metástase

Abstract

Fundo

O cancro é a principal causa que leva à recidiva da doença e alta mortalidade em pacientes com câncer. Portanto, inibindo processo de metástase ou matar células cancerosas metastáticas através da indução de apoptose é de importância clínica na melhoria da sobrevivência paciente com câncer. Estudos anteriores revelaram que o fucoidano, um polissacarídeo rico-fucose isolado a partir de alga marinha castanha, é um produto natural com actividade promissora significativa anti-cancro. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do estresse do retículo endoplasmático (ER) na apoptose celular induzida por fucoidan.

principais conclusões

Nós relatou que o tratamento fucoidan inibe o crescimento celular e induz a apoptose em células cancerosas . fucoidano tratamentos resultou na diminuição da regulação da proteína regulada glucose 78 (GRP78) nas células MDA-MB-231 de cancro da mama metastáticas, e da proteína ER 29 (ERp29) nas células do cancro do cólon HCT116 metastáticas. No entanto, o tratamento com fucoidano promovido ER Ca

2 + II (CaMKII), fosforilação de proteínas Bcl-X associado (Bax) e caspase 12 Expressão em células MDA-MB-231, mas não em células HCT116 dependentes de calmodulina cinase dependentes. Em ambos os tipos de células cancerígenas, o fucoidano activado a fosforilação do factor eucariótico de iniciação 2 alfa (p-eIF2α) \\ CCAAT /enhancer ligação às proteínas homólogas de proteínas (CHOP) cascata pró-apoptótica e inibiu a fosforilação de cinase-exigindo inositol 1 (P- IRE-1) \\ proteínas de ligação 1 splicing (XBP-1s) cascata pró-sobrevivência X-box. Além disso, CHOP knockdown impediu danos no DNA e morte celular induzida por fucoidan.

Conclusão /Significado

Fucoidan exerce a sua função anti-tumor, modulando cascatas ER estresse. Contribuição de ER stress para a apoptose celular induzida pelo fucoidano aumenta a nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à sua actividade anti-tumoral e fornece evidência para a aplicação terapêutica de fucoidano no cancro

citação:. Chen S, Zhao Y, Zhang Y, Zhang D (2014) Cancer Cell Fucoidan induz a apoptose através da modulação do retículo endoplasmático stress Cascades. PLoS ONE 9 (9): e108157. doi: 10.1371 /journal.pone.0108157

editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicina da Universidade, Taiwan

Recebido: 18 Abril de 2014; Aceito: 17 de agosto de 2014; Publicação: 18 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81.370.524). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma doença crônica, com alta taxa de mortalidade devido à sua alta capacidade metastática e resistência à quimioterapia e radioterapia. Apesar de os sofisticados estratégia terapêutica para o tratamento do cancro, o tratamento não é 100% eficaz contra o cancro disseminado /metastático. Até recentemente, a maioria das drogas terapêuticas alvo nas células cancerosas proliferativos para o tratamento de tumores primários. Dado que a maioria das mortes por câncer são o resultado de doença metastática, a compreensão dos mecanismos da metástase do câncer e desenvolver medicamentos para câncer metastático são áreas em biologia de células cancerosas e terapia do cancro, de fato emergente.

O desenvolvimento de produtos naturais para a terapia do cancro é uma estratégia promissora para o tratamento e prevenção do câncer. Por exemplo, fucoidan, um polissacarídeo rico em fucose, é isolado a partir de algas marrons como

Cladosiphon okamuranus

e

Fucus evanescens

[1], [2]. O fucoidano é estruturalmente semelhante à heparina, com uma percentagem substancial de L-fucose [3], [4]. Estudos recentes demonstraram as suas várias actividades biológicas, incluindo anti-inflamatória, anti-coagulante [5], anti-HIV e anti-cancro [6] – [9] actividades. Significativamente, o fucoidano mostra uma elevada eficiência no tratamento de uma variedade de cancros, incluindo cancro da mama, cancro da próstata, cancro do pulmão, leucemia e de hepatoma [7], [8], [10] – [12]. A sua actividade anti-tumor é exercida através do controlo múltiplas vias de sinalização em células cancerosas. Verificou-se que o fucoidano pode induzir a apoptose das células

através da activação de caspase-cascatas, extracelular quinase activada por mitógeno proteína quinase regulada por sinal (ERK1 /2 MAPK) e a inactivação de p38MAPK e fosfatidilinositol 3-quinase ( PI3 K) /proteína cinase B (AKT) [7], [11], [13]. Além disso, fucoidan também inibe Wnt via /β-catenina para diminuir a expressão da ciclina D1, levando a interrupção do ciclo celular

in vitro

e

in vivo

[7], [14]. O

In vivo

estudos demonstraram que o crescimento do tumor fucoidan suprimida e metástase pulmonar diminuiu significativamente de 4T1 células cancerosas da mama [14] – [16]. Colectivamente, estes resultados suportam o desenvolvimento potencial de fucoidano como um fármaco anti-cancro. Apesar disso, os mecanismos de acção que o fucoidano exerce sobre a apoptose de células de cancro não têm sido totalmente compreendida. Em particular, pouco se sabe sobre o envolvimento do stress do retículo endoplasmático (ER), uma sinalização central que define o destino da célula, na actividade anti-tumoral mediada pelo fucoidano.

ER desempenha um papel crucial no Ca

2 + homeostase e fisiopatologia celular. A acumulação de proteínas desdobradas ou deformadas dentro da ER ou Ca

2 + esgotamento loja induz estresse ER e desencadeia a resposta de proteína desdobrada para manter a homeostase ER [17]. Em condições de repouso, a proteína chaperona ER, a glicose regulados proteína 78 (GRP78), sela os poros do translocon no pronto-socorro e, assim, reduz ER Ca

2 + vazar [18]. Sob estresse ER, GRP78 é liberado do translocon e desencadeia ER Ca

2 + esgotamento [19]. Ca citosólico

2 + se liga à calmodulina para ativar Ca

2 + \\ calmodulina-dependente quinase II (CaMKII) de sinalização, levando a ER apoptose celular induzida pelo stress através de ativação da via de apoptose mitocondrial [20].

ER estresse também leva à dissociação de GRP78 dos complexos formados com a parte luminal de proteínas de membrana ER, RNA proteína quinase (PKR) -como ER quinase (PERK), exigindo-inositol quinase 1 (IRE1) e fator de transcrição ativar 6 (ATF6), resultando em autofosforilação de PERK e IRE-1 e a translocação de ATF6 para o Golgi para a clivagem [21]. Estas alterações causam a activação de vias de sinalização a jusante seus. Por exemplo, o PERK activado fosforila eucariótica Fator de Iniciação 2 alfa (eIF2α) para atenuar a tradução da proteína e reduzir a sobrecarga de proteína ER [22]. ER stress prolongado também induz ATF4 e CCAAT /enhancer proteína de ligação a expressão (CHOP) proteína homóloga, conduzindo a apoptose [17]. Para lidar com o estresse ER, ativado atos IRE-1 como uma endonuclease de aumentar a proteína de ligação 1 (XBP-1) splicing X-box, levando assim a regulação positiva de genes importantes para a sobrevivência celular durante o estresse ER [23]. ATF6 activação ocorre depois da clivagem proteolítica no Golgi, seguido por sua translocação nuclear para a resposta ao stress adaptativa [24]. Em certa medida, o stress ER desempenha um papel crucial em ajustar esses saldos de sinalização para manipular o destino do celular [17].

Neste estudo, nós investigamos se o estresse ER envolve a apoptose celular induzida por fucoidan na altamente invasivo e MDA-MB-231 células de cancro da mama metastático células [25] e câncer de cólon HCT116 [26]. Nós mostramos que o tratamento fucoidano regula o ER Ca

2 + -modulated fosforilação de CaMKII de uma forma dependente do tipo de célula. No entanto, o tratamento com fucoidano em ambos os tipos de células cancerosas activado o p-eIF2 \\ CHOP cascata pró-apoptótica e inibiu a p-IRE-1 /XBP-1s-Pro sobrevivência cascata. Portanto, o estresse ER contribui, pelo menos em parte, à apoptose celular induzida por fucoidan.

Materiais e Métodos

cultura celular

humano MDA-MB-231 células de cancro da mama e células de cancro do cólon HCT116 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS, Invitrogen, Eugene, OR). As células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2 numa incubadora humidificada

Anticorpos e reagentes

Os anticorpos seguintes foram utilizados neste estudo:. De coelho anti-coelho e GRP78 anti-ERp29 da Novus Biologicals (Littleton, CO); coelho anti-eIF2a, rato anti fosfo-eIF2a-(S51), de coelho anti-p58

IPK, coelho anti-clivada PARP, coelho anti-emendados XBP-1 (XBP-1s), de coelho anti-caspase rato 3e anti-GADD153 /CHOP de celular Sinalização Tecnologia (Beverly, MA); de ratinho anti-β-actina a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); coelho anti-CaMKII, coelho anti-Bax, coelho anti-caspase 12 e coelho anti-fosfo-CaMKII (T286) da Abcam (Cambridge, MA).

Fucoidan isolado do

Fucus vesiculosus

foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). As completas, inibidores da protease comprimidos cocktail livre de EDTA foram obtidos a partir Roche Diagnostics (Indianapolis, IN). inibidores de fosfatase de cocktail I e ​​II e tapsigargina (Tg) eram da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). reagentes de transfecção Lipofectamine 2000 foram fornecidos por Invitrogen (Eugene, OR). Salubrinal foi adquirido a Tocris Bioscence (Ellisville, MO).

O crescimento celular e a viabilidade

O crescimento celular foi avaliado utilizando o CellTiter96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (Promega, Madison, WI). Em resumo, as células foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células por poço em 100 ul do meio correspondente. No dia seguinte, o meio foi aspirado e substituído por meio fresco contendo as concentrações indicadas de fucoidano (0, 10, 50, e 100 ug /ml). As células foram incubadas sob condições de cultura padrão para até 4 dias, e as células viáveis ​​foram avaliadas. A absorvância a 492 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas F200 Infinito (TECAN Áustria GmbH, Grödig, Áustria). experiências em triplicado foram realizadas para cada tratamento. A viabilidade celular foi também examinada utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripano.

celular apoptose

apoptose celular foi testada usando dUTP nick rotulagem final mediada-transferase (TUNEL) ensaio desoxinucleotidil terminais [27]. Resumidamente, as células (2,5 x 10

4 por poço) foram semeadas em placas de 6 poços placas de cultura com lamela e 24 h mais tarde, de 2 ml de meio fresco com fucoidano (conc. Final de 100 ug /ml) foi adicionado a cada poço . As células foram então tratadas durante 3 dias, seguido por coloração TUNEL utilizando o kit de sistema deadend Fluorométrica TUNEL (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. As lâminas foram montadas usando antifade fluidos de montagem contendo DAPI. Verde (núcleo da célula apoptótica) e (DAPI, células totais) azuis sinais fluorescentes foram capturadas utilizando um Olympus FluoView FV1000 microscópio de laser confocal de varredura (Olympus, Japão). A porcentagem de células em apoptose foi expressa como uma média de cinco campos selecionados aleatoriamente (300 células por campo). Além disso, a apoptose celular foi também examinada por immunoblotting a expressão de caspase clivada 3 e clivada Poli (ADP-ribose) polimerase (PARP).

RNA de interferência

Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) segmentação CHOP (CHOP siGENOME SmartPool, Dharmacon, Lafayette, CO) e siGENOME não-alvo siRNA foram utilizados para CHOP knockdown e controle, respectivamente. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 6 poços e transfectadas transitoriamente a 60-80% de confluência com siRNA, a uma concentração final de 25 nm, utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Eugene, OR), de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram incubadas com meio fresco sozinho ou meio com 100 ug /ml de fucoidano. Após 3 dias de pós-tratamento, as células foram colhidas para análise de viabilidade usando ensaio de exclusão de azul tripano e avaliar os níveis de CHOP e clivada PARP por immunoblot.

Immunoblot análise

As células a 70-80% confluência foram tratadas com fucoidano a várias concentrações (0, 1,0, 5,0, 10, 50 e 100 ug /ml, respectivamente) durante 3 dias. Tanto as células aderentes e em suspensão foram colhidas para extracção de proteína. Os lisados ​​celulares foram extraídos com tampão RIPA (1% Igepal, 1% de desoxicolato de sódio, cloreto de sódio 0,15 M, sulfato de sódio 0,01 M, pH 7,2 e EDTA 2 mM), suplementado com inibidores da protease (Roche Diagnostics) e inibidores de cocktail de fosfatase I e II (1:100, Sigma-Aldrich). Western blot foi realizada tal como descrito [28]. Resumidamente, proteínas totais (30 ug /pista) foram separados por 10% SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em tampão de solução salina tamponada com Tris com Tween 20 a 0,1% durante 1 h à temperatura ambiente e sondados com os anticorpos primários indicados. De cabra anti-ratinho com peroxidase de rábano (HRP; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) ou anticorpo secundio HRP-anti coelho de cabra (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) foi utilizado como anticorpos secundários. O sinal quimioluminescente foi desenvolvido com Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL). A intensidade de sinal foi analisado utilizando o software GeneTools (Syngene, Frederick, MD). O nível de β-actina foi usado como um controle de carga.

Análise estatística

Uma forma de análise de variância (ANOVA) e Estudante de

t

foram utilizados testes para analisar a significância das diferenças. p 0,05 foi considerado como significativo. Todas as experiências de cultura de células foram realizadas em triplicado. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (SD) e fornecidos na Tabela S1.

Resultados

tratamento Fucoidan induz a apoptose de células

Estudos anteriores demonstraram uma significativa inibição da fucidan em metástase de células tumorigênese e câncer [14] – [16]. Para compreender o efeito do fucoidano em crescimento celular e apoptose, ambas as células metastáticas MDA-MB-231 e células HCT116 foram tratadas com fucoidano na concentração indicada para um máximo de 4 dias e o crescimento celular foi ensaiada. Como mostrado na Fig. 1A, o crescimento celular foi significativamente inibida quando as células foram tratadas com 50 ug /ml de fucoidano no dia 3 para as células MDA-MB-231 e no dia 2 para células HCT116, em comparação com as respectivas células de controlo. Além disso, para determinar se os atributos apoptose celular à inibição do crescimento das células, ambos os tipos de células foram tratados com fucoidano (100 ug /ml) durante 3 dias e a apoptose das células foi avaliada através da análise da expressão de caspase 3 clivada e TUNEL. Tal como indicado na Figura 1B, o tratamento do fucoidano em altas doses (

por exemplo., 100 ug /ml) causaram elevada expressão de caspase 3 clivada em ambos os tipos de células. A análise TÚNEL também mostrou uma cerca de 25% de células submetidas a danos no ADN nas células tratadas com fucoidano (Figura 1C.). Assim, o tratamento fucoidano resultou em danos no ADN notável nestas células.

(A), o crescimento celular. As células foram tratadas com fucoidano na concentração indicada e as células viáveis ​​foram avaliadas usando o CellTiter96 Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação. (B) A caspase 3 activação. As células foram tratadas com fucoidano durante 3 dias e a expressão da caspase 3 clivada foi analisada por Western blot. (C) de TUNEL. Para a análise de TUNEL, as células foram tratadas com fucoidano a 100 ug /ml durante 3 dias e a apoptose celular foi analisada utilizando o ensaio TUNEL. As células apoptóticas (verde) foram contadas em cinco campos seleccionados aleatoriamente (300 células por campo) e apresentado como uma média ± DP da percentagem de células apoptóticas sobre o total de células (DAPI, azul). Os dados são expressos como uma média ± DP de experiências em triplicado. * P 0,05; ** P . 0,01

tratamento Fucoidan leva a diferente resposta ER no MDA-MB-231 e as células HCT116

Para investigar se o estresse ER está envolvida na apoptose celular induzida por fucoidan , inicialmente examinaram a expressão de marcadores de estresse ER incluindo GRP78 e ERp29. Curiosamente, contrariamente às células tratadas com o stress indutor ER TG ,, a expressão de GRP78 foi reduzida nas células MDA-MB-231 tratadas com fucoidano sem efeito na expressão ERp29 nestas células, em relação às células de controlo (sem tratamento fucoidano ) (Fig. 2A). Em vez disso, a expressão de ERp29 foi significativamente reduzida nas células HCT116 tratados com fucoidano, ao passo que a expressão de GRP78 foi ligeiramente aumentada quando as células foram tratadas com 5 ug /ml, seguido por redução com altas doses de tratamentos (Fig. 2B). GRP78 tem várias funções em células cancerígenas, tais como sendo responsável pela proliferação celular, protegendo as células da apoptose e acelerar a degradação das proteínas associadas ao ER de proteínas deformadas [29]. Estudos recentes também abordado o papel dos ERp29 na sobrevivência de células cancerígenas contra quimio e radioterapia [27], [30]. A redução de GRP78 ou ERp29 nas células tratadas com fucoidano sugere que o fucoidano induz a morte celular suprimindo a expressão destas proteínas de sobrevivência em células MDA-MB-231 e HCT-116.

Células a 70-80% de confluência foram tratados com fucoidano nas concentrações indicadas, durante 3 dias e tanto as células fixadas e suspensas foram colhidas para análise de expressão de proteína. (A) A expressão de GRP78, mas não ERp29, foi inibida pelo fucoidano em MDA MB-231; (B) A expressão de ERp29 foi significativamente atenuada pelo fucoidano em células HCT116, enquanto GRP78 foi diminuído apenas ligeiramente (-1,5-vezes) em células tratadas com fucoidano em 50 ug /ml. Como um controlo positivo, as células foram tratadas com o stress indutor ER TG (2,0 uM) durante 24 h. Os dados representam a média ± SD de experiências em triplicado. * P 0,05; ** P . 0,01

tratamento Fucoidan resulta na ativação de p-CaMKII \\ Bax e caspase 12 expressão em uma célula ao contexto forma dependente

Porque GRP78 pode vincular com o translocon na membrana ER bloquear Ca

2 + libertação no citoplasma [18], o próximo analisaram se a redução de GRP78 em células MDA-MB-231 poderia induzir Ca

2 + ativação mediada da CaMKII ea expressão de proteínas relacionadas com a apoptose Bax. Como mostrado na Fig. 3A, a fosforilação relativa de CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) foi progressivamente aumentada em células tratadas com fucoidano em comparação com as células de controlo (sem tratamento) fucoidano, indicando uma activação de Ca

2+ \\ sinalização CaMKII. De acordo com isto, a expressão do Bax foi também significativamente aumentada e mantida a um nível semelhante nas células tratadas com fucoidano (10-100 ug /ml). Em contraste, em comparação com as células de controlo, a fosforilação relativa de CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) foi moderadamente aumentado (-1,5-vezes) em células HCT116 tratadas com 10 ug /ml de fucoidano, seguido de redução nas células tratadas com 100 ug /ml de fucoidano. No geral, o tratamento fucoidano em células HCT116 não provocou alteração significativa da fosforilação relativa de CaMKII e expressão do Bax (Fig. 3B). Nós também descobrimos que a expressão da caspase foi altamente 12 aumentou com a concentração de fucoidano em células MDA-MB-231, mas não em células HCT116 (Fig. 3C). Além disso, sem clivagem da caspase 12 foi observado quando a sondagem com o anticorpo. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que o fucoidano regula Ca

2+ \\ sinalização CaMKII e caspase 12 de uma forma dependente do tipo de célula.

(A), a fosforilação de CaMKII Relativa e expressão do Bax foram progressivamente aumentada fucoidano em MDA MB-231; (B) a fosforilação de CaMKII Relativa foi moderadamente estimulada (-1,5 vezes) a 10 ug /ml, seguido de inibição (~1.4 vezes) de fucoidano a 100 ug /ml. expressão Bax não foi afetada pela fucoidan em células HCT116. (C) Caspase 12 expressão e clivagem. O fucoidano induz eficazmente a caspase 12 expressão em células MDA-MB-231, em vez de em células HCT116. Nenhuma clivagem de caspase 12 foi encontrada em ambos os tipos de células. Os dados representam SD ± média de experiências em triplicado. * P 0,05; ** P . 0,01

tratamento Fucoidan inibe a p-IRE-1 \\ XBP-1 splicing

Com base nas conclusões anteriores de que fucoidan podem modular a resposta ao estresse ER nas células cancerosas , o próximo examinou se fucoidan regula diferencialmente IRE-1 \\ XBP-1 s, uma resposta de sobrevivência celular em cascata que define

via

up-regulação da expressão de chaperones de capacidade ER dobrar [31], eo PERK \\ P -eIF2α \\ CHOP cascata pró-apoptótica [17]. Em comparação com o controlo, o fucoidano inibiu significativamente a expressão da XBP-1 s em ambos os tipos de células (Fig. 4A, B). Isto foi causado pela fosforilação diminuiu de IRE-1 nas células tratadas com fucoidano, porque as activados p-IRE-1 funciona como uma endonuclease para gerar spliced ​​XBP-1s a partir de XBP-1 não excisado do mRNA, sob ER stress [32]. Em contraste com as células tratadas com TG demonstrando reforçada IRE-1 e expressão de fosforilação da XBP-1 s (Fig. 4A, B), estes resultados indicam um efeito inibidor do fucoidano em ER cascata sobrevivência celular relacionada com o stress. No entanto, não observamos uma mudança significativa de P58

IPK, um dos alvos a jusante de XBP-1s e ATF6 [23], nas células tratadas com fucoidan.

As células foram tratadas com fucoidan como descrito em “Materiais e Métodos” e na Figura 2. a fosforilação de IRE-1 (p-IRE-1) e a XBP-1 de splicing foram notavelmente reduzido em fucoidano como avaliado por imunotransferência. Seu alvo a jusante, p58

IPK, não foi posteriormente reduzido. Os dados são expressos como média ± DP de experiências em triplicado. Note-se que as células TG-tratada (2,0 mM, 24 h) revelou o aumento p-IRE-1 e XBP-1s em ambas as células. * P 0,05; ** P . 0,01

Fucoidan ativa eIF2α fosforilação e aumenta a expressão CHOP

A fosforilação de eIF2α é um mecanismo clássico para a síntese de proteínas global para lidar com o estresse ER-regulação para baixo [33 ]. No entanto, o stress ER excessiva também promove a morte celular

via

upregulating cascata ATF4 \\ CHOP [17]. é, assim, especulou-se que esta cascata é provavelmente activado para participar na apoptose celular induzida pelo fucoidano. Com efeito, de acordo com as células tratadas com TG, a fosforilação de eIF2α e expressão de CHOP foram induzidos progressivamente de um modo dependente da dose em ambos os tipos de células (FIG 5A . B). Portanto, o fucoidano pode induzir ER cascata pró-apoptótica relacionada com o stress nestas células cancerígenas.

As células foram tratadas com fucoidano como descrito na secção “Materiais e Métodos” e na Figura 2. A fosforilação relativa de eIF2α (p -eIF2α /eIF2α) e pique expressão foram notavelmente aumentaram fucoidan como avaliado por immunoblot. tratamento TG (2,0 mM, 24 h) induzida por ativação de p-eIF2α e pique expressão. Os dados são expressos como média ± DP de experiências em triplicado. * P 0,05; ** P . 0,01

tratamento Salubrinal aumenta activado-fucoidan eIF2α fosforilação e CHOP expressão

Salubrinal é um inibidor selectivo da eIF2α desfosforilação e induz a hiperfosforilação de eIF2α inibindo GADD34-�PP1c complexo [34], [35]. Para avaliar se o tratamento salubrinal facilita ER estresse cascata induzida pelo fucoidano, células MDA-MB-231 e HCT-116 foram tratadas com salubrinal (50 uM), isoladamente ou em combinação com fucoidano (100 ug /ml) durante 48 horas e a expressão de p- eIF2α e CHOP foi examinada. Tal como indicado na Figura 6, as células tratadas com salubrinal e fucoidano mostraram maior expressão de fosforilação de P-eIF2α e CHOP do que as células tratadas com salubrinal ou fucoidano sozinho. Estes dados indicam um efeito de estímulo do fucoidano na salubrinal induzida P- eIF2α \\ CHOP cascata.

As células foram tratadas com salubrinal (50 uM), isoladamente ou em combinação com fucoidano (100 ug /ml) durante 48 h . Os lisados ​​celulares (30 ug) foram aplicados para a análise da expressão de p-eIF2α CHOP e por imunotransferência. ** P 0,01; *** P . 0.001

CHOP silêncio inibe a expressão induzida por fucoidan de PARP clivada

Para avaliar se a CHOP induzida por fucoidan em ambos os tipos de células cancerosas está ligada à apoptose celular observado, as células foram tratadas com siRNA CHOP direccionamento para reduzir os seus níveis endógenos ou tratadas com ARNsi de encriptação como um controlo. Os nossos estudos preliminares mostraram que ambos os tipos de células tratadas com 25 nM de ARNsi durante 48 h poderia levar a 70% de repressão da expressão CHOP, em comparação com os tratados com ARNsi de controlo. Estas células foram então tratadas com fucoidano (a 0 ou 100 ug /ml) durante 2 dias e CHOP expressão e danos no ADN (tal como avaliado por PARP clivada) foram analisados. Como mostrado na Fig. 7A, o nível de CHOP foi reduzida em 70-90% dos controlos em ambos os tipos de células após o tratamento. Nas células pré-tratadas com ARNsi de controlo, o tratamento fucoidano marcadamente aumentou a expressão CHOP e clivagem PARP sobre as células sem tratamento fucoidano. Em contraste, o tratamento com fucoidano foi incapaz de induzir a expressão de CHOP e clivagem PARP nas células silenciados-CHOP, indicando que o silenciamento CHOP é capaz de bloquear a expressão induzida pelo fucoidano da PARP clivada. Estes dados fornecem evidências de que CHOP participa de danos no DNA induzidos por fucoidan.

(A) CHOP knockdown por siRNA inibe a expressão induzida por fucoidan de PARP clivada. As células a 70-80% de confluência foram tratadas com siRNA CHOP ou precipitação ARNsi durante 48 h, seguido por tratamento fucoidano (0 ou 100 ug /ml) durante 2 dias. Os níveis de CHOP e PARP clivada foram avaliadas por immunoblot. (B) O silenciamento CHOP antagoniza a morte celular induzida pelo fucoidano. As células pré-tratadas com siRNA CHOP ou ARNsi de controlo foram tratados com fucoidano (0 ou 100 ug /ml) durante 2 dias e a viabilidade celular foi examinada utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripano. A viabilidade celular foi expressa como uma percentagem das células de controlo sem tratamento com ARNsi fucoidano (coluna 3 em células MDA-MB-231; coluna 7 em células HCT116). Note-se que CHOP knockdown sozinho não afeta a viabilidade celular em ambos os tipos de células (coluna 1

vs Sims 3;.. Coluna 5

vs

7). Em vez disso, CHOP knockdown notavelmente impede a apoptose celular induzida por fucoidan a 100 ug /ml (coluna 2

vs página 4 em células MDA-MB-231;. Coluna 6

vs

8 em células HCT116. ). Os resultados são interpretados como a média (± SD) de experiências em triplicado. * P 0,05; ** P . 0,01

CHOP repressão antagoniza induzida por apoptose celular fucoidano

Para examinar o efeito do knockdown CHOP na apoptose celular induzida pelo fucoidano, a viabilidade celular destas células tratadas foi examinada. Em relação à viabilidade celular das células de controlo ARNsi sem tratamento fucoidano (Figura 7B, coluna 3 em células MDA-MB-231;. A coluna 7 em células HCT116), a viabilidade celular nas células silenciados-CHOP foi semelhante ao observado em estas células de controlo (. a Fig. 7B, a coluna 1

vs

3; coluna 5

vs

7.), indicando que o silenciamento CHOP sozinho não poderia afectar a viabilidade celular. Nas células pré-tratadas com ARNsi de controlo, o tratamento fucoidano levou a uma redução de aproximadamente 50-60% da viabilidade celular em comparação com aqueles sem tratamento fucoidano (Figura 7B, coluna 4

vs

3;.. Coluna de 8

vs

7; p 0,01). No entanto, o tratamento com fucoidano só causou uma redução de aproximadamente 10-20% da viabilidade das células nas células silenciados-CHOP (Fig 7B, coluna 2

vs

1;… Coluna 6

vs

5) . De nota, a repressão do regime CHOP em ambos os tipos de células levaram a um aumento significativo da viabilidade das células após o tratamento fucoidano em comparação com as células tratadas com ARNsi de controlo e fucoidano (Figura 7B, coluna 2

vs

4;.. Coluna . 6

vs

8; p 0,05). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o knockdown de CHOP poderiam proteger as células da apoptose celular induzida por fucoidano.

Discussão

O fucoidano foi demonstrado ser um novo agente terapêutico para o tratamento do cancro. Estudos mecanísticos revelou que o fucoidano pode suprimir a sobrevivência de células de cancro, tumorigénese e metástases através da modulação múltiplas vias de sinalização [5], [7], [11] – [14]. No presente estudo, demonstramos que fucoidan modula cascatas de estresse do RE em células cancerosas e a expressão CHOP activado é responsável pela apoptose celular induzida por fucoidan.

ER estresse desencadeia uma série de processos necessários para a apoptose. Um deles é a liberação de ER Ca

2 + lojas para o citosol para ativar o Ca

2 + -signal transdutor CaMKII, levando à apoptose por meio de: ativação de c-Jun (

i

) N cinase de terminal (JNK) para induzir a morte do receptor Fas (11); (

ii

) estimulação da Ca

2 + captação pela mitocôndria e liberação de apoptogens [36]. Assim, a activação CaMKII por ER Ca

2 + vazamento desempenha um papel crucial na apoptose. No entanto, observou-se que o tratamento com o fucoidano induziu activação de p-CaMKII em células MDA-MB-231 em vez de em células HCT116. Consistentemente, a proteína de apoptose mitocondrial Bax e a caspase-ER associado 12 estavam significativamente aumentados em células MDA-MB-231 tratadas com fucoidano. Considerando-se que se liga a GRP78 pode ER Ca

2+ e translocon na membrana do RE para bloquear ER Ca

2+ vazar [18], isto pode ser explicado pelo fato de que o tratamento com fucoidano em células MDA-MB-231 , não em células HCT116, provocou redução de GRP78 citoprotetora, levando a ER Ca

2 + vazar para citosol para activar a fosforilação CaMKII. Em contraste, não houve alteração significativa da fosforilação de CaMKII e Bax e caspase 12 expressão em células HCT116 tratados com fucoidano, embora fosforilação CaMKII foi moderadamente aumentado por fucoidano a 10 ug /mL e inibido a 100 ug /ml. Este é provavelmente consistente com a observação de que a expressão de GRP78 não foi significativamente afectada pelo fucoidano em células HCT116. No entanto, não deve ser excluído o efeito da regulação negativa induzida por fucoidan de ERp29 na redução moderada da fosforilação CaMKII em células HCT116. Além disso, tem sido relatado que a associada-ER, Ca

2 + induzida por activação da caspase 12 também está implicada na apoptose induzida ER-stress [37], a activação no entanto, não se observou de pró-caspase 12 ( clivagem de caspase 12) nas células tratadas com fucoidano, sugerindo que esta cascata de caspase não pode ser activada. Porque GRP78 e ERp29 são proteínas ER essencial na manutenção da homeostase e funções, tais como dobragem e a secreção de proteínas e degradação de proteínas deformadas er [29], [38], é plausível que o fucoidano potencia danos a função de ER através atenuando a expressão de GRP78 ERp29 ou de uma forma dependente do contexto celular, em que os mecanismos precisos que precisam de ser ainda mais explorado

ER vias de sinalização são acoplados a duas cascatas principais mediada tensão-:. relacionadas com a morte celular PERK \\ P-eIF2α \\ CHOP cascata e células relacionadas a sobrevivência-AFT6 (IRE-1) \\ XBP-1 splicing cascata [17]. Para lidar com o estresse ER, XBP-1 mRNA é emendado pelos ativados p-IRE-1 para gerar XBP-1s [32]. XBP-1s é um factor de transcrição altamente activo e é um dos principais reguladores da capacidade de dobragem do ER [31]. Estudos recentes têm mostrado que o prolongamento de IRE-1 durante o stress de sinalização ER pode promover a sobrevivência de células [39]. Assim, a atenuação da presente cascata poderia desencadear a apoptose celular. De facto, os nossos estudos demonstraram que o tratamento fucoidano preveniu significativamente a XBP-1 por inibição de splicing de IRE-1 fosforilação.