observações indicam que miR-106a é necessária para a migração e invasão dessas células CRC mais metastáticos

in vitro

, mas não é obrigatório para a viabilidade.

A, os níveis de miR-106a expressão em células SW480 após transfecção com inibidores de miR-106a, conforme determinado por análise em tempo real de RT-PCR. Os dados foram normalizados com RNA nuclear pequeno U6. A experiência representativa em triplicado, juntamente com erros padrão é mostrado. B, Transwell ensaios de migração de células SW480 transfectadas com inibidores de miR-106a ou vectores de controlo. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado e as barras representam erros padrão. Também são mostradas imagens de contraste de fase de células SW480 que migram através de membranas. C, Matrigel ensaios de invasão de células SW480 transfectadas com oligonucleotídeos contra miR-106a ou oligonucleótidos de controlo. Uma experiência representativa em triplicado, bem como os erros padrão é mostrado. imagens de contraste de fase de células SW480 invadida através de membranas também são mostrados. D, Tripano ensaio de exclusão de azul de células SW480 com inibidores de miARN. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, juntamente com os erros padrão. E, em tempo real A análise de RT-PCR da expressão de miR-106a em células HT29 de controlo infectadas com vectores de miR-106a ou expressar. ARN nuclear pequeno U6 é usado como um controlo interno. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, e as barras indicam o erro padrão. F, o potencial de migração de células infectadas com NCM640 miR-106a-expressam ou vectores de controlo, tal como determinado por ensaios de migração Transwell. Uma experiência representativa em triplicado, bem como os erros padrão é mostrado. imagens de contraste de fase de células HT29 migraram através de membranas também são mostrados. G, potencial invasivo de células HT29 após a transdução miR-106a ou transdução de vetor de controle medido por ensaios de invasão de Matrigel. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado e as barras representam erros padrão. Também são mostradas imagens de contraste de fase de células HT29 invadiram através de membranas. H, curvas de crescimento das células HT29 infectadas com o vector-miR-106a expressar ou controlo

in vitro

. A experiência representativa é mostrado em triplicado, juntamente com erros padrão.

Para determinar se a sobre-expressão de miR-106a ou não conferida potencial migratório e invasivo em células metastáticas CRC não-metastáticos ou menos, nós clonado sequência genómica do gene miR-106a humana num vector derivado de retrovírus em células estaminais de rato [20]. Em seguida, usamos os vetores resultantes para expressar miR-106a em células NCM640 e HT29 imortalizadas com menos potencial metastático. transduções de sucesso de miR-106a foram obtidas através de tempo real de RT-PCR (Fig. 2E).

Em ambas estas duas linhas, a expressão ectópica de miR-106a causou um aumento significativo na migração celular e invasão ( Fig. 2F e 2G). Este aumento não pode ser devido ao aumento das taxas de proliferação destas células (Fig 2H, P . 0,05 para os dias 0, 2, 4, e 6). Estas observações sugerem que a sobre-expressão de miR-106a é suficiente para iniciar a migração e invasão das células CRC

in vitro

.

miR-106a Promove CRC Invasion

in vivo

a seguir, determinar se ou não miR-106a invasão induzida

in vivo

. Para este fim, que sobre-expressa o miR-106a em células de CRC que são normalmente menos invasiva. Primeiro, temos implantado HT29 células transduzidas com miR-106a ou infectadas com vectores de controle em ratinhos nus por via subcutânea. Os ratinhos receptores cresceram tumores notáveis ​​dentro de 2 semanas após a injecção, e tornou-se moribundos na semana 8 pós-injecção devido à carga de tumor, quando a experiência foi terminada.

Na semana 4 após a implantação, os tumores de miR-sobre-expressam 106a HT29 células de tumores e as células de controlo infectadas foram semelhantes em tamanho, o que sugere que o miR-106a teve um efeito mínimo no crescimento do tumor primário (Fig. 3A). Como previsto, os tumores de células de controlo eram não-invasiva, como massas tumor confinado dentro de cápsulas fibrosas (Fig. 3B, painel esquerdo). Em contraste, os tumores de miR-sobre-expressam 106a células tinham ilhas de células epiteliais cancerosas invasoras do estroma nos tecidos adjacentes (Fig. 3B, painel esquerdo). Assim, a expressão ectópica de miR-106a conferida a capacidade invasiva de células de cancro que são de outra forma não-invasiva.

A, as curvas de crescimento de tumores formados por células HT29 infectadas com vectores de controlo miR-106a ou expressar. Cada ponto de dados representa a média ± erro padrão de 3-4 ratos. B, Hematoxilina e-eosina de CRCs formados por células HT29 infectadas com o miR-106a-expressam ou controle vetores 8 semanas após a implantação.

TGFBR2

é um alvo direto de miR-106a

para entender o mecanismo pelo qual miR-106a induzir a migração de células cancerosas e invasão, foram utilizados dois algoritmos (PicTar e TargetScan) para identificar alvos de humano miR-106a [21], [22]. Entre 990 metas previstas pelo TargetScan, o

LAMA3

(Gene ID: 3909) e

TGFBR2

genes (gene ID: 7048) foram anteriormente implicados na regulação da migração celular e /ou invasão [23] – [27].

TGFBR2

é particularmente interessante porque a expressão de

TGFBR2

tem sido mostrado para ser perdido progressivamente durante a progressão maligna de diversos tipos de cancro [23], [25], [27], [28 ]. Além disso, TGFBR2-ARNm que codifica tem um elemento 3’UTR que é complementar de miR-106a (Fig. 4A).

A, formação de duplex entre Previsto humano

TGFBR2

3’UTR e miR-106a. B, as análises em tempo real de RT-PCR de

TGFBR2

em células HT29-infectadas com miR-106a ou expressando o vector de controlo.

GAPDH mRNA é usado como um controlo interno. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, juntamente com os erros padrão. C, A actividade de luciferase de tipo selvagem

TGFBR2

3’UTR do gene repórter em células HT29 de controlo infectadas com vectores de miR-106a ou expressar. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, juntamente com os erros padrão. D, a actividade da luciferase do tipo mutante

TGFBR2

gene repórter 3’UTR em células HT29 infectadas com vectores de controle de miR-106a expressar ou. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado. Barras representam erros padrão.

De facto, a sobre-expressão de miR-106a como consequência uma degradação da

TGFBR2

ARNm, tal como medido pelo tempo real de RT-PCR (Fig. 4B). A seguir, determinado se ou não

TGFBR2

é um alvo directo de miR-106a mediada por inibição por ensaio da actividade de um gene repórter de luciferase fundido no 3’UTR do tipo selvagem

TGFBR2

gene. miR-106a reduziu a actividade do repórter de luciferase significativamente (P 0,05, figura 4C.). A inibição da

TGFBR2

mediada por miR-106a depende da presença de sítios de ligação de miR-106a homólogas no 3’UTR do

gene TGFBR2

. Porque o repórter luciferase carrega um mutante

TGFBR2

3’UTR, a substituição de 4 nucleótidos dentro dos locais de ligação de miR-106a não foram inibidas por miR-106a expressão ectópica (Figura 4D, P . 0,05). Coletivamente, essas observações indicam que

TGFBR2

pode funcionar como um alvo direto de silenciamento de miR-106a-mediada.

TGFBR2

é um alvo funcional de miR-106a

a seguir, determinar se ou não expressão de reduziu o

gene TGFBR2

é necessária para a indução da migração celular e invasão observado após a sobre-expressão de miR-106a. Nós overexpressed miR-106a e uma construção expressando

TGFBR2

constitutivamente. Esta construção codifica toda a sequência de codificação do

TGFBR2,

ao faltar o elemento 3’UTR, produzindo, assim, um tipo de mRNA resistente a miR-106a inibição mediada. Notavelmente, o resultante constitutivamente expresso

TGFBR2

revogada a migração anteriormente elevada e invasão iniciada por miR-106a (Fig. 5A), mas não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular (Fig 5B, P . 0,05), sugerindo que

TGFBR2

é realmente um alvo funcional de miR-106a.

a, Matrigel ensaios de invasão de células HT29-miR-106a transduzidas ou infectadas de controle transitoriamente transfectadas com

TGFBR2

. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, juntamente com os erros padrão. B, Trypan ensaio de exclusão de azul de miR-expressando 106a-células HT29 transduzidas

TGFBR2

ou controle de vetores. É mostrada uma experiência representativa em triplicado, juntamente com os erros padrão. C, Immunoblotting para

TGFBR2

em células HT29 transitoriamente transfectadas com

TGFBR2

siRNA. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado, juntamente com os erros padrão. D, Comparação do aumento do potencial de migração e invasão entre as células HT29 transduzidas com células miR-106a e HT29 transitoriamente transfectadas com

β

siRNA. Uma experiência representativa é mostrada em triplicado. Barras denotam erros padrão.

Nós também queria esclarecer se ou não degradação do

TGFBR2

é suficiente para o aumento miR-mediada por 106a da migração e invasão. A transfecção de

TGFBR2

pequeno ARN interferente (siRNA), que resultou num 90% de redução nos níveis de

TGFBR2

proteína (Fig. 5C), conduziu a uma notável, mas não indução completa da migração celular e invasão quando em comparação com a indução provocada por miR-106a sobre-expressão (Fig. 5D). Colectivamente,

TGFBR2

parece ser um alvo necessária, mas não suficiente de miR-106a.

miR-106a expressão está aumentada em metastático CRC primária

É importante ressaltar que uma recente microarrays análise mostrou que o miR-106a está entre os miARNs que são altamente expressos no CRC primária quando comparados com o tecido normal epitelial colorrectal [16], [18]. Nós determinamos se ou não a expressão de miR-106a em tumores metástases-positiva é maior do que os tumores livre de metástases, e se ou não a expressão de miR-1061 está associado a resultados clínicos em pacientes com CCR. Foram recrutados 28 pacientes com CCR que estavam a longo prazo sobreviventes livres de metástases após ressecção cirúrgica completa do tumor primário, e compararam os pacientes para uma coorte de pacientes com metástase de controle no momento do diagnóstico ou metástase no follow-up ( 60 meses ) (Tabela S1). Além disso, as taxas de sobrevida livre de metástases em pacientes sem metástases ao diagnóstico foram estratificados com base no estado de expressão de miR-106a. Com efeito, os pacientes metástases positivos tinham níveis significativamente mais elevados de miR-106a em seus tumores primários em relação aos pacientes sem metástases (Fig 6A, P . 0,05). Notavelmente, entre todos estes pacientes, aqueles que tinham níveis mais baixos de miR-106a tiveram melhores resultados clínicos (Fig 6B,

P

. 0,05). Colectivamente, estes resultados indicam que o miR-106a tem um papel importante no CRC metástase.

A, os níveis de expressão de miR-106a em CRCs primárias com ou sem metástases. Houve uma diferença significativa na expressão de miR-106a nestes dois grupos. B, de Kaplan-Meier de sobrevida livre de metástases em 28 pacientes com CCR sem metástases ao diagnóstico, estratificados com base nos níveis de expressão de miR-106a em seus tumores primários. Aχ

2 teste foi utilizado para a análise estatística e uma P . 0,05 foi considerado significativo

Discussão

O presente trabalho identificou miR-106a como um pró-metástase miRNA líder para a promoção da migração e invasão de células CRC. A redução deste miARN em células de CRC que, de outro modo o potencial metastático diminuiu migratório e invasiva das células de CRC. Em contraste, a regulação positiva de miR-106a em células de CRC com menos potencial de migração e invasão aumento da migração celular e invasão. Nós mostramos que miR-106a não influencia significativamente as taxas de proliferação de células CRC

in vitro

e

in vivo

. Tal evidência sugere que miR-106a só poderia desempenhar um papel na invasão celular CRC.

Curiosamente, apesar do mesmo paciente, as células SW480 e SW620 teve diferentes potenciais de invasão e de expressão de miR-106a (Fig. 1A e B ). É possível que este achado foi porque as células SW480 são de um câncer primário passando por células EMT e SW620 são de um cancro secundário. O declínio da expressão de ZEB1 em células SW620, quando comparada com células SW480 pode resultar na restauração dos níveis de E-caderina e induzir um processo inverso de EMT, ou mesenquimal-epitelial (TEM) [29], em que o miR-106a pode desempenhar um papel como um fator a montante ou a jusante do ZEB1.

Nossas descobertas relatar pela primeira vez que, como um gene alvo de miR-106a,

TGFBR2

pode ser regulada negativamente por miR-106a no nível da transcrição via de ligação da 3’UTR do

TGFBR2

mRNA no CRC.

TGFBR2

é uma molécula grande sinalização de TGF-β frequentemente encontrado para ser um dos genes alterados no cancro. A via de sinalização de TGF-β desempenha um papel complexo, que permanece controverso, na progressão maligna dos tumores. Demonstrou-se que o TGF-β pode induzir o EMT e promover a invasão de células de tumor [30], enquanto outro estudo mostrou que a redução da

TGFBR2

expressão está associado com características agressivas do carcinoma hepatocelular [25]. Em CRC, TGF-β pode induzir a inibição do crescimento de células cancerosas, e

TGFBR2

era uma proteína supressora de tumor que é necessária para a sinalização de TGF-β [31]. O presente estudo mostrou que a regulação negativa do

TGFBR2

aumenta a migração celular e invasão de HT29 (Fig. 2G e 5D). Por isso, a sinalização de TGF-β pode ser uma abordagem importante pelo qual miARNs regular o desenvolvimento de tumores. Um estudo recente relatou que o miR-17~92, activada por c-Myc, atenua a via de sinalização de TGF-p, estimulando assim o crescimento celular e angiogénese tumoral [32]. Embora

TGFBR2

parece ser um alvo necessária, mas não suficiente de miR-106a no presente estudo, a relação entre o miR-106a e sinalização TGF-β merece um estudo mais aprofundado.

Análise de Correlação demonstraram também a ligação entre o miR-106a e metástase. sobreviventes a longo prazo sem metástases tinha níveis significativamente mais baixos de miR-106a em seus tumores primários relativamente aos doentes com recidiva da doença, e níveis mais baixos de miR-106a sugere uma mais elevada taxa de sobrevivência livre de metástases (Fig. 6). Esta constatação apoia fortemente a noção de que a sobre-expressão de miR-106a está intimamente envolvido na metástase do CRC.

Em conclusão, mostramos que a expressão de miR-106a foi positivamente correlacionada com a migração e invasão potencial do CRC células, e a sub-regulação de

TGFBR2

, como um dos genes alvo para miR-106a, poderia aumentar a migração celular e invasão.

Mais importante, os níveis de expressão de miR-106a em CRCs primários estão correlacionados com a progressão clínica do cancro, o que sugere que o miR-106a pode representar um novo alvo para intervenção terapêutica para prevenir CRC metástase.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

A linha de células epiteliais do cólon humano imortalizado, NCM640, foi um presente de JQ Zhang e cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10% HT29, SW480, LOVO, SW1116, SW480 e linhas de células foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA) e cultivadas sob condições de acordo com as instruções do fabricante.

Isolamento de ARN e miARNs Ensaios

O ARN total de células de cultura foi extraída com miRvana kit de isolamento (AM1560, Ambion, Austin, TX, EUA). Os ensaios foram realizados com miRNAs Mirvana qRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion), juntamente com qRT-PCT conjuntos de primers (4.395.280, Ambion), de acordo com os manuais de fabrica. RNA nuclear pequeno U6 foi utilizado como controle interno.

Oligonucle�ido transfecção

O inibidor miRIDIAN microRNA, miRIDIAN Mimic hsa-miR-106a e siRNA de

TGFBR2

foi comprado de Dharmacon (IH-300526-08, C-300526-07, e D-003930, Dharmacon, Lafayette, CO, EUA). As células foram transfectadas com 200 nM dos oligonucleótidos indicadas utilizando Oligofectamine Reagente (12252011, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram usadas para experiências posteriores 48 h após a transfecção.

Gene Clonagem e expressão ectópica

O gene miARN humana foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico normal e clonado no MDH1-PGK-GFP 2.0 derivados de retrovirus vector.

TGFBR2

ADNc que falta a 3 ‘UTR foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico normal e expressa a partir do vector pWZL-blasticidina. geração e infecção virai de células alvo foram descritos anteriormente [33]. As células infectadas foram seleccionadas com 2 ug /ml de puromicina (P9620, Sigma, St. Louis, MO, EUA), a 200 ug /ml de higromicina (H9773, Sigma), e 10 ug /ml de blasticidina (SC-205604, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EUA).

In vitro migração e invasão Ensaios

foi avaliado o potencial de migração e invasão de células CRC, conforme descrito anteriormente com ligeiras modificações [34].

células de CRC (2,5 × 10

5) foram semeadas em câmaras superiores não revestidos (inserções de 24 poços; tamanho de poro, 8 uM; BD Bioscience, Bedford, MA, EUA) para Transwell ensaios de migração. células de CRC (2,5 × 10

5) foram colocados em câmaras de Matrigel-revestidas superiores (inserções de 24 poços; tamanho de poro, 8um; BD Bioscience). para ensaios de invasão

O meio no componente de topo era aspirado e substituído com meio isento de soro 2 h após a sementeira, e o meio contendo 20% de soro foi utilizada como um chemotractant nas câmaras inferiores. As células foram deixadas migrar durante 24 h, e, em seguida, as células de ambos os lados da câmara foram fixadas com 50/50% de acetona /metanol. As células na parte inferior da câmara foram coradas com violeta de cristal (C3886, Sigma). Em seguida, a imagem de cada poço foi levado a imagem dos núcleos das células com o objectivo × 10, e os núcleos de células em cada campo foi contado utilizando programa Image-J (NIH; https://rsb.info.nih.gov /ij /).

experimentação animal

Seis a oito ratos nus semanas de idade foram utilizados para o estudo, e todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal de Shanghai Jiaotong University . 10

6 HT29 células em 200 ul DMEM foram injetadas nos flancos de murganhos por via subcutânea. Os diâmetros dos tumores foram medidos duas vezes por semana com compassos de calibre de precisão. Três a quatro ratinhos por grupo foram sacrificados em cada um dos 4 pontos de tempo (semanas 2, 4, 6 e 8 pós-transplante). Os tumores foram removidos e pesados. As amostras de tecido foram fixadas em 10% de formalina tamponada durante 12 h, em seguida, lavadas com PBS e submetidas a 70% de etanol, sendo em seguida embebidas em parafina, seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina (H9627 e E4009, Sigma).

SYBR Green em tempo real de RT-PCR

O ARN total de células foi extraído e sujeitos a transcrição reversa, como descrito anteriormente [35]. Os primers a montante ea jusante para o

gene TGFBR2

foram obtidos a partir Primerbank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/): 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 ‘e 5’-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 ‘. a análise de dados correspondente SYBR verde em tempo real de RT-PCR e foram descritos anteriormente [35]. β-actina de ARNm foram utilizados como um controlo interno (iniciadores: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ‘e 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’).

imunotransferência

As células foram colhidas em tampão de lise RIPA . Proteínas a partir de lisados ​​celulares foram resolvidas com gel de PAGE, transferidos para membranas de PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, EUA), em seguida, bloqueadas em leite magro a 5% em PBS /Tween-20, seguido por incubação com anticorpos de caderina-againstN (sc-271386, Santa Cruz), e-caderina (SC-21791, Santa Cruz), vimentina (sc-373717, Santa Cruz), ZEB1 (SC-25388, Santa Cruz) ou TGFBR2 (SC-17799, Santa Cruz) . A quantidade de proteína alvo foi calibrado usando β-actina (sc-130656, Santa Cruz), e as intensidades relativas foram obtidas.

Construir

TGFBR2

sequências 3’UTR foram clonados em um constructo de luciferase PMIR-REPORT (AM5795, Ambion) [36]. Mutant

TGFBR2

3’UTR foi gerado com um QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (200519, Stratagene, Palo Alto, CA, EUA).

luciferase Reporter Assay

Células a 50% de confluência em placas de 24 poços foram transfectadas com FuGENE6 (E2691, Promega, Madison, WI, EUA). A construção do gene repórter da luciferase (200 ng) e constructo de luciferase de Renilla pRL-SV40 (1 ng [utilizada para normalização]) foram co-transfectados em cada poço. Foram preparados extractos celulares 24-48 horas após a transfecção e medida com um duplo-Luciferase Reporter Assay System (E1910, Promega).

Clínica Os tumores colo-rectal

tumores colorectais primários e tecido colorectal normal, correspondente eram coletados entre 2004 e 2006, e processados ​​de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Ruijin da Shanghai Jiaotong University School of Medicine. O estágio TNM do tumor foi determinada de acordo com a classificação proposta pelo câncer AJCC Staging Manual [37]. dados de acompanhamento foram resumidas no final de 2011 com um período de acompanhamento médio de 60 meses. O tecido fresco foi colhido a partir de pacientes, congelado, e conservado a -80 ° C. secções parciais dos mesmos tecidos foram então coradas com hematoxilina-eiosin para validar a presença do tumor e os tecidos contendo 90% de células tumorais foram utilizadas para qRT-PCR como tumores. O ARN total foi isolado a partir de tecido congelado utilizando TRIzol extracção (15596, Ambion) e um kit de isolamento miRvana miARN (AM1560, Ambion). miARN ensaios foram realizados com um miRvana qRT-PCR Kit de Detecção de miARN (AM1558, Ambion) juntamente com qRT-PCT conjuntos de iniciadores (4395280, Ambion) de acordo com os manuais do fabricante. RNA nuclear pequeno U6 foi usada como um controlo interno. Os tumores primários foram estratificados como miR-106a inferior ou superior a discernir se ou não os níveis de miR-106a correlacionada com metástases. Os tumores foram considerados miR-106a mais baixa ou mais elevada se a expressão normalizada de miR-106a residia na parte inferior ou superior a 50% dos tumores no grupo, respectivamente.

Crescimento e Viabilidade Celulares Ensaio

para determinar as taxas de crescimento, 2,5 × 10

4 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 12 poços. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram colhidas e contadas num hemocitómetro cada 2 dias até ao dia 6. Para determinar a viabilidade das células, as células foram tratadas com tripsina e diluiu-se com 0,4% de azul de tripano (302643, Sigma) solução de coloração e contadas num hematocytometer. Análise

estatística

os dados são expressos como a média ± erros padrão. Um teste t de Student (bicaudal) foi utilizado para comparar dois grupos (A p 0,05 foi considerado significativo) salvo indicação em contrário (χ

2 test)

Informações de Apoio

Tabela S1. .

Correlação de expressão de miR-106a com metástases em pacientes com câncer colorretal.

doi: 10.1371 /journal.pone.0043452.s001

(DOC)