Abstract
motilidade celular Cancer cálcio-dependente é um fenômeno chave que regula invasão e metástase. Quinase de adesão focal (FAK) desempenha um papel importante na adesão celular e metástase de vários cancros. A relação entre a suplementação dietética de câncer de cálcio e de cólon tem sido extensivamente investigado. No entanto, o efeito do cálcio (Ca
2+) suplementação em calpaína-FAK-motilidade não está claramente entendido. Procurou-se identificar o mecanismo de clivagem FAK através Ca
2 + lactato ligado (Cala), a sua sinalização a jusante e papel na mobilidade das células cancerígenas do cólon humano. Nós descobrimos que o tratamento HCT116 e HT-29 células com Cala aumentou imediatamente as intracelulares Ca
2 + (ICA
2 +) níveis por um período prolongado de tempo. Ca
2+ influxo induzido clivagem da FAK em um N-terminal de FAK (FERM domínio) de um modo dependente da dose. FAK fosforilado (p-FAK), também foi clivado no seu FAK p-N-terminal. Cala aumentou células cancerígenas do cólon motilidade. Calpeptina, um inibidor da calpaína, reverteu os efeitos da cala sobre FAK e clivagem pFAK em ambas as linhas celulares de cancro. A FAK clivada transloca para o núcleo e modula a estabilidade p53 através ubiquitination associada a MDM2. Induzida Cala Ca
2 + influxo aumentou a mobilidade das células de câncer de cólon foi mediada pela atividade calpaína através FAK e pFAK desestabilização proteína. Em conclusão, estes resultados sugerem que uma análise cuidadosa pode ser dada para decidir dietética Ca
2 + suplementação para paciente em tratamento para o câncer metastático
Citation:. Sundaramoorthy P, Sim JJ, Jang YS, Mishra SK, Jeong KY, Mander P, et al. (2015) modulação dos níveis de cálcio intracelular por lactato de cálcio afeta Colon Cancer motilidade celular através Calpain cálcio-dependente. PLoS ONE 10 (1): e0116984. doi: 10.1371 /journal.pone.0116984
Editor do Academic: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido
Recebido: 31 Julho, 2014; Aceito: 17 de dezembro de 2014; Publicação: 28 de janeiro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Sundaramoorthy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Gachon Instituto de Ciências farmacêuticas Fundo de Investigação 2013, Universidade Gachon, República da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:.. Os autores declaram não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do cólon é a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, sendo responsável por mais de 600.000 mortes a cada ano com o aumento da incidência. indução cancerígenos no cólon ocorre através de uma sequência de eventos que levam à metástase envolvendo várias proteínas oncogênicas. Quinase de adesão focal (FAK) desempenha um papel fundamental na progressão do cancro do cólon e é uma importante proteína oncogénica envolvidos na proliferação celular, sobrevivência e motilidade [1,2]. Calpaína é uma protease cisteína bem conservada ativada pelo aumento de Ca
2 + (ICA
2 +). Ele localiza a adesão focal, e potencialmente induz clivagem de proteínas de adesão focais. Comparativamente, os tumores metastáticos contêm níveis mais elevados de calpaina que os tumores não-metastáticas. mediada por Calpain degradação FAK é fundamental para a motilidade em células cancerígenas do cólon humano [3]. Parece que a função da calpaína na adesão celular e a motilidade limita a sua capacidade para clivar componentes de complexos focais, que por sua vez pode aumentar a movimentação de adesão e a progressão do tumor funcionalmente significativa [4,5].
A ACI
2+ é uma molécula de sinalização importantes que modula numerosos processos celulares na fisiologia do cancro, incluindo a motilidade celular. A ACI
2 + é mantido a uma baixa concentração (~ 100 nM) em comparação com o extracelular livre Ca
2 + (1,2 mM) [6,7]. Os baixos níveis de Ca citoplasmática
2 + é mantida através de efluxo activo a partir de células através da membrana plasmática Ca
2 + ATPase da bomba, enquanto reticular sarcoendoplasmic Ca
2 + ATPase remove Ca
2 + pela troca de prótons . Outros Ca
2 + canais permeáveis, tais como canais de cálcio armazenado operados, canais de receptor de potencial transitório (TRP) e a proteína canal de liberação de cálcio activado (CRAC) 1 também estão envolvidos na ACI
2 + homeostase. Remodelação ou desregulamentação de Ica
2 + homeostase em células de câncer provoca alterações na progressão do cancro [8]. A suplementação dietética de Ca
2+ era conhecido para reduzir o risco de adenomas e cancro [9]. No entanto, o impacto de Ca
2+ suplementação dietética permanece desconhecida nas metástases do cancro.
células normais têm uma baixa concentração de lactato extracelular que varia entre 0,5 e 2 mM, mas a concentração de células cancerosas pode ser tão elevada como 30-40 mm [10]. a sobrevivência de células do cancro requer um ambiente intracelular alcalina e ácida ambiente extracelular [11,12]. transportadores monocarboxilato (MCTs) controlar principalmente o movimento de intracelular e extracelular de ácido láctico [13]. Os níveis elevados de MCT1 ter sido detectada em cancro da mama, do cólon, gástrico, e cancros cervicais. expressão MCT4 é altamente elevados em cancros carcinoma, do colo do útero e da próstata renais [14]. MCT4 liberta lactato em resposta a hipoxia, ao passo que a absorção de lactato nas células de tumor oxigenadas ocorre através MCT1 [15,16]. Lactato actua como um substrato para o metabolismo oxidativo em células de tumor oxigenadas.
Com base na informação sobre Ca
2+ suplementação dietética no cancro metastático, foi investigada a motilidade das células do cancro do cólon por exposição directa de Ca
2 + ligado (CALA). Estamos focados no caminho-de células FAK calpaína compreender os mecanismos moleculares subjacentes da motilidade celular do cancro do cólon humano.
Materiais e Métodos
culturas de células
Todas as linhas celulares foram adquirido a partir de American Type Culture Collection (Manassa, Va). cólon humano célula cancerosa linhas HCT116, HT-29, e DLD1were cultivadas em meio RPMI1640. Linha celular de cólon normal CCD-18Co foi cultivada em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina, numa atmosfera humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO
2.
Reagentes e anticorpos
Cala, inibidor de FAK (TAE226), inibidor de calpaína (calpeptina), Flu-03:00 foi adquirido a Sigma (St. Louis, MO). Os anticorpos primários utilizados para análise de Western blot (FAK, pFAK, calpaína-2, p53, MDM2, pMDM2, α-tubulina, lamina B, GADPH) e os correspondentes anticorpos secundários foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (EUA).
Termodinâmica de ião de metal bivalente de ligação ao ácido láctico
para medir as isotérmicas de ligação para a interação do metal bivalente ion Ca
2 + em ácido láctico, calorimetria isotérmica de titulação (ITC) foram realizados experimentos utilizando um Microcal 200 microcalorimetria de titulação isotérmica (Microcal, Inc., Northampton, MA). A coleta de dados, análise e plotagem foram realizadas utilizando a origem pacote de software baseado em Windows (versão 7.0; fornecido pela Microcal). A microcalorimetria de titulação continham células de amostra e de referência mantidas em um recinto adiabática. A célula de referência foi preenchido com água destilada. titulações típicos envolvidos injectando 1,5 mL de 5 mM de Ca
2+ (usando um injector controlado por computador) para a célula de amostra (cheio com 0,5 mM de ácido láctico a pH 7,0). As amostras foram injectadas a intervalos de 2 min para assegurar que as curvas de titulação tinha regressado à linha de base antes da injecção seguinte. A velocidade de agitação da seringa foi ajustado para 1.000 rpm. A absorção ou libertação de calor durante cada injecção foi medido utilizando o calorímetro. isotérmicas de titulação para as interacções de ligação compunham o calor diferencial de fluxos para os diferentes injeções. Estes valores foram então integrados para determinar a variação de entalpia associada com cada injecção. mudanças de calor causadas pela injecção de cada ião metálico em água destilada foram negligenciáveis. Os dados de diluição foram subtraídos dos dados de amostra e pontos de dados ruins foram removidos. O ajuste de dados foi realizada usando software Origin (versão 7.0) e o processo de montagem foi titulada até se obter o melhor ajuste determinado pelo método de minimização de qui-quadrado. Montagem das isotérmicas de ligação desta forma os dados fornecidos sobre a constante de ligação (Ka), a mudança na entalpia (AH) e estequiometria de ligação (n). A ligação de energia livre de Gibbs (ΔG) foi calculado a partir da variação de entalpia (AH) e constante de ligação (Ka) usando a equação: ΔG = RTlnKa ΔHTΔS =, onde R é a constante dos gases e T é a absoluta a temperatura em graus Kelvin [17]. Enquanto isso, do estequiometria (n) das diferentes interações foram determinados a partir do One Conjunto de Sites modelos.
Medição de Ica
2 + concentração
citos�icos sem Ca
2 + concentrações de íons foram medidos utilizando um microscópio de varredura a laser confocal (Leica, Heidelberg, Alemanha). HCT116 cultivadas e células HT-29 foram carregados com 10 Fluo-3 /AM e 1 ul de 25% de Pluronic F-127 (dissolvido em DMSO) e incubados durante 30 minutos a 37 ° C. Depois de colocar sondas de fluorescência, foi adicionado 2,5 mM de Cala e a imagem foi adquirida. Fluo-3 /AM foi animado a 488 nm e fluorescência emitida foi medida em 515 nm. Intracelular Ca
2 + níveis são expressos como razão /F0 F, em que F0 é a intensidade de fluorescência inicial (análise de software Imagem J).
cicatrização de feridas ensaio
Para ferida ensaio de cura, foi utilizado inserção de cultura Ibidi consistindo de dois reservatórios separados por uma parede 500 mm de espessura. As células foram semeadas em duas câmaras (100 ul de 4 × 10
5 células /ml) Ibidi inserção de cultura. Após 24 h de incubação, a câmara foi suavemente removido criando uma diferença de ~ 500 pM. As células foram então deixadas a migrar para as áreas a descoberto durante 6 h. O imagens de células vivas foi feito usando o Juli Br, analisador de células vivas (NanoEnTek Inc, Coreia do Sul).
análise de Western blot
lisados celulares foram preparados e uma quantidade igual de proteína foi separada por SDS-PAGE e colocados a hibridar com a fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas como descrito anteriormente [18,19,20]. anticorpos primários específicos, seguida de anticorpo secundário conjugado com HRP foram usadas para a detecção de proteínas específicas utilizando o sistema ECL (AbClon) para a detecção de sinal.
Análise por imunofluorescência
HCT116 e células HT-29 foram tratadas com cala durante 12 h. As células foram fixadas em etanol frio a 100% durante 20-30 min a -20 ° C, permeabilizadas com 0,3% de Triton X100 em PBS durante 15 min à temperatura ambiente, e lavou-se sequencialmente em PBS. As células foram bloqueadas com soro de cavalo a 3% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente e lavadas com PBS. As células foram então incubadas com anticorpo de FAK (1: 800) com soro de cavalo a 3% em PBS a 4 ° C durante a noite. As células foram lavadas com PBS e subsequentemente incubadas com anticorpo secundário conjugado com Alexa-488 durante 1 h à temperatura ambiente. As células foram então selada com meio de montagem contendo DAPI (Vectashield, Vector Laboratories). As imagens foram capturadas usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM, Nikon A1 +, Japão).
Análise estatística
Todos os dados foram apresentados como a média ± desvio padrão (SD). A significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student e do
P Art 0,05 foi considerado significativo.
Resultados
O ácido lático se liga aos íons de cálcio com alta afinidade
Foram analisadas as propriedades termodinâmicas de Cala e interacções de ligação entre Ca
2 + e ácido láctico por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). dados ITC representativos, relativamente à ligação do ácido láctico em Ca
2+ a pH 7,0 é mostrada na Fig. 1. Mais detalhes, incluindo as constantes calculadas de associação e de entalpia e entropia de associações estão listadas na Tabela 1. Os resultados mostram que o ácido láctico se liga a Ca
2 + com K
d 6,2 × 10
-5 M, uma condição termodinamicamente adequado para formar sal cala. Nossos cálculos termodinâmicos mostrou que uma molécula de lactato se liga a 0,361 Ca
2 + íons, embora molécula de duas lactato se liga a um Ca
2 + íons em teoria. Os dados ITC demonstra a possibilidade de que o ácido láctico extracelular sob a forma de lactato pode formar sal de cala, o que pode existir como uma forma solúvel sob a concentração limite de solubilidade aquosa (7,9 g /100 ml). Estes dados também sugerem que a cala pode ser utilizada para administrar de cálcio intracelular, que pode dissociar sob ambiente variável.
Três isotérmicas representativos são mostrados que ilustra a ligação como uma função do pH a 37 ° C. Superior e painéis inferiores mostram os resultados da titulação calorimétrica de 1,5 mL de 5 mM de Ca
2+ e mistura de ácido láctico a 0,5 mM em Tris-HCl 5 mM a pH 7,0. Para cada titulação, os dados brutos são mostrados no painel superior e os dados de calor integrado são mostrados no painel inferior.
administração Cala aumentou iCa
2 + níveis
Foi avaliado o efeito da administração cala em células de câncer de cólon e analisados os níveis de iCa dissociada
2 +. células HCT116 e HT-29 foram tratados com Cala 2,5 mM que mostrou uma diferença notável nos tempos 0 e 600 segundos em ambas as linhas celulares. A validação experimental foi feito usando ionomicina, um ionóforo usado para elevar iCa
2 + níveis. Ionomicina (10 ^ M) aumentou drasticamente CaI
2 + nos primeiros segundos, seguido por uma diminuição gradual em ambas as linhas celulares (Fig. 2). Embora ionomicina levantada CaI
2+ níveis, estes resultados sugerem que ionomicina não é estável em linhas celulares de cancro do cólon. No entanto, em células HCT116, Cala gradualmente aumentada iCa
2 + para o seu nível máximo em 480 segundos e depois estabilizou (Fig. 2A). Células HT-29 atingiu a máxima CaI
2+ concentração entre 50 e 100 segundos, e, em seguida estabilizou (Fig. 2B). Estes resultados sugerem que cala aumentou iCa
2 + níveis e manteve esses níveis por um período prolongado de tempo.
HCT116 Cultivadas (A) e HT-29 células (B) foram tratados com fluorescência Fluo-03:00 sondas tal como descrito em materiais e métodos. As células foram subsequentemente incubadas com cala de 2,5 mM e 10 pM Ionomicina em DMSO (controlo). A imagem foi adquirida em um ponto de tempo de 0 segundos como inicial e 600 segundos como máximo usando microscópio confocal de varredura a laser (Leica, Heidelberg, Alemanha). A imagem de fluorescência Ca 2+
foi convertido em intensidade de fluorescência e representados graficamente como o indicado F /F0 (análise programa Image J). F0 é a intensidade de fluorescência inicial.
Cala modulada estabilidade FAK
Estudos recentes indicam que a sobre-expressão da FAK oncogene é associada a carcinogênese de várias células cancerosas humanas [21,22]. A ACI
2 + ativa calpaína, que degrada a FAK e aumenta a mobilidade das células [3,4,5,9] cancerosas. Tendo observado que cala aumenta iCa
2 + níveis em linhas celulares de cancro do cólon, nós investigamos o efeito de Cala na estabilidade FAK nessas células. Foi examinada a expressão de FAK e pFAK no cólon normal (CCD-18Co) e linhas celulares de cancro do cólon (Fig. 3a). Os resultados mostraram que as células CCD-18Co tem expressão nominal da FAK e assim níveis mais baixos de pFAK em comparação com linhas celulares do cancro do cólon que expressam níveis elevados de FAK e pFAK. Cada linha de células de cancro do cólon mostrou diferentes níveis de FAK e pFAK expressão. células CCD-18Co apresentou um nível normal de pFAK. células HT-29 e DLD-1 apresentaram maiores níveis de pFAK em comparação com HCT116. Portanto, nós nos concentramos em HCT116 e células HT-29 linhas para outros estudos relacionados à estabilidade da proteína FAK. Além disso, foi realizada uma análise dependente da dose para os efeitos da cala sobre HCT116 e HT-29 células (Fig. 3b). As células foram tratadas com diferentes concentrações de cala durante 12 h e a clivagem da FAK foi avaliada. O comprimento total da FAK e pFAK é um 125 kDa. Cala clivado FAK num N-FAK (FERM domínio) de 90 kDa com concentrações crescentes possuindo a actividade mais elevada a 2,5 mM. Da mesma forma, pFAK foi clivado no seu P-N-FAK de um modo dependente da dose com actividade óptima a 2,5 mM de cala (Fig. 3B). Estes resultados indicam que desestabiliza cala FAK e pFAK e provoca a clivagem de ambas as proteínas em células cancerígenas do cólon.
(A) expressões FAK foram analisados na linha celular epitelial de cólon normais CCD-18Co e diferentes linhas de células de cancro do cólon ( HCT116, HT-29 e DLD1). HCT116 e HT-29 (B) foram tratadas com diferentes concentrações de cala durante 12 h. Western blot realizada a partir de lisados celulares mostraram que cala induzida FAK e pFAK clivagem de uma forma dependente da dose.
FAK desestabilização através da atividade CAPLAIN por Cala
Estudos recentes indicam que FAK e sua forma fosforilada são importantes para o volume de negócios de adesão focal. FAK é clivada pela calpaína, Ca
2+ dependente de protease, que desempenha um papel crítico na dinâmica de adesão focal em células móveis [4]. Calpain está envolvido em vários aspectos-chave da adesão das células do câncer, migração e metástase [23]. Desde cala aumentou Ca
2 + fluxo e clivada FAK, então nós determinamos os efeitos da cala sobre calpaína em HCT116 e células HT-29 (Fig. 4). Os resultados mostram que cala causou clivagem dependente do tempo de proteínas FAK e pFAK mas não houve qualquer efeito sobre os níveis de calpaina-2 em ambas as linhas celulares. Para confirmar os resultados, utilizou-se calpeptina, um activador de Rho-cinase e um inibidor da calpaína que faz parte de uma família de cisteína proteases dependentes de cálcio. Calpeptina (20 M) reverteu os efeitos da cala sobre FAK e clivagem pFAK em ambas as linhas de células, sem efeitos sobre os níveis de proteína calpaína-2 (Fig. 4). Estes dados sugerem que cala aumentou
2 + influxo e atividade calpaína, mas não os seus níveis de proteína Ca. Sabe-se que FAK clivado medeia a degradação de p53 através da translocação nuclear de N-FAK. As células tratadas com Cala mostrou diminuição dos níveis de p53, que foi revertida por calpeptina. Calpeptina inibida calpaína-2, impedindo-o de clivar FAK, atenuando a degradação de p53. Estes resultados estabeleceram que a clivagem induzida por FAK cala aumentada de p53 degradação e calpaína-2 actividade mas sem efeitos sobre os níveis de proteína de calpaina.
HCT116 e células HT-29 foram tratados com 2,5 mM de cala em combinação com o inibidor da calpaína ( calpetin 20 uM) no modo dependente do tempo indicado. dados de Western blot demonstram que inibidor da calpaína, calpeptina, reduziu a clivagem da FAK e pFAK bem como a degradação de p53.
Clivadas FAK transloca para o núcleo
Estudos mostraram que a translocação nuclear de FAK promovido sobrevivência celular através da degradação de p53 reforçada sob condições de estresse celular [24,25]. Cala induziu clivagem da FAK para uma proteína de 90 kDa, que foi translocada para o núcleo. FIG. 5 representa a análise western blot de todo, citoplasmática e frações nucleares de células tratadas com cala, e sua imunocitoquímica. O lisado de células inteiras e a fracção citoplasmática de ambas as linhas de células tratadas com cala mostrou FAK FAK e clivada. fracções nucleares de células não tratadas tinham níveis baixos de FAK mas o tratamento com cala aumentada de FAK e clivado níveis de FAK em fracções nucleares (Fig. 5a). As translocações nucleares de N-FAK em HCT116 e HT-29 (Fig. 5 B e C) foram visualizadas após incubação com o anticorpo primário anti-FAK seguido por coloração com anticorpo secundário conjugado com Alexa-488. A microscopia confocal de células de controlo apresentaram DAPI núcleos corados sem FAK Alexa-488-manchada. No entanto, a imagem latente confocal de células tratadas com Cala mostraram translocação de Alexa-488 manchado N-FAK em núcleos DAPI manchadas. Estes resultados indicam claramente que cala 2,5 mM clivado FAK comprimento completo que translocado para dentro do núcleo.
Translocação de N-FAK foi analisada por Western blot (A) e imunocitoquímica (B-C). As células HCT-116 e HT-29 foram semente numa câmara de 8 poços e tratadas com cala 2,5 mM durante 12 h. A translocação foi analisada por microscopia confocal. WE, extracção de células inteiras; CE, extracção citoplasmática; NE, extracção nuclear; translocado N-FAK é indicado por uma seta. Barra de escala:. 2,5 uM
cala aumento da motilidade das células de cancro do cólon
Desde FAK é conhecida por desempenhar um papel crucial na adesão, migração, proliferação e diferenciação em células cancerosas [ ,,,0],1,2], estudamos os efeitos da cala sobre estas propriedades celulares em células cancerígenas do cólon. Foi realizada a cura de feridas ensaio em células HCT116 tratados com cala sozinho ou em combinação com calpeptina (Fig. 6). Os resultados demonstram que a cala (2,5 mM) aumentou a mobilidade das células HCT116. Calpeptina sozinho não parece alterar a motilidade. Interessantemente, foi mostrado que a aplicação da calpeptina (20 uM) em combinação com cala reduziu o efeito de cala e inibiu a migração de células (Fig. 6 A-B). Além disso, observou-se que TAE226 (inibidor de FAK) diminuiu significativamente a motilidade celular. Estes resultados sugerem que Ca
2 + influxo medeia a degradação FAK através da atividade calpaína. TAE226 mostrou efeitos anti-tumorais em células cancerígenas do cólon. É reduzido o tamanho dos tumores disseminados e a sobrevivência prolongada em ratinhos portadores de tumores [26]. A fim de confirmar as nossas observações, foi realizada uma análise comparativa dos níveis de FAK e pFAK em HCT116 e HT-29, utilizando TAE226 (Fig. 6C). TAE226 (2,5 uM) inibiu a expressão pFAK de uma forma dependente do tempo não inibiu total de FAK. Cala-induzida FAK e clivagem pFAK aumento da motilidade em comparação com TAE226, que suprimiu a atividade pFAK e diminuição da motilidade da célula cancerosa.
ensaio de cicatrização de feridas foi realizada em células HCT116. As células foram tratadas com cala, e cicatrização de feridas propriedade foi analisado de 0 a 6 h após a ferida (A), e os valores médios da área da ferida foram analisados utilizando gráfico de linha múltipla (B). As células HCT-116 e HT-29 foram tratados com 2,5 mM de cala, no modo dependente do tempo induzida FAK e clivagem pFAK (C). pFAK inibidor (TAE226 2,5 M) reduziu os níveis pFAK como detectado por western blot.
clivada pela FAK mediada degradação p53 através de ubiquitinação dependente de MDM2
Estudos anteriores indicaram que a estrutura de FERM -FAK pode translocar para o núcleo e modulam a estabilidade da proteína p53 através de MDM2 [25]. Por isso, investigamos o mecanismo de p53 baixo regulamentação por cala. Cala sozinho induzida clivagem da FAK e pFAK. Tratamento de MG132 com Cala paradoxalmente recuperou a FAK e pFAK clivagem (Fig. 7). O tratamento de células com p53 inibiu cala níveis, enquanto MG132 recuperou os níveis de p53. Tratamento de MG132 em combinação com Cala recuperou o efeito de Cala na degradação p53 proteossomal. Além disso, observou-se que MDM2 e os níveis de proteína PMDM2 não foram alteradas pelos tratamentos com Cala, MG132 ou ambos. Assim, estes resultados sugerem que a p53 a partir de MG132 recuperado cala através de ubiquitinação associada-MDM2.
HCT116 e células HT-29 foram tratados com 2,5 mM de cala em combinação com um inibidor de proteossoma (MG132 10 uM) durante 10 h. Western blot foi realizada a partir de lisados celulares e proteínas foram detectadas como descrito nos métodos.
Discussão
Este estudo demonstra que induzida por lactato de cálcio Ca
2 + fluxo aumenta a motilidade de cancro do cólon células através de desestabilização das proteínas FAK e pFAK. Este estudo demonstra o efeito de Ica
2+ sobre a via de motilidade em células-FAK calpaína. clivagem Cala-mediada da FAK e pFAK foi arbitrada por meio da atividade calpaína, o que aumentou a mobilidade das células de cancro do cólon. A FAK clivado translocado para dentro do núcleo e degradação aumentada do p53, bem como a actividade de calpaína. O efeito do lactato extracelular foi relatada em vários estudos sobre a motilidade das células cancerosas. Uma diferença importante entre o presente estudo e estudos anteriores sobre lactato é a entidade química.
monocarboxilato transportadores (MCTs) normalmente medeiam influxo de lactato e de efluxo e que os níveis elevados de MCT1 foram detectados em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de cólon [16]. libertação de lactato em células hipóxicas é mediada através MCT4, enquanto que o transporte de lactato nas células de tumor oxigenadas é mediada através MCT1 [15,16]. Parece que se cala está a ser transportado para o citoplasma, aumentando, assim, CaI
2+ e as concentrações de lactato são coincidentemente observada. No entanto, o mecanismo de transporte específico não é identificado. Os resultados deste estudo mostraram que a baixa concentração de Cala mediada a motilidade dependente da FAK nas células do câncer de cólon. Estudos anteriores indicaram que o lactato de sódio foi utilizado em concentrações tão elevadas como 20 mM [10]. Esta gama alta foi observada em tumores malignos metastáticos e de grandes dimensões. As concentrações elevadas de lactato em tumores foram correlacionados com uma elevada incidência de metástases à distância e outros comportamentos malignos de células cancerosas [27]. Portanto, utilizou-se concentrações baixas de lactato para evitar a metástase do cancro. Por tratamento de células com concentrações baixas de cala, Ca
2+ influxo aumentado e mantido por um período de tempo prolongado, o que aumentou a actividade de calpaína. A calpaína protease tiol intracelular catalisa a proteólise limitada de várias proteínas estruturais de adesão focal e enzimas de sinalização em células aderentes. Calpains estão envolvidos em vários aspectos fundamentais da migração, incluindo a adesão e espalhamento. A inibição farmacológica da calpa�as reduzida a migração celular mediada por integrina [23]. Estudos recentes fornecer um apoio adicional para a calpaína como um importante modulador da motilidade celular através de sua capacidade de regular a dinâmica de adesão focal. mediada por Calpain degradação FAK é fundamental para a motilidade em células cancerígenas do cólon humano [3]. Elevados níveis de expressão de FAK têm sido associados com o aumento da capacidade de invasão de tumores malignos. No entanto, os mecanismos de activação FAK, clivagem, e a desregulação de motilidade, não são claros. Eventos de sinalização a jusante de activação e clivagem da FAK pode contribuir para a motilidade das células de carcinoma do cólon humano.
cala pode modular o potencial de migração de células de tumor oxigenadas, que existem em torno dos vasos tumorais. No tecido tumoral, a vascularização foi limitado a fornecer oxigénio e nutrientes tais como glucose e glutamina. tumores hipóxicos parecem estar pouco diferenciado, mas hipóxia desempenha um papel direto na manutenção de células-tronco do câncer [29]. tumores hipóxicos tendem a produzir um gradiente de lactato, que é utilizado pelas células tumorais oxigenada através do transporte mediado MCT1, de modo que as células tumorais hipóxicas pode utilizar a glicose. Este fenômeno é conhecido como o serviço de transporte de lactato intercelular. Por conseguinte, pode-se assumir que, no ambiente extracelular que rodeia as células hipóxicas acumula gradualmente lactato na sua forma livre. No entanto, as células oxigenadas foram fornecidos pelo cálcio através do fornecimento de sangue, lactato foi importado por meio de MCT1, baixando a concentração de lactato extracelular e o seu microambiente contém menos de lactato e principalmente ligado ao cálcio [31]. Os nossos resultados sugerem que as células oxigenadas são menos móveis em comparação com as células hipóxicas e metástases que envolve as células hipóxicas em vez de células oxigenadas. A existência ea quantidade de Cala em um microambiente do tumor extracelular pode ser um fator determinante para a metástase através da modulação da FAK. Além disso, pode eventualmente controlar cala motilidade celular e no metabolismo de energia. A proteína p53 supressor tumoral impede a progressão do câncer através de inúmeros mecanismos, incluindo a apoptose e ciclo celular. Existe uma ligação bem caracterizada entre o metabolismo e regulação genética de p53, p53, onde regula o equilíbrio de energia da célula entre a glicólise e fosforilação oxidativa [30,31]. Da mesma forma, nossos resultados mostram que cala pode causar degradação proteossomal de p53 (Fig. 4) através da translocação nuclear de FERM-FAK e ubiquitination mediada pelo mdm2 (Fig. 7).
O presente estudo investigou o impacto da suplementação Ca
2 + sobre os mecanismos moleculares do câncer de cólon metastático. A importância de Cala na modulação da fisiologia celular do cancro do cólon não está limitado a estudos básicos, mas também tem um impacto sobre o resultado nutricional clínica. Ca
2 + desempenha vários papéis na progressão do cancro, incluindo o aumento da apoptose ou inibição da proliferação no cólon. Além disso, Ca
2 + ligação aos sais biliares, aumentou em dietas ricas em gordura, têm sido associadas com a carcinogênese do cólon [28]. Cala-induzida clivagem FAK e motilidade celular aumentada de células HCT116 cria uma suposição de que pacientes com câncer de cólon metastático precisam de mais cuidado ao considerar Ca
2 + suplementação dietética. Porque o cálcio extracelular pode ser ionizado com lactato, que conduz a Ca
2 + influxo causando aumento de clivagem FAK e motilidade de células cancerígenas.
Conclusões
O presente estudo elucida que cala aumento da motilidade de células cancerígenas do cólon por atividade calpaína através desestabilizações de proteínas FAK e pFAK. A entidade concentração e química de Cala pode ser fator contribuinte para a motilidade celular do cancro do cólon. Por conseguinte, os nossos resultados sugerem que os efeitos da motilidade sobre o cancro do cólon podem ser relacionados com a utilização de Ca
2+ suplementação dietética. Mesmo uma baixa concentração de Ca
2 + pode causar aumento da motilidade celular.