Abstract

Ao usar um tag sequência algoritmo de bioinformática expressa, identificamos que

Lin28 homólogo B

(

Lin28B

) pode ter um padrão de expressão oncofetal que possam facilitar a detecção de células cancerígenas em adultos. Ele também é relatado para ser um potencial marcador para câncer de células estaminais. Por isso, procuramos verificar personagens oncofetal-stemness de

Lin28B

e testar seu potencial como um marcador de células-tronco como câncer circulantes em pacientes com CHC adultos.

Lin28B

mRNA foi examinada num painel de tecido fetal, tecido adulto e tumores.

Lin28B

foi sobre-expressos ou derrubado em células HepG2 para avaliar o seu potencial como um marcador de células-like-tronco. RT-qPCR para

Lin28B

foi realizada nas células mononucleares do sangue periférico de doentes com carcinoma hepatocelular que recebe a cirurgia (n = 96) e controlos não-HCC (n = 60) e analisado o seu significado clínico.

Lin28B

mostrou um padrão de expressão oncofetal. Sua sobre-expressão poderia upregulate marcadores stemness (OCT4, NANOG e SOX2) e melhorar tumorsphere formação

in vitro

.

Lin28B

knockdown teve efeitos opostos. Circulating

Lin28B

foi detectada em células mononucleares do sangue periférico em 3 casos (5%) dos controlos não-HCC e 32 casos (33,3%) dos pacientes de CHC. Em doentes de HCC, circulando

Lin28B

foi associada com alto grau de tumor (P = 0,046), de tamanho grande (P = 0,005), de alta fase AJCC (P = 0,044) e fase BCLC (P = 0,017). Circulando

Lin28B

foi significativamente associada com a diminuição da sobrevida livre de recidiva (P 0,001). Circulando

Lin28B

separados HCC fase inicial em 2 curvas de sobrevida livre de recidiva (p = 0,003). Na análise multivariada, que circula

Lin28B

foi uma variável independente associada à recidiva precoce (P = 0,045) e recorrência na HCC fase inicial (P = 0,006). Em conclusão, o gene oncofetal

Lin28B

é um potencial oncofetal-célula cancerosa-stem-like circulando marcador de células tumorais que se correlaciona com HCC recorrência após a hepatectomia. Circulando

Lin28B

poderia refinar estágios AJCC início. A nossa descoberta apoia a possível utilização de um TNMc (C para células tumorais circulantes) sistema de estadiamento no HCC

Citation:. Cheng S-W, Tsai H-W, Lin Y-J, Cheng P-N, Chang Y-C, Yen C-J, et al. (2013)

Lin28B O que É um oncofetal circulação Cancer Stem Cell-Like marcador associado a recorrência de carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 8 (11): e80053. doi: 10.1371 /journal.pone.0080053

editor: Xin Wei Wang, do National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de abril de 2013; Aceito: 30 de setembro de 2013; Publicação: 14 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este foi suportado por DOH101-TD-C-111-003 concessão do Departamento de Saúde, Taiwan, conceder NSC 97-2320-B-006 -027 -MY3 e conceder-NSC-99-2628-B-006-034-MY2 do Conselho nacional de Ciência, Taiwan e NCKUH Research Grant (95) No. 67, do Hospital da Universidade nacional Cheng Kung, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é uma das principais causas de morte por câncer em Taiwan e um dos cancros mais comuns em todo o mundo [1]. Portanto, é imperativo identificar biomarcadores para predizer o desenvolvimento de HCC e o resultado clínico. Alfa-fetoproteína (AFP) e glipicano-3 são marcadores tumorais correntes para o HCC. Ambos pertencem a oncofetal genes que são definidos como os genes expressos em embriões ou fetos, desligado ou suprimida em tecidos adultos, mas re-expressas em células tumorais [2,3]. genes oncofetais /proteínas tendem a ser bons marcadores tumorais devido à baixa expressão de fundo nos adultos. Em um estudo anterior, foi utilizada uma abordagem bioinformática e experimental combinado para procurar novos genes oncofetais [4]. Nós categorizados 6118 expressa tag sequência (EST) bibliotecas em 3 grupos: imaturo (n = 483), maduro (n = 1.724) e tumor (n = 3911). Ao usar as frequências calculada do gene AFP em cada grupo como referência para definir os limiares de análise bioinformática, foram identificados com sucesso 44 genes desconhecidos com potenciais padrões de expressão oncofetais. Um dos genes, foi ainda estudado LRRC16B [4]. O resultado suporta que este algoritmo bioinformática pode trazer para fora genes oncofetais com funções importantes. Também estiveram presentes na nossa lista gene era o gene

Lin28 homólogo B

(

Lin28B

), que era desconhecido na época. As frequências calculados de

gene Lin28B

nas bibliotecas de imaturos e grupos maduros, tumor foram 22, 5 e 28, respectivamente, com relação entre grupos maduros do tumor e (tumor /maduro) estimado em 5.6 (Tabela S1 ).

Os homólogos de mamíferos de lin-28,

Lin28

e

Lin28B

, são proteínas de ligação microRNA. Eles regulam let-

7

através da ligação ao lacete terminal do

let-7

família precursores de miRNA e bloquear a sua transformação em miRNAs maduros, resultando em desrepressão de

let-7

alvos, tais como

K-ras

e

c-Myc

[5,6].

28 Lin

é altamente expresso em embriões e células estaminais embrionárias [7]. Pode reprogramar fibroblastos somáticas humanas para pluripotência quando co-expressas com

OCT4

,

Nanog

e

SOX2

[8]. Assim,

Lin28

pode envolver no desenvolvimento embrionário e manutenção de células-tronco embrionárias. Quanto

Lin28B

, é capaz de promover a proliferação e transformação das células, mas a sua função no desenvolvimento embrionário permanece incerto [9-11].

Lin28B

é frequentemente expressa em HCC e está associada com mau prognóstico do paciente, em comparação com

Lin28

[9-13]. Desde

Lin28

é conhecido por ser um marcador de células-tronco, previmos

Lin28B

também está relacionado com stemness celular e é potencialmente um marcador para câncer de células estaminais. Tal conceito foi suportada por publicações recentes em que

Lin28B

foi mostrado estar associado com o stemness de linhas de células de próstata e do cólon [14,15].

A transcrição reversa quantitativa PCR em tempo real (RT-qPCR) de células de Ficoll-separados ou buffy coat foi usado para detectar a transcrição de células tumorais, como um substituto para a detecção de células tumorais circulantes (CTC) [16-20] . Para diminuir o nível de fundo e aumentar o poder de diferenciação, os marcadores ideal deve ter uma baixa probabilidade de ser expressa em células brancas do sangue ou células endoteliais. Seria ainda melhor se eles não são expressos em qualquer tecido adulto em tudo. Por conseguinte, em teoria, os genes oncofetais deve ser bons marcadores de tumores em amostras de sangue periférico. Desde

Lin28B

é um candidato oncofetal gene que possivelmente está relacionado para conter fenótipos celulares, é um potencial marcador tumoral substituto para detectar câncer de células estaminais que foram mostrados para ter alto valor preditivo para recorrência do câncer e metástase [circulantes ,,,0],21,22].

Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar as características duais oncofetais e em células-tronco do câncer de

Lin28B

e avaliar o seu significado clínico quando detectado em células circulantes em doentes de HCC. A hipótese testada foi que circula

Lin28B

detectada em células mononucleares do sangue periférico é um marcador de câncer de-stem-cell-like oncofetal associado à recidiva ou pior sobrevivência no HCC.

Materiais e Métodos

linhas de células de tumor

As linhas de células utilizadas neste estudo foram hepático humano (Huh-7, HepG2 e PLC /PRF /5), do ovário (PA-1, TOV-21G, SK-OV -3, BG-1, NIH: OVCAR-3, e ES-2), renal (786-O e ACHN), bexiga (T24 e TSGH-8301), mama (MCF-7), pulmonar (A549), e dois pontos (SW480) linhas celulares de cancro. Huh-7 foi obtido a partir de JCRB. HepG2, PLC /PRF /5, PA-1, TOV-21G, NIH: OVCAR-3, ES-2, MCF-7, SW480, T24 e TSGH-8301 foram obtidos a partir de BCRC. A549 foi obtido a partir de ATCC. SK-OV-3 e BG-1 foram um presente amável do Prof. Tzu-Hao Wang [23]. 786-O e ACHN foram um presente amável do Prof. Yeong-Shiau Pu [24]. A549, NIH: OVCAR-3, SK-OV-3, e BG-1 foram mantidas em DMEM /F12. T24, TSGH-8301, Huh-7, HepG2, as células MCF-7 e SW480 foram mantidas em DMEM. 786-O e ACHN foram mantidas em RPMI1640. PLC /PRF /5 e DP-1 foram mantidas em MEM. ES-2 foi mantida na 5a de McCoy. TOV-21G foi mantida em MCDB105 e M199 (1: 1). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA), sob 5% de CO2 a 37 ° C.

As bibliotecas de ADNc e emparelhado amostras de tumor e de tecido não-tumoral

As bibliotecas de ADNc fetal adquiridos de Biochain (Hayward, CA, EUA) foram comparadas com bibliotecas de ADNc humano adulto normais adquiridos em Clontech (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ). tumor emparelhados e tecido não-tumoral de vários órgãos foram coletados de pacientes internados para cirurgia no Hospital National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan.

célula magnética triagem para enriquecer células EpCAM +

EpCAM-positivos PLC /PRF /5, as células Huh-7 e HepG2 foram isolados por célula magnética triagem (MCS), utilizando partículas magnetizáveis ​​monodispersas de acordo com a instruções do fabricante (CELLection

TM Pan-IgG de ratinho kit) utilizando o anticorpo anti-EpCAM (Epitomics, Burlingame, CA). EpCAM

+ e EpCAM

– células PLC /PRF /5, Huh-7 e HepG2 foram lisadas para ensaios de western blot

Retroviral Infecção

Foi utilizado um sistema de retrovial para. superexpressam

Lin28B

nas linhas de células de carcinoma hepatocelular. pMSCVpuro (BD Clontech), vectores pMSCV-LIN28B e pSUPERretro foram co-transfectados em células de pacotes GP2-293T plasmídeos com VSV-G usando o método de fosfato de cálcio durante 48 horas. A célula HepG2 foi semeada em 1 × 10

6 células por cavidade em um prato de 6 cm e incubadas durante a noite sob 5% de CO

2 a 37 ° C. Retroviral sobrenadante foi adicionado com 8 ng /ml de polibreno (Sigma, St Louis, MO, EUA), e utilizado para infectar células HepG2. populações de células HepG2 reunidos expressam quer pMSCVpuro ou pMSCV-LIN28B foram selecionados com 0.7μg /mL de puromicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).

shRNA produção de lentivírus

Foi utilizado um lentiviral sistema de shRNA para derrubar

Lin28B

nas linhas de células de carcinoma hepatocelular. plasmídeos pLKO.1 expressando RNA pequeno hairpin (shRNA) foram adquiridos a partir da Unidade Nacional de RNAi Núcleo (Academia Sinica, Taipei, Taiwan). As partículas de lentivírus foram obtidos a partir da RNAi Core, do Centro de Pesquisa de Medicina Clínica, Hospital da Universidade Nacional Cheng Kung. Para derrubar expressão Lin28B, o shRNA de

Lin28B

(TRCN0000219860, sequência alvo: 5’CATAACAGGTCTTCTTCATAT-3 ‘) foi adoptado. Um plasmídeo pLKO_TRC005 foi utilizado como controlo negativo.

Western blotting

células recolhidas foram dissolvidos por tampão de lise (Lise completa M, EDTA free, Roche), em gelo e, em seguida, centrifugado a 10000 xg, 4 ° C durante 20 minutos. Em seguida, 100 ug de proteína foi carregada e separados por 12% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA). Baixa quantidade de proteína (40 �) foi carregada na célula de ensaio de triagem magnética devido ao número de células total mais baixa recolhida. Os anticorpos primários incluíram coelho anti-Lin28B (tecnologia de sinalização celular), de ratinho anti-OCT4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de coelho anti-Nanog (Epitomics, Burlingame, CA), de coelho anti-SOX2 (Epitomics, Burlingame, CA ), de coelho anti-EpCAM (Epitomics, Burlingame, CA) e de ratinho anti-β-actina (Millipore).

Esfera ensaio de formação de

ensaio de formação de esfera foi realizada como previamente descrito [25]. Resumidamente, as células HepG2 foram semeadas em não revestidas placas de 6 poços de cultura (BD Labware, Bedford, MA) em meio DMEM /F-12 livre de soro (caixão) continha 1% de NEAA MEM, 1X N2, 20 ng /mL de EGF, 10 ng /ml de bFGF, 100 ug /ml de penicilina G, e 100 U /mL de estreptomicina (Invitrogen, Grand Island, NY). Após 9 cultura dia, os poços foram examinados sob um microscópio invertido com uma ampliação x20, eo número de esferas de . 50 m de diâmetro foram contados sob um microscópio de luz

Os pacientes, amostras e dados clínicos

cento e dezenove pacientes que tinham HCC primária à hepatectomia no Hospital da Universidade Nacional Cheng Kung de janeiro de 2006 a dezembro de 2011, foram incluídos. amostras de sangue total pré-cirurgia foram enviados para cobrança de células mononucleares do sangue periférico. Os pacientes com diagnóstico prévio de câncer, metástases à distância antes da hepatectomia, margens cirúrgicas positivas, foram excluídos o diagnóstico de hepatocellur-cholangiocarcinoma combinada (CHC), ou má qualidade RNA amostra. Dez pacientes foram excluídos devido a uma margem positiva cirúrgico ou diagnóstico de CHC e 13 pacientes foram excluídos devido à má qualidade RNA amostra. Foram incluídos 96 pacientes restantes para estudo posterior (Figura S1). O intervalo de seguimento foi a cada 3 meses. Recorrência de HCC foi documentado em cima achados típicos de tomografia computadorizada ou ressonância magnética com ou sem nível de AFP no soro levantado ou confirmação patológica. sobrevida livre de recidiva (RFS) foi definido como o tempo da cirurgia para a primeira ocorrência de qualquer recorrência local ou à distância. sobrevida específica de doença (DSS) foi definido como o tempo da cirurgia à morte relacionadas com o HCC. Os indivíduos foram censurados na última consulta de acompanhamento ou na morte, sem recorrência. Os perfis de pacientes dos 96 pacientes com CHC foram apresentados na Tabela S2. A duração média do acompanhamento foi de 19,7 meses (variação, 0.1-41.5 meses). Quarenta pacientes (41,7%) tinham HCC recorrente (duração mediana até recorrência, 7 meses; escala, 1.5-31.6 meses), incluindo recorrência local em 32 pacientes, metástase em 5 pacientes, e ambos recorrência local e metástases em 3 pacientes. Dez pacientes (10,4%) morreram de HCC (sobrevivência média, 13,8 meses; escala, 1.6-21.9 meses). Para comparação, 60 indivíduos sem HCC (grupo não-HCC) também foram incluídos: 31 indivíduos saudáveis ​​sem uma doença hepática e 29 pacientes com hepatite viral, incluindo 8 pacientes com cirrose (16 HBV e 13 HCV). A média de idade dos indivíduos saudáveis, sem doença hepática foi de 44,1 anos (variação, 20-75 anos, 10 homens e 21 mulheres), e dos pacientes com hepatite foi 49,4 anos (variando de 24-67 anos; 20 homens e 9 mulheres ).

o consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente e do protocolo do estudo conformado com as diretrizes éticas de 1975 Declaração de Helsínquia que se reflete em uma aprovação prévia pela Experiência Humana e Comitê de Ética da Universidade Nacional de Cheng Kung Hospital em Tainan, Taiwan.

preparação de amostras de sangue periférico

amostras de sangue total foram coletadas em tubos de 10 ml isentos de pirogénios contendo 0,12 ml de K

3EDTA 15% (BD Vacutainer K

3EDTA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e, em seguida, mergulhado em volumes iguais de gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha). As células mononucleares do sangue periférico foram recuperados a partir da interfase. As pelotas de células foram lavadas e recolhidas para a extracção de RNA subsequente.

ARN extracção

O RNA total de linhas de tecido e de células primárias foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA). O ARN das amostras de sangue foi extraído usando um kit (QIAamp ARN sangue Mini Kit; Qiagen). De acordo com os protocolos do fabricante

A transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) e transcrição reversa quantitativa PCR em tempo real ( RT-qPCR)

RNA

2 mg foi reversamente transcrito usando SuperScript II (Invitrogen, Grand Island, NY). As sequências dos iniciadores de RT-PCR semi-quantitativos foram apresentados na Tabela S3.

β-actina

foi usado como um gene de controlo interno em RT-PCR. O ADNc foi submetido a RT-qPCR utilizando um sistema LightCycler (Roche, Mannheim, Alemanha). Para RT-qPCR em vários órgãos adultos fetal e normais e amostras de sangue, os níveis de

Lin28B

foram normalizados para

GAPDH que foi utilizado como um gene de referência na detecção de células tumorais circulantes [19 , 26]. Para amostras de fígado e tecido HCC, os níveis de

Lin28B

foram normalizados para

tirosina 3-mono-oxigenase /triptofano proteína de activação de 5-mono-oxigenase, polipeptídeo zeta

(

PLA

) em vez de

GAPDH

porque havia uma ampla gama de variação nos níveis de expressão

GAPDH

entre as amostras de fígado e tecido HCC.

PLA

tinha um nível de expressão meio no tecido do fígado [27] e os seus níveis de expressão foram mais estáveis ​​entre amostras de tecidos de carcinoma hepatocelular. Ambos os iniciadores e sondas RT-qPCR foram comprados (Applied Biosystems; sequências não mostrado) ou sintetizados como projetado por LightCycler Sonda Software Design 2.0. Ambas as sondas TaqMan fluorescentes e as sequências de iniciadores de amplificação personalizados estão listados na Tabela S4. Cada curva padrão foi calculado com diluições em série (10

0-10

6 cópias) de modelos de plasmídeos. O ciclo limiar (Ct) das amostras foi convertido no número de cópias de mRNA usando curvas padrão derivadas de diluições em série de construções de

Lin28B

e

GAPDH

, respectivamente. O ácido nucleico extraído a partir de células HepG2 foi usada como um controlo positivo. Um controlo negativo em que ARN total molde foi substituída por água esterilizada foi incluído. A gama dinâmica de RT-qPCR para

Lin28B

era 10-10

6 cópias de modelos de plasmídeo (Figura S2). Um valor de Ct inferior a 38 e superior a zero indica expressão positiva de

Lin28B

gene, ao passo que um valor de Ct igual a ou maior do que 38 ou nenhum valor Ct indica expressão negativa do gene

Lin28B

.

A análise estatística

A diferença de tumorsphere formação entre

Lin28B

-expressing e linhas celulares -knockdown foi testado para significância usando aluno de

t

-teste.

Lin28B

expressão de mRNA no sangue periférico foi comparada entre grupos usando Wilcoxon rank sum e foi correlacionada com indicadores clínico-patológicas, utilizando o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. curvas e probabilidades de sobrevivência foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier, eo teste de log-rank foi utilizado para avaliar a significância das diferenças entre os grupos. Um leave-one-out validação cruzada foi utilizado para determinar um valor de corte associado com a sobrevivência. modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox univariada e multivariada foi utilizada para determinar o significado de diferentes fatores prognósticos. As análises multivariadas foram ajustadas simultaneamente para a idade, sexo, tipo de infecção viral, cirrose, o grau do tumor, estado de tumores multifocais, nódulos satélite, invasão vascular, tamanho do tumor,

American

Joint

Comissão

de

Cancro

(7ª edição AJCC) fase , cancro do fígado Barcelona-Clinic (BCLC) palco e AFP no soro. A significância estatística foi fixado em

P Art 0,05. A análise de amostras de sangue periférico de 96 pacientes terão% de potência de 80 para detectar uma taxa de risco de 2,2 entre

Lin28B

(+) e

Lin28B viajantes – pacientes com HCC (). As premissas de riscos proporcionais foram verificados pelas parcelas de diagnóstico martingale e desvio e nenhum desvio significativo em relação aos pressupostos do modelo de regressão de risco proporcional existiu.

Resultados

As características oncofetais de Lin28B

Para testar se

Lin28B

é um gene oncofetal, a sua expressão foi examinada num painel de RNA total humano (painel master II, BD Clontech) utilizando RT-PCR (Figura 1A).

Lin28B

foi expressa no cérebro fetal, fígado fetal, placenta adulto normal, testículos, cérebro e medula espinhal. Não foi expressa em outros tecidos adultos. A alteração da expressão do feto para tecidos adultos foi quantificado por RT-qPCR utilizando ARN total seleccionado a partir de fetos humanos de tecido normal (Biochain) e Mestre Panel II (BD Clontech), os painéis de tecido (Figura 1B).

Lin28B

foi expressa nos órgãos fetais, mas foi significativamente regulada para baixo em suas contrapartes adultas, exceto para o cérebro.

A, RT-PCR mostrou que

Lin28B

foi expressa no cérebro fetal e no fígado e nos testículos, cérebro, medula espinal adulta e da placenta. Não foi detectada em outros tecidos adultos. B, RT-qPCR mostrou que

Lin28B

foi marcadamente reprimidos de fetal (bar fechado) para adultos (open bar) os tecidos, excepto para o cérebro. C, RT-qPCR foi realizado utilizando pares de HCC (barra a cheio) e de tecidos do fígado não tumoral (barra aberta). Superexpressão de

Lin28B

( 100 ×) foi observada em 8 amostras de CHC (53,3%). NC, controlo negativo; PC, controlo positivo.

Para o rastreio possível

expressão Lin28B

em diferentes tipos de tumores, RT-PCR foi realizada em várias linhas celulares de cancro humano.

Lin28B

poderia ser detectado no ovário, hepática, e linhas celulares de cancro colorrectal (Figura S3). Para examinar a sua expressão em tumores, RT-PCR foi realizada em cinco casos de tecidos tumorais e não tumorais emparelhados a partir de 5 tipos de cancros comuns (Figura S4).

Lin28B

foi sobre-expresso em alguns dos tumores de mama (1/5), útero (05/01), do pulmão (4/5), de fígado (1/5), e do ovário (1/5) , mas foi expresso em níveis muito baixos no tecido não tumoral. RT-qPCR para

Lin28B

expressão foi ainda realizada em 15 HCC pares de tecido tumoral e não tumoral (Figura 1C). A sobre-expressão de

Lin28B

( 100 ×) foi observada em 8 amostras de tecido de tumor (53,3%). Estes resultados confirmam a natureza oncofetal de

Lin28B

. Duas amostras de tecido do fígado não-tumorais (13%) apresentaram baixo nível de expressão

Lin28B

. Microscopicamente, uma destas duas amostras mostraram cirrose com mudança de célula grande focal e o outro mostrou hepatite crónica com a actividade de interface suave. Os achados histológicos não mostrou nenhuma diferença óbvia dos das amostras de tecido hepático 13 não-tumorais sem

Lin28B

expressão, em que sete casos apresentaram cirrose e 6 casos mostrou hepatite crônica com a atividade interface. Quatro casos apresentaram alteração de grandes células e um caso mostrou a mudança de pequenas células.

expressão elevada de Lin28B em enriquecida-EpCAM Stem Cell-like população

EpCAM é um marcador de superfície que foi relatado para ser capaz para enriquecer a população hepática stem Cell-like [28]. Portanto, para investigar se

Lin28B

é expressa em células-tronco do câncer, foi realizada a célula magnética triagem (MCS) para separar linhas de células de carcinoma hepatocelular em EpCAM

+ e EpCAM

– populações. O nível de proteína de Lin28B foi aumentada em EpCAM

+ PLC /PRF 5 células /e Huh-7 células (Figura 2A, painel superior), juntamente com o aumento dos níveis de marcadores das células estaminais, SOX2, Nanog e OCT4 em PLC /PRF /5 células e SOX2 e Oct4 em células Huh-7 (Figura 2A, painel inferior). Em contraste, EpCAM-captura não enriquecer a população de células-like-tronco em células HepG2, uma vez que não houve diferença de SOX2, Nanog, ou expressão OCT4 entre EpCAM

+ e EpCAM

– células HepG2 (Figura 2A, painel inferior). Lin28B também não mostrou qualquer diferença entre estas duas populações (Figura 2A, painel superior). Tomados em conjunto, os nossos resultados apoiaram a noção de que Lin28B é expressa em subpopulações de células-like-tronco cancerosas. As análises

Western blot mostrou que Lin28B foi sobre-expresso em capturado EpCAM

+ PLC /PRF /5 células e Huh- 7 células, mas não em EpCAM

+ células HepG2 (a, painel superior). EpCAM

+ PLC /PRF /5 células demonstraram níveis elevados de SOX2, Nanog e OCT4; EpCAM

+ Huh-7 células, SOX2 e OCT4; mas EpCAM

+ células HepG2, nenhum (A, painel inferior). Lin28B-pMSCV HepG2cells apresentaram níveis aumentados de OCT4, Nanog, SOX2 e EpCAM em western blot (B) e formou mais esferas do que as células de controle de vetores (p = 0,032) (C). células sh-Lin28B HepG2 mostraram diminuição dos níveis de OCT4, Nanog, SOX2 e EpCAM em western blot (D) e tendiam a formar menos esferas do que as células de controle de vetores (P = 0,059) (E). SH-Lin28B PLC /PRF /5 células e as células Huh-7 também diminuir a expressão de marcadores de células estaminais (F). Menor quantidade de proteína (40 �) foi carregado no ensaio MCS do que isso (100 ug) carregado no

Lin28B

-overexpression ensaio devido ao número total de células menor recolhido no ensaio MCS. Diferentes sistemas virais foram utilizados nos experimentos: retrovírus em

Lin28B

sobre-expressão de ensaio e lentivírus no ensaio

knock-down

Lin28B. O crescimento celular foi mais lenta quando infectadas com lentivírus. MCS, separação de células magnéticas. barra de escala em C e E, 50 mm.

O aumento no stemness vitro com Lin28B superexpressão

Porque EpCAM não poderia enriquecer o

Lin28B

-expressing tronco cell- como população de células HepG2, foi estabelecido um

Lin28B

-overexpression HepG2 piscina estável por infecção por retrovírus para investigar o efeito de Lin28B em fenótipos semelhantes a células-tronco. marcadores de células estaminais representativos foram analisados ​​por transferência de Western. Em comparação com o controle de vetores, Lin28B superexpressão upregulated os marcadores de células tronco: SOX2, Nanog, e EpCAM. Um ligeiro aumento de OCT4 também foi observado (Figura 2B).

Para determinar o efeito de

Lin28B

no tumor esfera-formação, tanto

Lin28B

-expressing e controle células foram cultivadas em suspensão para gerar esferas como um indicador de um cancro da haste-como propriedade

in vitro

[25,29,30]. Como mostrado na Figura 2C,

Lin28B

-expressing células HepG2 mostraram um aumento tumorsphere capacidade de formação em comparação com as células de controle de vetores (p = 0,032).

Pelo contrário, derrubando

Lin28B

na linha celular HepG2 regulada negativamente a expressão de OCT4, Nanog, SOX2 e EpCAM (Figura 2D) e tende a reduzir a formação tumorsphere (P = 0,059) (Figura 2E). Além disso, derrubando

Lin28B

no PLC /PRF 5 células /e células Huh-7 também subregulado a expressão dos marcadores de células tronco (Figura 2F).

Detecção de mRNA Lin28B na periférica células do sangue de doentes de HCC

RT-qPCR foi aplicada para analisar a expressão de

Lin28B

no sangue periférico células circulantes. A reacção foi linear 10-10

6 cópias de modelos de plasmídeo purificado (Figura S2). A expressão de

Lin28B

pôde ser detectado quando uma célula HepG2 foi reunido com 10

7 leucócitos em cerca de 3 ml de sangue total (Figura S5). Nesta base,

Lin28B

mRNA foi detectada em 3 casos (5%) dos controles não-HCC (1 no grupo saudável e 2 no grupo da hepatite) e em 32 casos (33,3%) do grupo HCC (Figura 3A). A gama de Ct foi 30,57-37,94 para as amostras positivas.

Lin28B

foi expressa em 3 casos (5%) nos controles não-HCC (1 no grupo saudável e 2 em grupo hepatite) e em 32 casos (33,3%) no grupo de HCC. (Bar: média; Preto ponto: não detectável) (A). Os pacientes com HCC recorrente tinha níveis de expressão significativamente mais elevados de

Lin28B

do que pacientes sem HCC recorrente. (P 0,001). (Bar: média; Preto ponto: não detectável) (B). Kaplan-Meier análise mostrou que

Lin28B

foi significativamente associada com a diminuição da sobrevida livre de recidiva (P 0,001) (C). Proporção de

Lin28B

/

GAPDH

mRNA superior a 10

-3 tendem a associar-se com a sobrevivência específica da doença (P = 0,094) (D).

Lin28B

foi significativamente associada com a diminuição da sobrevida livre de recorrência em fase AJCC pacientes I-II (p = 0,003) (E), mas não no palco pacientes AJCC IIIA-IVA (P = 0,419) (F).

Lin28B

foi significativamente associada com a diminuição da sobrevida livre de recorrência em AJCC fase I (P = 0,030) (G) e os pacientes fase II (P = 0,030) (H).

os doentes com HCC recorrente tiveram níveis de expressão significativamente mais elevadas de

Lin28B

do que aqueles sem recorrência (P 0,001) (Figura 3B). A expressão de

Lin28B

em células circulantes foi significativamente associada com o fígado não-cirrótico (P = 0,021), alto grau de tumor (P = 0,046), o tamanho do tumor grande (P = 0,005), alta estágio AJCC (P = 0,044) e fase BCLC (P = 0,017) (Tabela 1). O nível de circulação de Lin28B teve uma associação significativa com o estágio de alta BCLC (fase B para doenças C contra A1 para doenças A4) (p = 0,022) (Figura S6A) e tinha uma significância limítrofe no associado com alto estágio AJCC (estágio IIIC de IVA doenças contra I IIIB doenças) (P = 0,066) (Figura S6B). A análise de Kaplan-Meier mostrou que circulavam

Lin28B

foi significativamente associada com a diminuição da RFS (P 0,001) (Figura 3C). A expressão de

Lin28B

em células circulantes não foi significativamente associada com a diminuição DSS (P = 0,140). Ao usar um método de validação cruzada leave-one-out, a relação de

Lin28B /GAPDH

ARNm superiores a 10

-3 (N = 15) tende a estar associada com a diminuição da DSS (P = 0,094) ( Figura 3D).

Fatores

Grupo

Lin28B

(-) (%)

Lin28B

(+) (%)

P

-valor

Age 60 anos old35 (70) 15 (30) 0.470≥60 anos old29 (63) 17 (37) SexMale46 (67) 23 (33) 1.000Female18 (67) 9 (33) Virus infectionNone10 (83) 2 (17) 0.551HBV34 (61) 22 (39) HCV16 (67) 8 (33) de HBV + HCV4 (100) 0 (0) CirrhosisAbsent28 (56) 22 (44) 0,021

* Present36 ( 78) 10 (22) Tumor grade1-255 (71) 22 (29) 0,046

* 39 (47) 10 (53) multifocal tumorsAbsent53 (65) 28 (35) 0.551Present11 (73) 4 (27) noduleAbsent51 satélite (67) 25 (33) 0.859Present13 (65) 7 (35) tamanho do tumor 5 cm45 (78) 13 (22) 0,005

* ≥ 5 CM19 (50) 19 (50) Vascular invasionAbsent35 (71) 14 (29) 0.312Present29 (62) 18 (38) AJCC stageI, II, III A, IIIB62 (70) 27 (30) 0,044

* IIIC, IVa2 (29) 5 (71) BCLC stageA1-A441 (77) 12 (23) 0,017

* B-C23 (53) 20 (47) AFP Serum níveis de 50 ng /ml44 (73) 16 (27) 0.074≥ 50 ng /ml20 (56) 16 (44) Tabela 1. Correlação de circular

Lin28B

resultados dos testes com indicadores clínico-patológicos do carcinoma hepatocelular.

* P 0,05. o grau do tumor por Edmondson e Steiner sistema de classificação. AJCC, o Comité Misto Americana do Câncer 2010; BCLC, Barcelona-Clinic cancro do fígado; AFP, alfa-fetoproteína. CSV Baixar CSV

A análise univariada revelou que o grau do tumor (P = 0,047), invasão vascular (P = 0,038), estágio AJCC (P 0,001), estágio BCLC (P = 0,030) e circulando

Lin28B

(P = 0,001) foram significativamente associados com a diminuição da RFS (Tabela 2). No modelo multivariado, cirrose (P = 0,043), estágio AJCC (P = 0,001) e circulando

Lin28B

(P = 0,047) foram variáveis ​​independentes associadas com a diminuição da RFS (Tabela 2). o grau do tumor (P = 0,035), estágio AJCC (P 0,001), AFP no soro (P = 0,014) e circulando

Lin28B

(P = 0,001) foram significativamente associados com recidiva precoce menos de um ano na uni modelo (Tabela 3). estágio AJCC (P = 0,004) e circulando

Lin28B

(P = 0,045) foram significativamente associados com recidiva precoce menos de um ano no modelo multivariada (Tabela 3). Quanto DSS, nódulo satélite (P = 0,047) e estágio AJCC (P = 0,046) foram variáveis ​​independentes na análise multivariada (Tabela S5). No entanto,

Lin28B /GAPDH

mRNA superior a 10

-3 não foi um parâmetro independente em DSS.

RFS univariada

RFS multivariada

Fator

Grupo

HR

95% CI

P

HR

95% CI

P

Age 60 /≥60 years0.647(0.341-1.227)0.1820.470(0.218-1.016)0.055SexMale/female0.763(0.371-1.569)0.4620.970(0.439-2.140)0.939Viral /Both1.313(0.118-14.566)3.121(0.201-48.354)Cirrhosis-/+0.717(0.382-1.344)0.2990.419(0.181-0.971)0.043

*Tumor stage 0.001

*0.001

*I/II~IIIB3.421(1.396-8.385)4.929(1.293-18.785)I/IIIC~IVA36.35(3.731-353.236)50.281(4.202-601.720)BCLC stage0.030

*0.085A1/A2-A42.986(1.209-7.374)3.632(1.073-12.288)A1/B-C2.361(1.124-4.961)3.320(0.730-15.110)Serum ng/ml1.642(0.876-3.076)0.1220.778(0.323-1.873)0.575Lin28B-/+2.918(1.559-5.463)0.001

*2.248(1.012-4.995)0.047

*Table 0,05. years0.616(0.293-1.295)0.2010.479(0.189-1.215)0.121SexMale/female0.570(0.233-1.396)0.2190.742(0.276-2.000)0.556Viral /Both1.152(0.104-12.724)2.777(0.156-49.508)Cirrhosis-/+0.576(0.104-12.724)0.1470.437(0.153-1.250)0.123Tumor stage 0.001

*0.004

*I/II~IIIB3.782(1.521-9.405)4.040(0.948-17.221)I/IIIC~IVA37.631(3.860-366.894)47.592(3.692-613.500) stage0.0630.304A1/A2-A42.015(0.639-6.351)2.532(0.606-10.582)A1/B-C2.856(1.190-6.850)2.787(0.536-14.502)Serum ng/ml2.457(1.198-5.038)0.014

*0.964(0.344-2.698)0.944Lin28B-/+3.637(1.749-7.563)0.001

*2.649(1.022-6.862)0.045

*Table 0,05. β-actina foi o controlo interno.