Abstract

Fundo

Polimorfismo de genes que codificam enzimas que metabolizam drogas é conhecida por desempenhar um papel importante no aumento da susceptibilidade de câncer colorretal. UGT1A locus do gene tem sido sugerido para definir a actividade glucuronidação específico do tecido. capacidade reduzida de glucuronidação está correlacionada com o desenvolvimento do cancro colo-rectal. Por isso, procurou explorar polimorfismo do gene UGTlA no cancro colorectal humano.

Métodos

tecidos cancerosos e saudáveis ​​foram obtidos a partir selectedpatients. Amostras de sangue foram coletadas e transcrições de mRNA UGTlA foram analisados. Foi preparado ADN genómico e sequências de exão UGTlA8-1 foram amplificadas, visualizado e purificado. O DNA extraído foi subclonado e sequenciado. Bicaudal teste exato de Fisher, odds ratio (OR), intervalo de confiança (IC) e Logística análises de regressão foram utilizados para análise estatística.

Resultados

expressão de mRNA UGTlA foi reduzida em tecidos cancerosos em comparação com tecidos saudáveis ​​do mesmo paciente. A expressão de ARNm de tecido saudável UGTlA em pacientes do estudo foi mais baixa do que o controle. A expressão de ARNm de tecido canceroso foi regulada para baixo em UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A9 e supra-regulados em UGTlA8 e UGT1A5 e UGT1A7 UGTlAl0 não foram expressas em tecido colónico de ambos os grupos. A freqüência do alelo de WT UGTlA8 * 1 foi maior (p = 0,000), a frequência de UGTlA8 * 3 foi reduzida no grupo controle (p = 0,000). A expressão de UGTlA8 homozigoto * 1 foi maior no grupo controle (p = 0,000). maior frequência de ambos UGTlA8 heterozigotos * 1 /* 3 e UGTlA8 * 2 /* 3 foram encontrados no grupo de estudo (p = 0,000; p = 0,000). A ocorrência de câncer colorretal foi relacionada principalmente à presença de polimórficas UGTlA8 * 3 alelos (p = 0,000).

Conclusão

Regulamento de genes UGT1A humanos é específico do tecido. variação individual em expressões polimórficas do locus do gene UGTlA foi observado em todos os tipos de tecido colónico testado, enquanto que a expressão hepática do tecido foi uniforme. A elevada incidência de polimorfismo UGTlA8 existe em doentes com cancro colorectal. UGTlA8 * 1 alelo é um fator protetor e UGTlA8 * 3 alelo é um fator de risco

Citation:. Wang M, Sun D-F, Wang S, Qing Y, Chen S, Wu D, et al. (2013) Expressão polimórfica da UGTlA Gene UDP-glicuroniltransferase no câncer colorretal humano. PLoS ONE 8 (2): e57045. doi: 10.1371 /journal.pone.0057045

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 16 de dezembro de 2012; Aceito: 16 de janeiro de 2013; Publicação: 27 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Ciência e Tecnologia Projeto chave da província de Shandong (No.2006GG3202050), fundos de bônus Ciência para Jovens cientistas da província de Shandong (NO.2007BS03017, nenhum link URL) e Natural Science Foundation da província de Shandong (No.Y2008C115, nenhuma ligação URL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é um dos tipos mais comuns de câncer em todo o mundo. Com base em dados da Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC), o câncer colorretal para 9,4% de todo o

de novo

cancros diagnóstico em 2007.Compare com os números, em 2000, recém-diagnosticado cancro colorectal em 2007 tinha aumentado em 27%, ea taxa de mortalidade tinha aumentado em 28%; o que representa um aumento anual de 3,9% e 4,0%, respectivamente [1].

Embora a etiologia do cancro colorectal não é totalmente compreendida, o polimorfismo de genes que codificam enzimas metabolizadoras de drogas é conhecida por desempenhar um papel importante no aumento da susceptibilidade do cancro do cólon [2]. Uma miríade de enzimas estão envolvidas na fase I e fase II vias metabólicas, incluindo membros do citocromo P450 (P450) e UDP-glucoronosiltransferase (UGT) Superfamílias. UGTs catalisar reacção glucuronidação, o que é importante para o metabolismo de xenobióticos. A glucuronidação permite a utilização de certos nutrientes, assim como a desintoxicação e excreção de compostos e metabolitos potencialmente prejudiciais, tais como esteróides, bilirrubinas, drogas exógenas, produtos químicos tóxicos e mutagénicos substâncias [3]. Mais de 50 tipos UGTs tinha sido identificada em vários órgãos e tecidos de animais e em humanos, incluindo fígado, mucosa intestinal, pulmão, cérebro, placenta, útero e [4] – [8]. UGTs humanos foram divididos em a UGT1, 2, 3 e 8 famílias multigênicas baseado em divergência evolutiva [4]. Até à data, 21 UGTs diferentes [9] foram encontrados em seres humanos. O locus do gene UGT1A humano está localizado no cromossoma II. É composto por treze diferentes primeiros exons na extremidade 5 ‘ligada, por splicing alternativo, a quatro diferentes exons comuns na extremidade 3’. UGT1A locus de gene codifica, pelo menos, nove proteínas funcionais (UGT1A1, UGT1A3-UGT1A10) e quatro pseudogenes (UGT1A2, UGT1A11-UGT1A13) [10].

expressão específica de tecido do locus do gene UGT1A tem sido bem caracterizado. O gene tinha sido sugerido para definir a actividade glucuronidação específica de tecido em sistema digestivo humano. proteínas UGT1A hepáticas (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6 e UGT1A9) foram estudadas e identificadas em detalhe. Os estudos que examinam trato gastrointestinal humano levaram à identificação de três transcrições extra-hepáticos UGT1A: UGT1A7, UGT1A8 e UGT1A10 [11], [12]. Usando Transcriptase Reversa Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), inferior a expressão do gene de UGT1A8 foi observado no esófago [13]. Um estudo mais detalhado mostrou nenhum ARN UGT1A8 detectável no intestino delgado, mas os níveis de mRNA abundantes UGT1A8 no intestino grosso [12]. Presentemente, os dados sobre a expressão de UGT1A8 no fígado ou em qualquer outro tecido humano tem sido escassa. A expressão selectiva de UGT1A8 no cólon pode indicar que UGT1A8 desempenha um papel importante na homeostase celular e a disposição de compostos endógenos e exógenos. Foi relatado que a proteína humana UGT1A8 glucuronidação catalyse de cumarinas, compostos fenólicos, antraquinonas, flavonóides e uma série de esteróides, em células transfectadas de rim embrionário humano 293 (HEK293) [14]. Considere o fato de que o cólon contém uma quantidade considerável de proteínas UGT1A [12], uma capacidade reduzida de glucuronidating substâncias específicas pode ser prejudicial para o equilíbrio homeostático do cólon.

Durante os últimos anos, os dados de genotipagem e sequenciamento teve levou à descoberta de mais de 100 variantes dentro das regiões promotoras e a sequência de codificação dos genes UGT1A. Notavelmente, muitas das variantes exibem frequências de alelos de até 40-50% na população em geral, os quais são para ser encontrados em desequilíbrio de ligação. Mas, algumas variantes são de frequência suficiente na população em geral para ser classificado como polimorfismos [15], [16]. O polimorfismo é melhor representada pelo gene UGT1A1, que é conhecido por conter 113 genótipos alelo variante de UGT1A1 (UGT1A1 * 1-UGT1A1 * 113). Muitos dos genes UGT1A1 apresentam altas frequências de alelos [17], [18]. O polimorfismo genético, também foram encontrados em UGT1A3 [19], [20], UGT1A4 [21], [22], UGT1A6 [23], [24], UGT1A7 [16], [25], [26], UGT1A8 [12 ], [14], [21], [27], [28], e UGT1A9 [29]. O polimorfismo leva a diferentes graus de transcrição, assim como alterações funcionais, que podem diminuir a actividade UGTs e resulta na patologia dos indivíduos afectados. A análise de um estudo de caso-controle revelou maior risco de desenvolver cancro colorectal (CRC) em indivíduos portadores UGT1A1 * 6 e UGT1A7 * 3 variantes [30]. A análise de polimorfismos genéticos de genes UGT1A3 (UGT1A3 * 2, * 3 UGT1A3) mostraram que não só o nível de proteína expressa actividade UGT1A3 tinha mudado, mas a especificidade para substratos diferentes foi afectada bem como [20]. Amplos estudos foram realizados em variantes do gene UGT1A7. Com seu baixo cancerígena atividade metabolizando, gene UGT1A7 é um fator de risco para o carcinoma hepatocelular desenvolvimento (HCC) em, chinês (OR = 3,06) [31], francês (OR = 3.4) [32], japonês (OR = 2,33) [33 ], e os coreanos (OR = 1,45) [34]. Além disso, UGT1A4 * 2 e UGT1A4 * 3 também foi considerada como um fator de risco para HCC em um estudo de associação de alelos [21].

A eficiência catalítica de UGT1A8 * 3 (C277Y) e UGT1A9 * 3 (M33T ) allozyme direção ácido micofenólico foi drasticamente reduzido [29]. variação alelo em um dos muitos loci UGT pode leva a alterações bioquímicas significativas na droga potencial metabolizar. Essas enzimas UGT são conhecidos por degradar cancerígenos; a falta de função podem desempenhar um papel importante na etiologia de um episódio carcinogénico tal como o cancro colo-rectal.

Para uma melhor compreensão do papel de UGT1A no tracto gastrointestinal, o estudo focou em UGT1A8 em o tracto gastrointestinal. Com base em relatórios anteriores [35], reconhecemos mudanças de expressão e função do UGT1A8 pode ser um fator de risco de câncer colorretal. Neste estudo, foi examinada a expressão de genes polimórficos UGT1A. Testamos o genótipo de UGTlA8 em pacientes com câncer colorretal e explorou relação entre o polimorfismo dos genes UGTlA8 e cancro colorectal.

Materiais e Métodos

2.1 O material clínico

(1) grupo câncer colorretal, 150 pacientes (90 mulheres e 60 homens, idade média de 56,8 ± 11,3 anos) foram selecionados em nosso Departamento de Cirurgia Geral, Qilu Hospital, Universidade de Shandong, província de Shandong, na China. Estes pacientes foram selecionados de acordo com o padrão de Amesterdão II [36], o que impede o câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) e polipose adenomatosa familiar (FAP). Elegibilidade foi determinado se o diagnóstico primário ocorreu até seis meses antes da participação no estudo, com diagnóstico final confirmado através do Departamento de Patologia.

Nenhum dos pacientes receberam quimioterapia, radioterapia ou BIOTERAPIA antes da recolha de amostras. 120 indivíduos normais (48 mulheres e 72 homens, com idade média de 57,2 ± 11,9 anos) foram selecionados a partir Department of Interventional Gastroenterologia em Qilu Hospital, Universidade de Shandong. 72 amostras normais hepáticas de tecido de voluntários (30 mulheres e 42 homens, com idade média de 56,5 ± 10,2 anos) foram obtidos por meio do Departamento de Cirurgia Geral, Qilu Hospital da Universidade de Shandong. marcadores de série de vírus da hepatite de soro foram negativos nestes 72 indivíduos. Dez indivíduos foram encaminhados para hemangioma hepático e quatorze foram encaminhados para cisto hepático. Revisão de prontuários médicos em todos os assuntos acima referidos indicou a ausência de comportamentos crônicos tomando drogas, bem como a ausência de tabagismo e etilismo. Foram tomadas medidas de normalização de amostras adicionais, incluindo a cessação do tabagismo 6 meses antes da coleta da amostra de tecido, e jejum pelo menos 12 horas antes dos procedimentos cirúrgicos e coleta de tecido.

(2) 327 pacientes (123 mulheres e 204 homens , com idade média de 56,4 ± 11,0 anos), com câncer colorretal foram triados no Departamento de Cirurgia Geral e do Departamento de Gastroenterologia, Qilu Hospital, Universidade de Shandong. Estes pacientes foram selecionados com base em padrões de critérios Amsterdam II como antes [36]. No grupo controle, houve 327 voluntários pareados por sexo (idade média de 54,2 ± 10,3 anos). Em média, os voluntários eram dois anos mais jovem do que pacientes com câncer colorretal (p 0,05). Todos os indivíduos eram povo Han provenientes da área comum da província de Shandong, na China, sem relação consanguinous. Os questionários foram administrados por enfermeiros especialmente treinados para estudar assuntos em pessoa. O questionário coletou informações sobre fatores de estilo de vida, tais como a atividade física; uso de álcool e tabaco; médico, família e histórico de trabalho; eo uso de over-the-counter medicamentos. Além disso, a fim de preservar arquivos epidemiológicos e avaliar a exposição individual a agentes cancerígenos alimentares, questionário detalhado foi usado para medir o consumo médio alimentar um ano antes do diagnóstico de câncer colorretal, ou um ano antes da data de seleção para controles. Não houve outras diferenças significativas (por exemplo, por idade, história familiar de cancro colorectal, tabagismo, ingestão total de carne, escolaridade ou renda) entre os indivíduos que forneceram amostras de sangue e população em geral. Consentimento Informado foi obtido, eo estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Shandong.

2.2 As amostras de tecido e reagentes

(1) No grupo câncer colorretal, 150 pares de amostras (1 cm × 1 cm x 1 cm), foram colhidas por cirurgiões que operam a partir de 150 doentes com cancro colorectal durante a colectomia parcial. As amostras foram, em seguida, arrefecida a 0 ° C de solução salina. Cada pares de amostra foi composta por tecido maligno e tecido saudável circundante. tecidos saudáveis ​​foi colhido a uma distância de mais de 5 cm da margem de ressecção de cancro colo-rectal. 120 amostras da mucosa do cólon saudáveis ​​do grupo controle foram colhidas através enteroscópio elétrica. O exame macroscópico da mucosa saudável de grupo de estudo e indivíduos controle não mostrou sinais de deterioração, tais como necrose. O exame microscópico com microscópio de luz documentado histologia normal. Os tecidos estavam livres de tumor e qualquer doença concomitante detectável como a colite, displasia. mucosa do cólon foi dissecado e obter amostras de tecido livre de muscularis cólon e a maioria da submucosa. Isto permitiu uma comparação directa com o epitélio hepática, minimizando a presença de tipos de células não epiteliais. 72 amostras de tecido hepático de voluntários foram obtidos através laparoscópio a uma distância de mais de 5 cm a partir do bordo de ablação cirúrgica. As amostras foram seleccionadas quanto à ausência de doença histologicamente aparente como a hepatite, e cirrose do fígado para minimizar o viés da amostra. Depois de ter sido encapsulado no invólucro de folha de estanho e rotuladas, todas as amostras de tecido foram lavadas em NaCl a 0,9% frio, e imediatamente congelados em azoto líquido dentro de 10 minutos após a remoção cirúrgica e foram continuamente armazenados a -80 ° C até à sua utilização.

a transcriptase reversa MMLV foi adquirido de Sigma Chemical Co. TaqDNA polimerase foi adquirida da Shanghai Shengong Co. reagentes necessários em sistemas de reacção de transcrição reversa (RT) e reacção em Cadeia da polimerase (PCR) foram fornecidos pelo tumor Immunityand Genetic Engineering Laboratories chave. kit UGTlA foi comprado de Gentest Corp.

(2) 5 ml de amostras de sangue total venoso periférico foram coletados de 327 pacientes com câncer colorretal e 327 casos de adultos saudáveis. Ambos os grupos foram submetidos a jejum de pelo menos 12 horas antes da coleta da amostra. Ácido citrato de dextrose (ACD) foi utilizada para prevenir coagular o sangue até à análise. Os reagentes de lisado de eritrócitos, leucócitos lisado, precipitação de proteínas e hidratação DNA foram fornecidos a partir Medical Genetics Institute of Medical College na Universidade de Shandong. Os reagentes necessários nos sistemas de reacção de RT-PCR e TaqDNA endonuclease foram adquiridos a Promega CO. PCR produtos kit de recuperação de gelatina foi adquirida a BioTek CO. Todos os outros reagentes foram obtidos a partir de fontes comerciais e de grau analítico.

2.3 Detecção de expressão de ARNm em diferentes tecidos UGTlA

A presença de transcritos de ARN em UGT1A tecidual total foi analisada por amplificação por PCR, realizada como um duplex de co-amplificação por RT-PCR com ADNc de β-actina como controlo. Detecção por RT-PCR de todas as transcrições UGT1A previstos pelo locus UGT1A humano foi realizada utilizando o exão 1 iniciadores de sentido directo específicos e os iniciadores anti-sentido, localizados dentro de exões 2-5, ou dentro de uma porção comum da extremidade 3 ‘dos ​​primeiros exões. Todos os iniciadores foram biossintetizados a partir Shenggong CO., Xangai, depois de recuperar no laboratório genómico, como mostrado na Tabela S1.

isolamento do RNA foi preparado de acordo com métodos de isotiocianato de guanidínio. Aproximadamente 200 mg de tecido congelado foi pulverizado num almofariz cheio com azoto líquido. pó tecido foi imediatamente lisadas em solução ácida isotiocianato de guanidínio-fenol. UGT1A ADNc foi co-synthesizd com ADNc β-actina em tubos Eppendorf contendo 1 ug de ARN, 1 ul de MMLV, 7 ul de sistema de RT-PCR, os iniciadores a jusante 1 μ1 .UGT1A de ADNc foi co-amplificado com ADNc de β-actina em um volume de partida de 98 l contendo 20 l reverter produtos de transcrição, 19 ul sistema de PCR, 1 pi primers a montante, 58 mL de água ultra-pura. Após incubação a 94 ° C durante 3 min, ciclo de PCR foi iniciada por adição de 2 ul TaqDNA polimerase seguido por centrifugating. Um total de trinta e cinco ciclos foi realizada. Cada ciclo de PCR consiste em reacções de amplificação a 94ºC durante 1 min, 58 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 1 min, seguido por reacções de alongamento com o tempo de alongamento prolongado de 7 min a 72 ° C. electroforese em gel de agarose analítico foi realizado para identificar os produtos de PCR. Kodak Sistema de Análise de gelatina foi utilizada para avaliar a intensidade de UGT1A e UGT1A isoformas de expressão de acordo com a seguinte fórmula:

As experiências foram realizadas com vários níveis de controlos, incluindo os controlos sem ADNc, iniciadores, ou polimerase termofílica. A especificidade deste ensaio foi determinada por PCR utilizando todos os pares de iniciadores em cada molde de ADNc clonado para excluir a reactividade cruzada. Para confirmar a detecção de ADNc UGT1A específica utilizando este ensaio, os produtos de PCR foram parcialmente sequenciados para documentar a identidade destes produtos de genes específicos.

Isolamento

2,4 de ADN a partir de amostras de sangue inteiro de

300 ul de As amostras de sangue foram infundidas em tubos de 1,5 mL Eppendorf. 900 ul de lisado de eritrócitos foi adicionada à amostra. A digestão foi deixada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A amostra foi então centrifugada a 12.000 g durante 20 segundos e os sobrenadantes límpidos foram removidos. 50 ul de lisado de eritrócitos e 300 ul de lisado de leucócitos foi adicionado para ressuspender o sedimento, seguido por 30 minutos de digestão, à temperatura ambiente. A proteína foi precipitada por adição de 100 ul de precipitação de proteína e a amostra foi depois centrifugada a 12000 g durante 20 segundos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf de 1,5 mL, seguido por instilação lenta com etanol desidratado pré-refrigerada duplo Volumed. A amostra foi vacilou ligeiramente até a precipitação DNA. A amostra foi, em seguida centrifugação a 9000 g durante 1 minuto e os sobrenadantes límpidos foram removidos. 500 ul de etanol a 75% foi adicionado ao precipitado, seguido por centrifugação a 9000 g durante 1 minuto, os sobrenadantes foram removidos e precipitado de ADN foi deixado secar ao ar. hidratação de ADN foi adicionada para re-hidratar o ADN e solução diluída de ADN a uma concentração de 20 mg /L para utilização posterior, após a quantificação de ADN por meio de espectrofotometria de ultravioletas. O DNA foi re-hidratada com água pura a uma concentração de 20 mg /L. A concentração foi verificada com espectrofotómetro ultravioleta antes de utilização posterior.

A amplificação de 2,5 UGT1A8 exão-1 por PCR

Exon-1, localizada na extremidade 5 ‘de UGT1A8 humano, apresenta indivíduo variação na sua regulação. Os iniciadores foram concebidos com base na matriz do locus do gene UGT1A (número de acesso AF297093). iniciador directo (prlA8F, bases34175-34198): 5’-TGG GGT CAG GTT TTG TGC CTG TAG-3 ‘, o iniciador inverso (prlA8F, bases 35.175-35.208): 5’-GAA ATT GTC AAA TCA CAA TTC AGT AAG GAA TCT -3 ‘. A condição de reacção foi ajustado para 4 mL de 5 reacção × PCR, 4 uL de 5 × dNTP, 0,5 ul de iniciador directo, 0,5 ul de iniciador inverso, 5 endonuclease de ADN uL de Taq, 2 ul de molde de ADN, e o volume óptico suplementar de três vezes estéril de água, o que fez-se um volume total de 100 uL destilada. 35 ciclos de reacção de amplificação foi realizada. Cada ciclo consistiu de uma desnaturação a 95 ° C durante 30 segundos, a reacção de recozimento a 57 ° C durante 30 segundos, e extensão a 72 ° C durante 30 segundos. O ciclo completo foi precedida por uma incubação de 3 minutos a mistura de reacção a 95 ° C e seguida por 10 minutos de alongamento a 72 ° C. Identidade dos produtos de PCR foi confirmada com electrophrosis gel.

2,6 Purication e sequenciação dos produtos de PCR

produtos de PCR foram coradas com brometo de etídio durante 15 min, e isolado com gel de agarose a 20 g /L , a uma voltagem de 120 V durante 1 hora. As tiras de DNA amplificados foram cortadas sob a lâmpada ultravioleta a 320 nm e colocados em tubos de 1,5 mL Eppendorf. volume de quadruplicado de tampão de ligação foi adicionada a as tiras de ADN. Após incubação com banho de água a 65 ° C durante 7 min, a mistura foi transferida para colunas e centrifugado a 12000 g durante 1 minuto. 300 ul de tampão de ligação foi usada para limpar a coluna após o descarte da solução. Outro 750 ul de Tampão de Lavagem de ADN foi adicionada à amostra e a centrifugação foi repetida a 10.000 g durante 1 minuto. A solução misturada foi centrifugado a 12000 g durante 1 minuto antes de deitar fora os sobrenadantes. Após remoção do sobrenadante, as amostras foram transferidas a partir de tubos de 1,5 ml de Eppendorf em coluna. Em seguida, 30 ul de tampão de ADN de água foi adicionada à coluna, a mistura foi então centrifugada a 12.000 g durante 1 minuto. A solução foi recolhido para quantificação e análise adicional. Os fragmentos de ADN recolhidas de diferentes genótipos foram transferidos para TOPO TA plasmídeo As amostras de DNA foram sequenciadas em Medical Genetics Institute of Medical College of Shandong University com um sequenciador totalmente automático (prisma 377, ABI CO., EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Este estudo utilizou as mesmas medidas de controle de qualidade descritos por Lesley M. Butler, et al. [37]. Primeira, controlos positivos e negativos foram incluídos em cada experiência de PCR e Taqman. Homozigoto de tipo selvagem, heterozigotos e homozigotos variantes para cada genótipo UGT1A8 a partir de amostras de ADN genómico de genótipo UGT1A8 foram incluídos. Em segundo lugar, os ensaios repetidos foram realizados em três amostras seleccionadas aleatoriamente a partir de cada experiência e houve 100% de concordância. Em terceiro lugar, três amostras selecionadas aleatoriamente adicionais foram confirmadas por sequenciação directa do ADN. Finalmente, o pessoal do laboratório não tinham conhecimento do status do caso das amostras.

2.7 estatística A análise

O pacote de software de SPSS11.0 foi usado para analisar dados deste estudo. Os dados quantitativos foram expressos como média ± o desvio padrão (± × s). As comparações entre as médias de dois grupos de amostras foram feitas com

t

-teste, enquanto vários meios do grupo foram analisados ​​de Student por ANOVA. Resultados de estudos de caso-controle foram analisadas pelo teste exato de duas caudas de Fisher para determinar a diferença de distribuição de múltiplos alelos entre casos e controles. OR ajustadas e IC de 95% para o câncer colorretal foram calculados utilizando modelos de regressão logística. IC de 95% foram utilizados, salvo indicação contrária. OR ajustadas e IC de 95% foram utilizados para avaliar os efeitos dos alelos UGT1A8, genótipo e sexo na susceptibilidade para o cancro colorectal. Um valor-p de 0,05 ou menos foi definido como estatisticamente significativo.

Resultados

3.1 Variação de expressão de mRNA UGT La

Todos os transcritos do gene UGT1A humanos exibir um único 5 ‘terminal característico de cada um dos transf individual e um comum 3’ porção codificada pelos exões 2-5. A região 3 ‘é idêntico em todos os membros codificados pelo locus UGT1A e pode, portanto, ser explorados para analisar a expressão global UGT1A. A co-amplificação dos produtos de PCR humanos β-actina de 487 pb UGT1A e 317 pb, separados num gel de agarose a 2% e corados com brometo de etídio, é demonstrada usando tecidos cancerosos, os tecidos circundantes saudáveis, tecidos de cólon normais de pacientes de controle e tecidos hepáticos. Largura e intensidade de β-actina (317 pb) em painéis foram consistentes como esperado. A amplitude ea intensidade da UGT1A mRNAs (487 pb) foram muito mais variável. A quantificação dos produtos DRT-PCR foi realizada através do cálculo em relação coeficiente usando Kodak Gelatina Analysis System. No entanto, a quantificação revelou diferenças significativas nos níveis de estado estacionário entre três fontes extra-hepática e tecidos hepáticos.

Em pacientes com câncer colorretal, a expressão do mRNA UGTlA foram significativamente reduzidos nos tecidos patológicos em comparação com os tecidos saudáveis ​​circundantes colhidos juntos. a expressão de ARNm em tecidos saudáveis ​​UGT1A colhidas a partir de pacientes com cancro colorectal foi significativamente menor do que o tecido saudável do cólon colhidas a partir de controlo normal. O nível mais elevado de expressão de ARNm de UGT1A foi detectado em tecido hepático, o que foi significativamente mais elevado do que os tecidos normais do cólon de controlos saudáveis ​​(P 0,01), (Table.1). expressão dos genes do cólon UGTlA foram caracterizados por variação individual significativa, enquanto expressões de mRNA UGTlA hepáticas foram mais uniforme.

3.2 expressão polimórfica de isoformas UGT1A em diferentes tecidos

Análise da expressão gênica UGT1A era realizada ao nível do ARNm específico empregando UGT1A exão 1-DRT-PCR. Como relatado anteriormente, hepáticas humanas e tecidos do cólon são caracterizados por uma expressão diferencial único e específico do tecido do UGT1A locus de [11], [12]. Produtos de exão 1-específica DRT-PCR detecta especificamente transcrições de todas as isoformas UGT1A conhecidos. tiras de ADN foram separados em 2% de agarose e coradas com brometo de etidio (figura 1). Das isoformas analisadas família UGT1A, UGT1A5 e ARNm 1A7 não foi detectada em todas as amostras de tecido, e o número de amostras expressa isoformas UGT1A era diferente em tecidos diferentes. Análise de 150 diferentes transcritos UGT1A de tecidos cancerosos demonstraram o seguinte: UGT1A1, 1A8 e 1A10 ARNm foram expressas em 102 amostras (figura 1.A). UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A8, 1A9 e 1A10 mRNA foram expressas em 54 amostras (Fig.1.b). UGTlAl, 1A3, 1A6, 1A8 e 1A10 ARNm foram expressos em amostras de 66 (Fig.1.c). UGTlA3, 1A4, 1A8, 1A9 e 1A10 ARNm foram expressas em 108 amostras (Fig.1.d). A expressão das isoformas polimórfica UGTlA em diferentes tecidos foi mostrado na Fig.2 e table.2. Em contraste com tecidos cancerosos, UGTlA8 e ARNm UGTlAl0 não foram expressos nas 72 amostras de tecido hepático diferentes. Houve pouca variação na abundância de transcritos de UGTlA isoformas quando cada foi comparado com os níveis de expressão de p-actina. níveis UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6 e mRNA 1A9 foram diferencialmente regulada nos tecidos cancerosos em comparação com circundante mucosa normal (P 0,01), no entanto, os níveis de UGTlA8 e mRNA UGTlAl0 foram regulados positivamente (P 0,01).

AT: tecidos de cancro do cólon; N: Em torno mucosa saudável; M: Marcador

produtos A.PCR de UGTlA8 exão-1 (1 033 pb). 1,2,3: Os produtos de PCR de UGTlA8; M: Marcador. B.Sequenced resultados de alelos uGTlA8. A: UGTlA8 * 1; b: UGTlA8 * 2; C: UGTlA8 * 3

Estes dados demonstram que o locus UGT1A é expressa no tracto gastrointestinal humano.. Os dados também notar regulação polimórfica e variação individual de UGTl Um locus do gene para a transcrição de ARN. Além disso, a identificação da expressão específica de tecido de UGT1A8 implica que os mecanismos de regulação podem ser indicativos do desenvolvimento evolutivo e a base biológica determinar as variações individuais do risco de cancro.

3.3 Identificação de matriz de ADN extraiu-se a partir de amostras de sangue inteiro de

SeqMan de software DNASTAR de Biologia Molecular foi utilizado para analisar as sequências dos produtos de PCR. sequências detectadas foram comparados com critérios pré-especificados padronizados por projecto do genoma humano [HGP] para determinar locais de SNP e frequência de alelos, análise após agrupada dos resultados seqüenciados e várias exclusões de picos fantasmas e setores defeituosos. A distribuição da população de alelos conheceu Hardy-Weinberg por χ2 test (graus de liberdade = Número de alelos-1). O comprimento dos produtos de PCR foi 1,033bp (Fig.2.A). Resultados sequenciados de produtos de PCR purificados indicaram que havia três SNPs no par de bases 518 (CG), do par de bases 765 (AG) e do par de bases 830 (GA) dentro da região codificadora do exão UGT1A8-1 (Fig.2.B, tabela S2) .A mutação no nucleotídeo 518 leva a mutação missense no códon 173, como resultado, alanina é substituída por glicina. A mutação no nucleótido 830 resulta na substituição de tirosina por cisteína codificada pelo codão 277. A mutação no nucleótido 765 é mutação silenciosa. Os polimorfismos funcionais são mostrados na Tabela S2. Para a maioria das amostras com uma mutação heterozigótica, apenas uma única mutação estava presente, indica as três mutações pontuais não são ligados (Tabela S2, S3). Para melhorar a precisão, os fragmentos de DNA recolhidos de diferentes genótipos foram transferidos em plasmídeos de clonagem TOPO TA. Vários clones de cada amostra de ADN foram caracterizados por análise da sequência de ADN. Em todos os casos, os padrões de mutação correspondia à identidade dos alelos, conforme descrito na Tabela S2 e Table.S3. Genótipo de amostras pode ser verificado através de clonagem TOPO de fragmentos de DNA, neste caso UGTlA8 * 2 e UGTlA8 * 3 alelos foram identificados utilizando TOPO clonagem.

3.4 Análise de frequência de alelos e genótipos de UGT1A8

no grupo controle, a freqüência do alelo de UGTlA8 * 1 (tipo selvagem) e UGTlA8 * 1a era dominante (79%), seguido de 18,8% para UGTlA8 * 2. A identidade do UGTlA8 * 3 foi realmente rara, com apenas 2,3% dos controles observados para realizar este genótipo (Table.3, Figure.3). UGTlA8 * la é uma mutação silenciosa e codifica UGTlA8 * l. Um padrão de homozigotos de UGTlA8 * 1 (UGTlA8 * 1 /* 1, UGTlA8 * 1 /* 1a, UGTIA8 * 1a /* 1a) representaram cerca de 65,21% dos adultos normais (Table.4). Verificou-se que o genótipo de UGTlA8 * 1 /* 2 e UGTlA8 * 1a /* 2 foi a uma frequência de 24,64%, o genótipo UGTlA8 * 1 /* 3 e UGTlA8 * 2 /* 3 estava a uma frequência de 4,35%, UGTlA8 * 2 /* 2 foi a uma frequência de 5,8% nos controles. Curiosamente, não foi UGTlA8 homozigóticos * 3. No caso de pacientes com câncer colorretal, a freqüência do alelo de UGTlA8 * 1 e UGTlA8 * 1a, UGTlA8 * 2, UGTlA8 * 3 constituído de aproximadamente 61,5%, 22,0% e 16,5% (Figure.3), respectivamente. A expressão de heterozigotos UGTlA8 * 1 /* 2 UGTlA8, consistem naqueles com um genótipo de UGTlA8 * 1 /* 2 UGTlA8 e UGTlA8 * 1a /* 2, estavam a uma frequência de aproximadamente 18,84%. 28,98% dos indivíduos com cancro colo-rectal expressa UGTlA8 * 1 /* 3 e UGTlA8 * 2 /* 3. O genótipo homozigoto da UGT1A8 (UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 1, UGTlA8 * 2 /UGTlA8 * 2) composta de 46,38%, 4,35% dos casos cancerosas, respectivamente. Um caso de UGT1A8 homozigoto * 3 também observou (Table.3). Houve diferenças estatisticamente significativas na frequência de alelos e genótipos entre o grupo estudo e grupo controle. O alelo de tipo selvagem (UGTlA8 * 1) frequência foi menor entre grupo de estudo do grupo de controle [P = 0,000, OR = 0,45; IC (0,28-0,79)]. O mesmo significado pode ser observado com o genótipo UGTlA8 * 1 /* l [P = 0,000, OR = 0,28; IC (0,19-0,41)] e UGTlA8 * 2 /* 3 [P = 0,000, OR = 10,58, IC (4.48- 24.98)] (Table.4 e Fig.4). Os resultados opostos foram observados em alelo UGTlA8 * 3 [P = 0,000, OR = 6,99, CI (3,39-14,42)] (Table.3 e Fig.4) e do genótipo UGTlA8 * 1 /* 3 [P = 0,000, OR =