Abstract

factor de crescimento epidérmico do receptor tirosina quinase inibidores gefitinib e erlotinib têm sido amplamente utilizados em pacientes com não-pequenas células câncer de pulmão. Infelizmente, a eficácia do EGFR-TKI é limitada devido à resistência natural e adquirida. Como um novo mecanismo citoprotector para a célula do tumor para sobreviver sob condições desfavoráveis, autofagia tem sido proposto para desempenhar um papel na resistência a drogas de células de tumor. Se autofagia pode ser activado por gefitinib ou erlotinib e, assim, prejudicar a sensibilidade de terapia direcionada para as células do cancro do pulmão permanece desconhecida. Aqui, nós primeiro relatam que gefitinib ou erlotinib pode induzir um nível elevado de autofagia, que foi acompanhado pela inibição da via de sinalização da via PI3K /Akt /mTOR. Além disso, a citotoxicidade induzida por gefitinib ou erlotinib foi grandemente aumentada após a inibição autofagia pela cloroquina inibidor farmacológico (CQ) e siRNAs segmentação Atg5 e ATG7, os componentes mais importantes para a formação de autophagosome. Curiosamente, EGFR-TKI ainda pode induzir a autofagia celular, mesmo depois de expressão do EGFR foi reduzida em siRNAs específicos EGFR. Em conclusão, observou-se que a autofagia pode ser activada por EGFR-TKI em células de cancro do pulmão e inibição da autofagia aumentou o efeito inibidor do crescimento de EGFR-TKI. inibição Autophagy representa, assim, uma abordagem promissora para melhorar a eficácia de EGFR-TKI no tratamento de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas avançado

citação:. Han W, Pan H, Chen Y, Sun J, Wang Y, Li J., et al. (2011) tirosina-cinase EGFR inibidores Activate Autophagy como uma resposta Citoprotector em células de câncer de pulmão humano. PLoS ONE 6 (6): e18691. doi: 10.1371 /journal.pone.0018691

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de novembro de 2010; Aceito: 15 de março de 2011; Publicação: 02 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (número de concessão 30.901.740, www.nsfc.gov.cn), China Ministério da Educação Nacional Grant (número de concessão 20090101120124, www.moe.edu.cn), Ciências naturais Zhejiang Foundation Grant ( conceder número Y2090166, www.zjnsf.net:81) e Projetos de pesquisa do Departamento de Educação Zhejiang (número de concessão Y200805751, www.zjedu.gov.cn) para W. Han, e os Fundos investigação fundamental para as universidades Central para H. Jin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1]. A quimioterapia ainda não é suficientemente eficaz para os pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas avançado (NSCLC) e a taxa de resposta é de apenas 20% a 35%, com uma sobrevivência média de 10 a 12 meses [2], [3]. Ao direccionar moléculas críticos para o desenvolvimento do cancro, a terapia dirigida por si só ou em combinação com outros tratamentos, foi recentemente reconhecido como uma estratégia promissora para conquistar cancros, incluindo NSCLC [4].

Como uma das tirosina-quinases receptoras (RTKs) são importantes para o crescimento do cancro da célula, a proliferação, invasão e metástase, receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) foi frequentemente desregulado no CPNPC [5]. EGFR sobre-expressão foi observada em cerca de 62% de subtipos de células escamosas e adenocarcinoma [6]. EGF pode induzir a ativação de três vias de sinalização importantes para a iniciação ea progressão do câncer, Ras /MAPK, PI3K /Akt, e JAK /Stats [7]. Como resultado, tornou-se um EGFR das moléculas para o desenvolvimento de terapia direcionada para NSCLC. Ao inibir a actividade de tirosina quinase de EGFR, dois inibidores da tirosina cinase (TKI) chamado gefitinib (Iressa, AstraZeneca) e erlotinib (Tarceva, Genentech) têm sido desenvolvidos para o tratamento de NSCLC. Gefitinib e erlotinib pode inibir o crescimento tumoral, tanto in vitro como in vivo. Clinicamente, ambos o EGFR-TKI mostraram boa actividade e tolerabilidade antitumoral em doentes com NSCLC com doença progredir após quimioterapia baseada em platina primeira linha [5], [8], [9]. No entanto, a eficácia de EGFR-TKI é significativamente diminuída pela resistência natural e adquirida. O mecanismo é ainda em grande parte desconhecida, embora mutações de EGFR tem sido proposto para ser um dos mecanismos para influenciar a sensibilidade de EGFR para estes inibidores de [10], [11].

macroautofagia (daqui em diante referido como autofagia) é um processo de auto-proteólise em células eucarióticas que resulta na degradação de material intracelular dentro macroautophagosome ou lisossomos [12], [13]. Sob condições de stress celular, como o ambiente sob deficiência de nutrientes, autofagia é rapidamente activado para proporcionar uma fonte alternativa de energia e, assim, permitir que as células sobrevivam [14]. Autophagy foi regulado positivamente durante a fase posterior de crescimento do tumor por causa da indução de autofagia permite que as células de tumor para sobreviver em microambientes falta de nutrientes e oxigénio [15]. Através de promover a sobrevivência de células de tumor, sob condições desfavoráveis, autofagia foi proposta como um mecanismo alternativo de resistência ao fármaco. Por exemplo, autofagia contribui para a resistência de células de cancro da mama a tratamento com bortezomib [16]. A inibição da autofagia poderia sensibilizar as células tumorais de muitas drogas citotóxicas ou inverter a resistência a drogas quimioterapêuticas, que representa uma estratégia promissora para melhorar a eficácia do tratamento do cancro [17].

Vias de sinalização a jusante de EGFR e outros RTKs, tais como PI3K /Akt estão envolvidos na regulação da autofagia, indicando uma potencial ligação entre a inibição RTK e autofagia. Outra TKI nomeado como imatinib fato pode ativar a autofagia nos respectivos tipos de células [18], [19]. Além disso, o bloqueio da formação macroautophagosome aumenta a eficácia do anti-HER2 trastuzumab anticorpo monoclonal (TZB) [20]. No entanto, se a autofagia está associada a tratamento com gefitinib e erlotinib em células de cancro de pulmão permanece desconhecida. No estudo atual, primeiro demonstrar que gefitinib ou erlotinib autofagia ativados nas células de câncer de pulmão e bloqueio das autofagia reforçado o efeito de gefitinib ou erlotinib.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

Os produtos químicos utilizados foram gefitinib (J K química Ltd., G304000), erlotinib (J K química Ltd., E625000) e cloroquina (CQ) (J K química Ltd., 147236). Os anticorpos primários foram anticorpos contra cadeia leve associada a microtúbulos de proteína 1 3 (LC3) (Cell Signaling Technology, # 2775), Atg5 (Cell Signaling Technology, # 2630), ATG7 (Cell Signaling Technology, # 2631), fosfo-mTOR ( S2448) (Cell Signaling Technology, # 2971), mTOR total (Cell Signaling Technology, # 2983), fosfo-p70S6K (T389) (Cell Signaling Technology, # 9234), fosfo-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, # 4051 ), o total de AKT (Cell Signaling Technology, # 9272), GAPDH (Cell Signaling Technology, # 3683). Os anticorpos secundários foram HRP conjugado anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, sc-2357) e anti-IgG de ratinho (Santa Cruz Biotechnology, sc-2371).

As culturas de células

O cancro do pulmão linhas celulares (A549, NCI-H1299, NCI-H292, NCI-H1650 e SK-MES-1) foram comprados de banco de células (Academia chinesa de Ciências). cultura em monocamada de células de cancro foi mantida em meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v /v) de FBS e antibióticos. Da solução de gefitinib ou erlotinib foi preparada em dimetil-sulfóxido (DMSO) (Sigma, D4540), e diluiu-se com meio antes da utilização. A concentração final de DMSO era . 0,1%

Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade dos produtos químicos contra linhas celulares de cancro do pulmão foi determinada pelo ensaio de MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços (cultivadas durante a noite para células aderentes) e tratou-se com os produtos químicos com diferentes concentrações. Após 48 h de incubação, 20 ul de MTT (5 mg /ml) foi adicionado em cada poço durante 4 horas de incubação. Depois disso, o sobrenadante foi removido e 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço, a fim de solubilizar os cristais de azul-púrpura de formazan. A absorvância foi então medida utilizando um modelo ELX800 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc.) a 570 nm.

microscopia confocal a laser imunofluorescência Para LC3 e lisossoma co-location

Lisossomo foi em primeiro lugar marcadas por incubação com Lyso tracker (Invitrogen, L7528), um corante repórter lisossoma, durante 90 min a 37 ° C. As células foram recolhidas, fixadas e permeabilizadas com tampão de 1% de CHAPS (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, 1,0% de CHAPS) à temperatura ambiente durante 10 min, incubadas com anti-LC3 durante 2 h à temperatura ambiente, e lavou-se com PBS, incubadas durante mais 45 min com cabra conjugado com FITC anti-IgG de coelho (Beyotime, A0562). Em seguida, os núcleos das células foram coradas com DAPI (Sigma, D9564). As amostras foram examinadas com um microscópio confocal sistema 710 LSM Zeiss (Carl Zeiss, Alemanha). A imagem foi processado com software ZEN LE.

Electron microscopia

As células tratadas foram lavadas e fixadas durante 30 minutos em glutaraldeído 2,5%. As amostras foram tratadas com 1,5% de tetróxido de ósmio, desidratadas em acetona e embebidos em resina Durcupan. Secções finas foram poststained com citrato de chumbo e examinadas no microscópio de electrões Tecnai 10 (Philips, Holanda) a 60 kV.

análise Western blot

transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [21] . A proteína foi aplicada a uma concentração adequada de gel de SDS-poliacrilamida, transferidas para uma membrana de PVDF, e em seguida, detectadas pelos anticorpos primários e secundários apropriados antes de visualização com um kit de quimioluminescência. A visualização foi feito com imagem Quant LAS-4000 (Fujifilm, Tóquio, Japão) Software usando a imagem Multi-Gauge (Fujifilm, Tóquio, Japão).

RNA de interferência

As células foram transfectadas com qualquer inespecífica siRNA (Qiagen, 1027280), Atg5 siRNA (Qiagen, SI02655310), ATG7 siRNA (Qiagen, SI02655373) ou EGFR siRNA (Tecnologia Cell Signaling, # 6481) (concentração final de siRNA, 100 nmol /L) por meio de LipofectAMINE ARNi max (Invitrogen, 13778150) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então incubadas durante 48 h antes da transferência de Western ou ensaio MTT.

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado utilizando o método de Trizol e o ADNc foi sintetizado a partir de ARNm com o PrimeScipt RT de MMLV Kit de reagente (Takara, # 6110). Em tempo real da reacção PCR quantitativo foi efectuado utilizando verde de SYBR como o repórter fluorescente (Bio-Rad, 170-8882). QPCR experiências foram realizadas num ABI-7500 e de GAPDH foi servido como um controlo endógeno. Cada amostra foi normalizada com base no seu teor de GAPDH. Um total de 40 ciclos de (5-s de desnaturação a 95 ° C, 34 s annealingt /extensão a 55 ° C) foram corridos para cada iniciador. As sequências dos iniciadores foram os seguintes: para Atg5, TTC AAT CAG GTT TGG TGG AGG C (sentido) e ATG GCA GTG GAG GAA AGC AGA G (antisense); para ATG7, ATG CCT GGG CAT CCA GTG AAC TTC (sentido) e CAT CAT TGC AGA AGT AGC AGC CA (antisense); para GAPDH, GGA GTC AAC GGA TTT GGT (sentido) e GTG ATG GGA TTT CCA TTG AT (anti-sentido).

Análise estatística

Salvo disposição em contrário, os dados foram expressos como a média ± SD e analisadas pelo teste t de Student.

resultados

EGFR-TKI induzir a autofagia em células de câncer de pulmão

Para avaliar a ativação da autofagia por EGFR-TKI, a conversão de LC3-I em LC3-II antes e após o tratamento com inibidores da tirosina quinase foi determinada por análise de transferência de western. Em A549 e as células NCI-H1299, tanto gefitinib e erlotinib pode induzir o interruptor de LC3-I lc3-II na dose e modo dependente do tempo, indicando que a autofagia pode ser activado tanto por TKI (Figura 1A e B). Para confirmar adicionalmente que, a compartimentalização da LC3 em células antes e após o tratamento com inibidores da tirosina quinase foi monitorizada por coloração de imunofluorescência indirecta. Na verdade, inibidores da tirosina quinase induzida a co-localização de LC3-II com lisossoma, demonstrando a formação de autolysosome (Figura 1C e Figura S1). A análise ultra-estrutural por microscopia electrónica confirmou ainda que numerosos vacúolos grandes autofágicos com uma membrana de camada dupla típica contendo restos de organelos apresentados em células A549 tratadas com gefitinib, em vez de células não tratadas (Figura 2A, B e C). Resultados semelhantes foram obtidos com erlotinib (Figura 2D e E).

A e B, as células do cancro do pulmão foram incubadas com concentrações variáveis ​​de gefitinib ou erlotinib durante 24 horas ou incubadas com 25 uM de gefitinib ou erlotinib em intervalos apropriados. O interruptor de LC3-I lc3-II foi detectada por imunotransferência. C, A549 ou NCI-H1299 células foram tratadas com DMSO ou 25 gefitinib uM durante 24 h. As células foram marcadas com fluorescência e fotografada por microscópio confocal. Vermelho, liso lisossomos marcado com rastreador; Verde, LC3 marcado com FITC; Azul, núcleo marcado com DAPI. A sobreposição foi mostrado na coluna da direita. As células manchadas de laranja indicado LC3 co-localizado com lisossomos

As células A549 foram tratadas com 25 mM gefitinib por 24 h (A, DMSO;. B, Gefitinb, de baixa potência; C, Gefitinb, de alta poder). D (baixa resolução) e E (de alta resolução), as células AGS foram tratadas com 25 erlotinib M para 24 h (D, erlotinibe, de baixa potência; E, erlotinibe, alta potência). Numerosos vacúolos autophagical com membrana de camada dupla típica contendo restos de organelos foram destacados por setas. Barra = 1 um.

A seguir, examinou os efeitos de EGFR-TKI sobre a expressão de Atg5 e ATG7, dois componentes críticos na regulação da formação de autofagossomas [22]. Ambos EGFR-TKI aumento Atg5 e ATG7 no ARNm ou níveis de proteína (Figura 3), confirmando a indução de autofagia pelo EGFR-TKI.

A, células A549 foram tratadas com 25? M de gefitinib durante 6 h e o nível de ARNm de Atg5 /7 foi medido pelo tempo real de RT-PCR como descrito em H H. RQ, a quantidade relativa. , células pretas tratados com gefitinib; cinzento, controlar células. B, imunotransferência para Atg5 ou Atg7 utilizando lisados ​​de A549 tratadas com concentrações variáveis ​​de gefitinib ou erlotinib, durante 24 h. Os dados foram expressos como a média ± DP, e analisados ​​pelo teste t de Student. ** P . 0,01

A inibição da Akt /mTOR /p70S6K via de sinalização por EGFR-TKI

Estudos anteriores demonstraram que PI3K /Akt eixo /mTOR /p70S6K desempenha um importante papel na inibição da autofagia [23], [24], que, portanto, investigar o efeito do tratamento com gefitinib e erlotinib nesta via de sinalização autofagia-supressiva. Com efeito, a fosforilação de AKT, mTOR e p70S6K em ambas as células A549 e H1299 foram significativamente reduzidas pelo tratamento com gefitinib e erlotinib num modo dependente do tempo (Figura 4A e B). No entanto, não há alterações de expressão de PTEN foram detectados após o tratamento TKI (Figura 4C e D).

A fosforilação de mTOR, Akt e p70S6K em A549 (A) ou as células NCI-H1299 (B) ou tratadas com gefitinib erlotinib foram determinados por western blotting. A expressão de PTEN em A549 (C) ou células tratadas com concentrações variáveis ​​de gefitinib ou erlotinib NCI-H1299 (D) foram detectados por Western blotting.

O bloqueio de autofagia melhorar EGFR-TKI morte celular induzida por

Muitos estudos têm demonstrado que a autofagia pode servir como uma resposta protectora impedindo as células de tumor da morte celular induzida pela terapia [17], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. Na linha celular de cancro do pulmão NCI-H292 e NCI-H1650, que são relativamente sensíveis a tratamento com gefitinib e erlotinib, não foi detectada após autofagia gefitinib ou erlotinib (Figura 5A). No entanto, foi detectada em autofagia EGFR-TKI tratada células cancerosas que são relativamente resistentes a EGFR-TKI, tais como A549, NCI-H1299 e SK-MES-1, células (Figura 1 e 5a). Estes dados indicaram que a autofagia pode comprometer a sensibilidade das células cancerígenas ao EGFR-TKI. Para testar este consumo, comparou-se o efeito inibidor do crescimento de gefitinib ou erlotinib em células cancerosas antes e após a inibição farmacológica e genética de autofagia. Como mostrado na Figura 5B, CQ, que pode prejudicar a função de lisossomas e inibir autofagia na fase tardia aumentada significativamente a inibição do crescimento induzida por gefitinib ou erlotinib em A549, NCI-H1299 e SK-MES-1, que são relativamente resistentes a EGFR-TKI. No entanto, isso não poderia inibir o crescimento de células de cancro do pulmão pela sua própria. (Figura 5B). De modo semelhante, a inibição do crescimento induzida por gefitinib ou erlotinib em células A549 foi aumentada após autofagia foi inibida por o knockdown de Atg5 ou ATG7 (Figura 5C e D), dois componentes essenciais para a formação de autophagosome, confirmando que protegiam as células tumorais a partir de autophagy EGFR- TKI morte celular induzida.

a, Autophagy foi induzida por EGFR-TKI em células de câncer de pulmão resistentes mas não sensíveis. expressão LC3 em células de câncer de pulmão incubadas com gefitinib 25 � ou erlotinib por 24 h foram analisadas por immunoblotting. B, A viabilidade das células cancerosas tratadas com 12,5 uM de gefitinib ou erlotinib durante 48 h com ou sem 5 uM CQ foram medidos pelo ensaio de MTT. C, A expressão de Atg5 e ATG7 em células A549 transf ectadas transitoriamente com ARNsi de controlo negativo, ou Atg7 Atg5 siRNA foram determinados por immunoblotting. D, células temporariamente transfectadas com ARNsi de controlo negativo, ou Atg7 Atg5 siRNA foram tratados com 12,5 uM de gefitinib ou erlotinib 25 uM durante 48 h. O efeito de EGFR-TKI sobre as células cancerosas, com ou sem Atg5 ou ATG7 knockdown foram analisados ​​pelo ensaio de MTT. NC, ARNsi de controlo. Os dados foram expressos como a média ± DP, e analisados ​​pelo teste t de Student. * P 0,05, ** P . 0,01

EGFR-TKI induzir a autofagia em células cancerosas com EGFR-knockdown

Em seguida, gostaria de saber o papel de EGFR em o gefitinib ou erlotinib induzida autofagia. Dois ARNsi específicos foram usadas para knockdown expressão do EGFR. SiRNA 1 pode reduzir grandemente a expressão do EGFR, enquanto que siRNA 2 teve um efeito moderado na expressão de EGFR (Figura 6A e B). Curiosamente, autofagia activado por qualquer uma de gefitinib ou erlotinib não foi inibida, mas aumentada, após a expressão do EGFR foi dramaticamente reduzida pelo siARN 1 (Figura 6C e D). Em contraste, ARNsi 2 quase não tinha qualquer influência sobre autofagia induzida por ambos o EGFR-TKI (Figura 6C e D).

expressão do EGFR no A549 (A) ou as células H1299 (B) transfectadas com ARNsi de controlo, EGFR siRNA1 ou siRNA2 foram determinados por western blotting. expressão LC3 em EGFR-TKI trataram células A549 (C) ou H1299 (D) com ou sem EGFR knockdown foi determinada por western blot.

Discussão

A autofagia foi designado como celular programada morte tipo II, ao passo que a apoptose é conhecido como morte celular programada tipo I. no entanto, recentemente foi encontrado autofagia para promover a sobrevivência celular sob condições desfavoráveis, tais como a privação de aminoácidos ou ATP, revelando um novo papel de autofagia no desenvolvimento do cancro.

a autofagia é morfologicamente caracterizada pelo aparecimento de vacúolos “double-membrana” (autofagossomas) no citoplasma. Além disso, o homólogo de mamífero da proteína de levedura Apg8p, (também denominado a LC3), é encontrado para ser um marcador bioquímico específico para autofagia. LC3 recentemente sintetizado denominado LC3-1 é uniformemente distribuída por todo o citoplasma. Após a indução de autofagia, alguns LC3-I é convertido LC3-II, que está firmemente ligada às membranas autophagosomal formando estruturas em forma de anel no citosol. Foi confirmada bioquimicamente e morfologicamente autofagia que pode ser activado por gefitinib ou erlotinib, dois bem utilizado EGFR-TKI, em duas linhas celulares de cancro de pulmão independentes. Curiosamente, um papel muito recente relatou que autofagia pode ser induzida por anticorpos anti-EGFR [31]. Ambos os anticorpos de EGFR e EGFR-TKI são amplamente utilizados para tratar a paciente com cancro através da inibição do EGFR, revelando uma nova ligação entre a inibição de EGFR e activação autofagia.

Autophagy pode ser activada como a resposta celular para a terapia do cancro. Um número de terapêuticos para o cancro incluindo agentes quimioterapêuticos que danificam o ADN,-terapias endócrinas (por exemplo, tamoxifeno) e terapia de radiação foram encontrados para induzir autofagia in vitro e in vivo [32], [33], [34]. Recentemente, verificou-se que a autofagia pode ser activado e protegido contra as células tumorais de terapias específicas, tais como o mesilato de imatinib em células do cromossoma-positiva Filadélfia [18], trastuzumab, no cancro da mama [20], os inibidores da família de cinases Src no cancro da próstata [35 ], inibidores de proteassoma no cancro da próstata [16]. Consistentemente, descobrimos que autofagia pode ser activado por tratamento com gefitinib e erlotinib no cancro do pulmão e promover a sobrevivência celular na terapia alvo usando EGFR-TKI. Bloqueio de autofagia por abordagens farmacológicas ou genéticas muito maior o efeito inibidor do crescimento de gefitinib ou erlotinib. Assim, a inibição da autofagia tem o potencial para melhorar a eficácia clínica de EGFR-TKI para o tratamento do cancro.

como um sensor de aminoácidos e de ATP, mTOR regula negativamente autofagia. Com efeito, verificou-se que tanto TKI pode inibir a activação de mTOR bem como o seu regulador a montante, PI3K /Akt. Outra via de sinalização importante para a autofagia é Raf /MAPK caminho [23]. No entanto, não conseguimos encontrar uma correlação clara entre Raf /MAPK via e autofagia em linhas celulares que usamos. Este é provavelmente devido a mutações oncogênicas predominantemente ocorreram em Ras vias /MAPK. Por exemplo, o gene K-ras foi conhecido por ser mutado em células A549. Clinicamente, os pacientes com mutações de K-ras falhou a resposta ao tratamento com TKI. Seria interessante saber se os pacientes com mutações K-ras poderiam se beneficiar da combinação de inibidores da tirosina quinase e inibidores da autofagia.

Curiosamente, nossos resultados indicaram que gefitinib ou erlotinib induzida autofagia pode ser EGFR independente. Como mostrado na Figura 6, ambos o EGFR-TKI poderia induzir autofagia mesmo expressão do EGFR foi grandemente reduzido. Embora gefitinib e erlotinib foram desenvolvidos como os inibidores específicos direccionados para o domínio de cinase de EGFR, no entanto, resultados recentes indiciados que estes dois inibidores podem ter outros objectivos, tais como tirosina-quinases não receptoras que também actua a montante da via PI3K /Akt /mTOR [36]. Consistentemente, os ensaios clínicos de grande escala confirmou que a medição da expressão do EGFR por imunohistoquímica não era útil para pegar os pacientes a ser beneficiado com a terapia gefitinib. Certamente, nós ainda não podia excluir completamente a relevância do EGFR em gefitinib ou erlotinib autofagia induzida desde certa quantidade de EGFR ainda foi detectada após knockdown pelo EGFR siRNAs. Com efeito, o EGFR-TKI activado autofagia foi muito mais melhorada por um siRNA que exibiram a melhor eficiência knockdown de siRNA 2 (Figura 6B). Por isso, precisamos de mais investigações para esclarecer o papel do EGFR na gefitinib ou autofagia induzida por erlotinib. No entanto, o EGFR-TKI de EGFR e siRNA teve um efeito sinérgico sobre a indução de autofagia, o qual poderia ser inibida especificamente para aumentar a eficácia clínica da terapêutica alvo.

Em resumo, o nosso trabalho reforçado a noção de que as células cancerosas pode sobreviver em um ambiente de tensão, com a inibição das vias de oncogénicos críticos, através da indução de autofagia. Estas células tumorais são preparados para retomar a proliferação de uma vez a concentração do fármaco cai após a retirada do medicamento devido à toxicidade ou mutações desenvolvem para conferir resistência à droga. Assim, em combinação de estratégias terapêuticas que visam inibir a autofagia nos pacientes tratados com a quimioterapia convencional ou nova terapia-alvo com EGFR-TKI representa uma abordagem promissora com maior eficácia para pacientes com câncer.

Informações de Suporte

Figura S1 .

Quantificação de autofagia em células de câncer de pulmão tratados com gefitinib. A percentagem de células com sinais de cor de laranja foi calculado por contagem de células 3-4 campos ao microscópio. Os dados foram representados como a média ± SD

doi:. 10.1371 /journal.pone.0018691.s001

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