Abstract

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer e a busca de biomarcadores de prognóstico que possam melhorar as decisões de tratamento é justificada. MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de ARN não-codificantes curtos envolvidos na regulação da expressão de genes e têm sido propostos como possíveis biomarcadores na CRC. A fim de caracterizar o transcriptoma miRNA, uma grande coorte, incluindo 88 tumores CRC com longo prazo de seguimento foi deep sequenciado. 523 miRNAs maduros foram expressos em nossa coorte, e eles exibiram padrões de expressão em grande parte uniformes entre amostras tumorais. Poucos foram encontradas associações entre parâmetros clínicos e expressão miRNA, entre eles, a baixa expressão de miR-592 e alta expressão de miR-10b-5p e miR-615-3p foram associados com tumores localizados no cólon direito em relação ao cólon esquerdo e reto. Alta expressão de miR-615-3p também foi associada com tumores pouco diferenciados. Nenhum candidato biomarcador de prognóstico para a sobrevida global e livre de metástases foram identificadas através da aplicação do método LASSO em um modelo de riscos proporcionais de Cox ou univariada de Cox. Exame dos cinco miRNAs mais abundantemente expressas na coorte (miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p e miR-192-5p) revelou que a sua expressão coletiva representaram 54% das sequências de miARN detectados. análise via dos genes alvo regulados pelos cinco miARNs mais altamente expressos descoberto um número significativo de genes envolvidos na via de CRC, incluindo APC, TGFp e PI3K, sugerindo assim que estas miARNs são relevantes no CRC.

Citation : Schee K, Lorenz S, Worren MM, Günther CC, Holden M, Hovig E, et al. (2013) funda Seqüenciamento do transcriptoma MicroRNA no câncer colorretal. PLoS ONE 8 (6): e66165. doi: 10.1371 /journal.pone.0066165

editor: Georgina L. Segure, University of Aberdeen, Reino Unido

Recebido: 17 de fevereiro de 2013; Aceito: 02 de maio de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Schee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Sudeste da Noruega Autoridade Regional de Saúde e da Sociedade do Câncer da Noruega. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs (miARN) são evolutivas conservadas pequenas (~20-22 nt de comprimento), RNAs não codificantes que regulam a expressão do gene através da ligação à 3’UTR do ARNm, inibindo deste modo a tradução [1]. Eles podem ligar com complementaridade parcial com mRNA potencialmente regular negativamente vários mRNAs. Isso faz com que os estudos jusante pouco desafiadoras com múltiplos alvos potenciais para cada miRNA. Hoje em dia existem cerca de 1500 miARNs anotadas na base de dados de miARN (miRBase) [2], e estima-se que até 60% dos genes codificadores de proteínas pode ser regulada por miARNs [3]. MiRNAs são essenciais para o desenvolvimento normal dos mamíferos e estão envolvidos em fine-tuning muitos processos biológicos, tais como a proliferação celular, diferenciação, apoptose e metabolismo, e seu envolvimento no câncer tem suscitado interesse crescente em miRNA biologia [4] – [6]. Eles têm sido propostos como possíveis biomarcadores devido às suas funções de regulação, estabilidade química e a possibilidade de medir miRNA em soro, plasma, fezes e amostras de tecidos [7] – [10].

O câncer colorretal (CRC) é uma das formas mais comuns de câncer nos países ocidentais e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer. É uma doença heterogênea caracterizada pelo acúmulo de eventos genéticos e epigenéticos, e influenciado pelo estilo de vida [11], [12]. As decisões de tratamento ainda são, essencialmente, com base na extensão anatômica da doença no momento do diagnóstico, ea busca por melhores biomarcadores se justifica. MiRNAs foram examinadas quanto à sua potencial papel como biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e terapêutico em CRC utilizando tecnologias de hibridação de matriz base e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) [13] – [16]. Utilizando microarrays de expressão, expressão de uma grande quantidade de miARNs pré-seleccionado pode ser detectada, e a detecção baseia-se na miARN intensidades de sinal. A expressão relativa pode ser calculada utilizando qRT-PCR, mas quando se expande para análises múltiplas em paralelo, o número de miARNs possível analisar e a quantidade de ARN pode representar limitações. seqüenciamento profunda emergiu como uma abordagem atraente para análise global miRNA, vantagens, incluindo agregação de amostras para fins de alto rendimento, uma gama ampla de expressão detectável, a capacidade de analisar a expressão de todos os miRNAs anotados ea possibilidade de detectar novos miRNAs.

neste trabalho, a sequenciação de profundidade foi utilizado para determinar a expressão miRNA em 88 amostras de tumores de CRC, e associações entre os níveis de expressão e os dados clínico-patológicos e os resultados foram analisados.

Materiais e Métodos

paciente coorte e Preparação de Amostras

Entre os anos de 1998-2000, 316 pacientes foram recrutados em cinco hospitais na região de Oslo [17], e prospectivamente incluídos no estudo, no momento da cirurgia primária para assumida ou verificado cancro colorectal . O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Regional (Saúde Região II, Noruega) e foi obtido consentimento informado dos pacientes. espécimes ressecados foram processados ​​rotineiramente para avaliação histopatológica no momento da cirurgia e classificados de acordo com o sistema de estadiamento do tumor metástase (TNM). Colheita de amostras de tecido tumoral adicional foi realizada pelo cirurgião na sala de operação, após o espécime foi removido a partir do paciente, e as amostras foram imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido. As amostras foram, em seguida, transportados para o laboratório de pesquisa e mantida durante o armazenamento a longo prazo a -80 ° C. As biópsias foram seccionados utilizando um micrótomo criostato e hematoxilina-eosina lâminas coradas foram avaliadas quanto a conteúdo do tumor por um patologista (teor mediano do tumor nas amostras foi de 50%, intervalo de 30-80%). O tecido tumoral foi então cortado em secções de 10 um utilizando um micrótomo criostato e armazenado a -80 ° C até o isolamento de ARN. 120 casos não foram incluídos no estudo devido às seguintes razões: não cancro invasivo (25), histologia diferente de adenocarcinoma (5), metástase distante no momento da cirurgia (34), radioquimioterapia pré-operatória (2), as margens cirúrgicas inadequadas (7 ) e desconhecido estágio da doença (1). Além disso, as amostras congeladas de tecido não foram obtidos em 46 casos. Dos 196 amostras em fase TNM I-III, 90 amostras de tumor foram selecionados aleatoriamente para a sequenciação de profundidade. Após sequenciação, a partir de duas amostras da coorte foram considerados degradada e foram removidos a partir de outros estudos, deixando uma coorte de amostra de 88 pacientes (Tabela 1). dados de seguimento foram obtidas junto aos hospitais participantes e dos médicos de clínica geral (para os pacientes que não frequentam a controles regulares). Metástase foi verificada por meio de dados de exames radiológicos e de sobrevivência foi obtida a partir do Registro Nacional de Noruega e atualizados até 1 de Outubro de 2008.

Isolamento RNA e Deep Sequencing

RNA foi isolado do tecido tumoral usando TriReagent (Ambion Inc., TX), de acordo com o protocolo do fabricante e a concentração de ARN total foi medida por Nanodrop (ND-1000). A qualidade foi avaliada pela Agilent Bioanalyzer 2100 e amostras com um valor de 7 e RIN acima foram utilizados para análise posterior. bibliotecas RNA seqüenciamento pequenos foram criados seguindo o protocolo de Preparação de Amostras Illumina®TruSeq ™ RNA pequeno. Em, 3` e 5` adaptador de ARN breve, especificamente modificado para atingir as extremidades de pequenas moléculas de RNA, foram ligados a 1 ug de ARN total de elevada qualidade. A transcrição reversa foi realizada para gerar bibliotecas de ADNc e o PCR foi utilizada para amplificar e adicionar sequências índice exclusivo para cada biblioteca.

bibliotecas de ARN pequenas foram reunidas e 32 bases foram sequenciados para cada molécula de ADNc, utilizando um Analisador de Illumina® Genoma IIx . Índices foram sequenciados para identificar a fonte de cada leitura. A primeira corrida, contendo 48 amostras, foi prejudicado por pistas parcialmente não-funcionais na célula de fluxo e, portanto, foi repetido. Os dados para a corrida 1 e executar 2 foram combinados para análise de expressão a jusante, bem como analisado separadamente para determinar a reprodutibilidade técnica das experiências.

Sequencing Análise de Dados e Normalização

Análise em tempo real , chamada base e filtragem de baixa qualidade leituras foram feitas por pacotes de software da Illumina (SCS2.9 /RTA1.9 e Off-line Basecaller v1.9). Novoalign (V2.08.01 Novocraft 2010; www.novocraft.com) foi usado para cortar sequência do adaptador restante e mapear as leituras para o genoma humano de referência (hg19). Todas as leituras de mapeamento para 10 ou mais regiões genómicas foram excluídos de análises posteriores. O mapeados leituras foram anotados usando bancos de dados conhecidos. A base de dados de libertação miRBase 18 (Novembro de 2011) foi usada para identificar miARNs, utilizando-BEDTools Versão 2.16.2 [18]. O NCBI construir “Homo_sapiens.NCBI.36.58” foi usado para identificar outras espécies de RNA pequeno e mRNA.

Para calcular a contagem de ler para miRNAs, lê-se que mapeou exclusivamente dentro de uma sequência miRNA maduro, com um máximo de um desfasamento foram sucessos considerados. Lê mapeamento para mais do que uma sequência de miRNA maduro foram atribuídos de acordo com a frequência das mapeados exclusivamente lê encontrada para estes miRNAs. Isto significa que quando dois miARNs partilhada um determinado número de múltiplos mapeado lê, identificou-se a proporção de única lê entre estes dois miARNs. Esta proporção foi aplicada para dividir o número de múltiplos mapeado lê e atribui-los. Se vários foram encontrados para ser perfeitamente mapeados para uma região genômica e mapeada com incompatibilidade para outro, foram considerados apenas os jogos perfeitos.

Para normalização das contagens de leitura, quatro abordagens diferentes foram testadas. Calculou-se o factor de normalização para todas as amostras dividindo-se o número total de leituras, o número de leituras alinhados ao genoma, permitindo que vários hits ou que o mapa de forma única, ou o número de leituras mapeado para miRNAs maduros anotados com 1 milhão. Os valores de expressão normalizados para cada um miARN foram gerados através da divisão da contagem de ler a miARN com o factor de normalização de acordo com. Após a normalização, todos os miRNAs com leitura contagens inferiores a 10 em todas as amostras do paciente foram definidos como 0. O conjunto de dados normalizado contra miRNAs maduros anotados foi escolhido para as demais análises. contagens de leitura normalizados e não-normalizados para todas as amostras foram disponibilizados no site da matriz Express, número de acesso E-MTAB-1649 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/).

quantitativa em Tempo real PCR

qRT-PCR foi previamente realizada para toda a coorte de 196 amostras a partir do qual o tecido fresco congelado foi disponíveis para determinar a expressão de seis miRNAs: miR-21, miR-31, miR-92a , o miR-101, miR-106a e miR-145 [19]. Em resumo, a síntese de ADNc e de qRT-PCR foram realizadas utilizando ensaios TaqMan microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as amostras foram analisadas em duplicatas. Os valores Ct foram normalizados para miARNs contra RNU44 e a expressão relativa foi calculada usando 2

-dCt método de [20]. Os resultados para estes seis miARNs a partir das 88 amostras que foram analisados ​​com os dois métodos foram usadas para comparação dos dados de sequenciação de profundidade com qRT-PCR. As associações entre os resultados do sequenciamento profundo e qRT-PCR foram estudados por análise de regressão linear.

agrupamento hierárquico e Análise Estatística

agrupamento hierárquico foi realizada para visualizar padrões de todos os miRNAs de expressão. Os valores de expressão normalizados foram LOG2 transformada e não supervisionada de duas vias de agrupamento hierárquico foi realizada utilizando distância euclidiana e ligação média ponderada (WPGMA) para agrupar miRNAs e amostras simultaneamente.

Dois classe de análise de significância não pareado com testes de múltipla (10000 permutações ) (SAM) [21] foi usado para identificar miARNs associados com os parâmetros clínico, utilizando J-Express (2012 versão) [22]. A entrada para o SAM foi normalizada e log2 transformado e os parâmetros clínico foram utilizados como variáveis ​​de resposta. Dez mil permutações repetição dos dados foram utilizados para determinar se a expressão de miARNs foi significativamente associado com um dos seguintes parâmetros clínico: TNM, Pt, PN, a localização do tumor, a diferenciação, a infiltração perinodal, invasão vascular e infiltração neural. A taxa de descoberta de falsas expressa como Q-valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

global e sobrevida livre de metástases foi calculado a partir da data da cirurgia até a data da morte ou diagnóstico de metástase. Para identificar miRNAs associados à sobrevida univariada Cox riscos proporcionais regressão total e livre de metástases foi aplicado a cada miRNA, testando para associações com sobrevida livre de metástases ou geral. Para ter em conta vários testes, os valores de p foram calculados ajustados por controlo da taxa de detecção falsa (FDR), usando o procedimento Benjamini-Hochberg [23]. Então, para todos os miRNAs simultaneamente, o método LASSO no modelo de riscos proporcionais de Cox [24], tal como aplicadas anteriormente [25], foi usado para descobrir um conjunto de miRNAs associados com os endpoints. “Na análise LASSO foram selecionados não miRNAs. Não miRNAs foram significativas na análise Cox univariada após correção para testes múltiplos. Nesta última análise, sete miRNAs (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365B-3P, miR-454-3p, miR-194-3p, miR-15b-3P e hsa-miR- 4461) teve valor de p inferior a 0,01 com o desenvolvimento de metástase como ponto final, enquanto três miRNAs (miR-101-5p, hsa-miR-873-5p e hsa-miR-3144-3p) apresentaram valor de p inferior a 0,01, com sobrevida global endpoint . Todos estes dez miRNAs foram expressos em níveis muito baixos em nossa coorte com a mais alta expressão média observada para miR-454-3p com 187 leituras para o menor para miR-873-3p com 0 lê.

Caminho Análise para genes alvo dos Cinco miRNAs mais altamente expresso

Para investigar a influência biológica dos miRNAs mais altamente expressos, genes alvo foram identificados utilizando [26] TarBase 6.0. Esta base de dados contém genes alvo que têm um suporte experimental para além da predição baseada na sequência. As identidades dos genes foram enviados para a ferramenta web-based DAVID funcional anotação para análise de caminho usando o banco de dados KEGG [27], [28].

Resultados

RNA Sequenciação e anotação

o comprimento das sequências detectadas variou entre 13 e 29 nucleótidos após a remoção da sequência do adaptador (mais leituras foram removidos). A porção principal lê, 97,9%, foi entre 19 e 23 bases. Em média, 2.600.000 lê mapeamento para o genoma humano foram obtidos por amostra de tumor (Figura 1A). Identificamos as frequências de leituras cair em diferentes classes de pequeno RNA ou de outras regiões genômicas e calculadas as frequências médias comparando todas as amostras tumorais 88. A frequência de leituras de mapeamento para amadurecer miARNs variou de 37 para 77% nas bibliotecas e deu uma média de 61% (Figura 1B). Para as regiões intrônicas /intergênicas uma mediana ler frequência de 33% foi encontrado, e por miRNAs prematuros e snoRNAs, a mediana ler freqüências foram 4% e 2%, respectivamente (Figura 1C). Além disso, uma pequena fração de leituras mapeado para snRNA, miscRNA, tRNA, rRNA, e mRNA, em conjunto compreendendo uma frequência de ~0.05%. MiRNAs com menos de 10 lê através de todas as amostras dos pacientes foram considerados não expressa. No total, 523 miRNAs foram expressas no conjunto de dados.

A. Número de leituras (x10

6) mapeado para o genoma humano (hg19) para todas as amostras. Estes incluem todas as espécies de RNA (miRNA prematuro, snoRNA, snRNA, miscRNA, rRNA, tRNA e mRNA) .As sequências que não correspondem sequência conhecida foram comparados com bases de dados de regiões intergênicas e intrônicas do genoma humano. B. A frequência das leituras mapeado para miRNAs maduros anotados para todas as amostras utilizando o banco de dados microRNA (miRBase liberar 18). C. Pie-chart representando percentagens das diferentes classes de RNA encontrados no conjunto de dados.

Normalização e Técnico Replica

Em geral, para comparar os valores de expressão entre as amostras é necessário normalizar contra a contagem lido pelo cálculo de um factor de normalização. Os quatro métodos de normalização diferentes deram origem a resultados muito semelhantes quando se compara a alteração média calculada pela diferença em percentagem para cada miARN ler contagem por miARN (dados não mostrados). Figuras 2B e 2C mostram a distribuição de log2 transformado unnormalized ler as contagens e ler as contagens normalizadas contra miRNAs maduros para cinco amostras de pacientes aleatórios. As contagens de leitura mais baixa não foram afectadas por normalização em comparação com os valores mais elevados. Ao todo, gerados normalização relativamente distribuída igualmente ler as contagens para a maioria dos miARNs em todas as amostras.

. A comparação das repetições técnicas entre run 1 e correr 2. Cada ponto representa a expressão total de um único miRNA de todas as amostras de doentes. Os dados de expressão de miARN foi normalizada e log2 transformado. B. unnormalized miRNA ler as contagens (log2) para cinco pacientes selecionados aleatoriamente. C. Normalizada miRNA ler as contagens (log2) para os mesmos cinco pacientes como em B.

48 amostras foram sequenciados profunda duas vezes, denotado prazo 1 e correr 2, e estes conjuntos de dados foram usados ​​para comparar o os resultados de ensaios separados. Os resultados demonstraram uma boa correlação entre as repetições técnicas mostradas pela linha de inclinação zero (Figura 2A).

Os Cinco miRNAs mais altamente expresso

Os cinco miRNAs mais abundantemente expressas nesta coorte foram miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p e miR-192-5p (Figura 3). As contagens de leitura para estes miARNs representavam 53,7% do número total de sequências de miARN detectados nas amostras de doentes, enquanto a parte superior 20 miARNs representavam 82,6% das leituras (Tabela S1). Os restantes 503 miARNs representado 17,4% das leituras. Dos cinco primeiros miRNA, miR-192-5p teve a mais alta expressão mediana (156.413 leituras), enquanto miR-22-3p teve a menor (35.284 leituras).

A expressão diferencial dos cinco miRNAs mais abundantemente expressos em nossa coorte CRC. O número total de miRNA leituras são log2 transformado. Os círculos representam outliers e as estrelas representam valores atípicos extremos.

Muitos miRNA genes estão localizados em estreita proximidade com outros genes de miRNA em agrupamentos de genes, e dois dos cinco principais miRNAs mais altamente expresso (miR-143 -3p e miR-192-5p) fazem parte destes agrupamentos. MiR-143-3p e miR-145-5p estão ambos localizados no cromossoma 5 10kb separados, enquanto que o miR-192-5p e miR-194-5p estão localizados no cromossoma 11 10kb separados. Os níveis de expressão de miR-143-3p e miR-192-5p e dois miARNs pertencentes aos respectivos agrupamentos de genes estão descritos na figura 4. Sem o co-expressão era aparente para os miARNs pertencentes a estes grupos de genes, o que está de acordo com o anterior resultados [29].

A. MiR-143-3p é encontrada no mesmo aglomerado de genes como o miR-145-5p no cromossoma 5 (posiciona 148808481-148808586 e 148810209-148810296, respectivamente). MiR-192-5p é encontrada no mesmo aglomerado de genes como o miR-194-5p no cromossoma 11 (posiciona 64.658.609-64.658.718 e 64658827-64.658.911, respectivamente). Embora os miRNAs em cada cluster gene é 10kb à parte, co-expressão não foi observada

Análise Caminho para os cinco miRNAs mais altamente expresso

1490 genes alvo foram identificados como. potencialmente regulados pelo miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p e miR-192-5p. As vias com o mais significativo do gene de enriquecimento são mostrados na Tabela 2, e incluiu “Acesso no cancro” (55 genes, p = 3,3 x 10

-7), “ciclo celular” (28 genes; p = 2,2 × 10

-6), e “O câncer colorretal” (21 genes, P = 1,0 × 10

-5). Concentrando-se na via de CRC, descobrimos que genes regulados pelos cinco miRNAs mais altamente expressos incluídos oncogenes (

KRAS, PI3K

), supressores de tumor (APC e TGFβRII), e genes de reparo do DNA (hMSH6) e genes pertencentes para as vias de Wnt e MAPK de sinalização (figura 5).

resultados da análise de via para os genes alvo dos cinco miARNs mais altamente expressos na via de cancro colo-rectal. A ilustração foi feita a partir do banco de dados KEGG e os miRNAs foram adicionados na pia batismal azul para indicar os alvos regulados por estes miRNAs.

Correlação entre qRT-PCR e Deep Sequencing dados

valores de expressão para seis miARN miR-21, o miR-31, o miR-92a, o miR-101, miR-106a e miR-145, foram previamente determinada utilizando qRT-PCR [19]. A expressão de miARN medido por qRT-PCR foi comparado com os dados de sequenciação profundas usando análise de regressão linear dos valores Ct normalizados (qRT-PCR) e os dados de sequenciação profunda transformado-log2. Os

2 valores de R para os 6 miRNAs testados foram 0,06, 0,38, 0,10, 0,001, 0,03, e 0,28 para o miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a, e miR-145 , respectivamente. A soma dos níveis de expressão total foi também calculada para estes miARNs para cada método, e os níveis relativos são mostrados na Figura 6. A expressão relativa entre miARNs individuais era razoavelmente consistente entre os métodos para quatro dos miARNs (MIR-21, miR-31 , miR-92a e miR-106a), ao passo que havia discrepâncias claras para miR-101 e miR-145. MiR-101 era dificilmente detectáveis ​​com qRT-PCR, mas exibiram valores de expressão detectáveis ​​com sequenciamento de profundidade, enquanto que miR-145 foi detectada por qRT-PCR e dificilmente detectado utilizando profunda sequenciamento.

Os valores de expressão normalizados foram LOG2 transformado e analisados ​​por duas vias de agrupamento hierárquico não supervisionado utilizando ligação média ponderada (WPGMA). O mapa global contém todos os miRNAs expressos mostradas na vertical e as amostras dos pacientes horizontalmente.

agrupamento hierárquico e associações entre miRNA Expressão e correlação clínica Parâmetros

Os padrões de expressão de miRNA observados com agrupamento hierárquico são mostrados na Figura 7 com miARNs no eixo vertical e amostras de doentes no eixo horizontal. A maioria dos miARNs exibiram níveis de expressão muito semelhantes em amostras de doentes. Em áreas da trama, alguns miRNAs parecia estar diferencialmente expressos, mas estes foram quase exclusivamente localizado entre o miRNA que tinha muito baixa expressão. Análise SAM de dados de expressão e os parâmetros clínico revelou que a alta expressão de miR-10b-5p e miR-615-3p e baixa expressão de miR-592 foram associados com tumores localizados no cólon direito (incluindo o ascendente e cólon transverso) em comparação com do cólon e do recto esquerdo (Tabela 3). A expressão destes miARNs mostrou 2,4 vezes, 41,4 vezes e as diferenças de 3,9 vezes, respectivamente, (Q 0,05 para todas as miARNs) (Figura 8). Alta expressão de miR-615-3p também foi associada com tumores pouco diferenciados em comparação com tumores intermediária e bem diferenciadas (dobre mudanças 44,4, q 0,05).

A expressão de seis miRNAs (miR-21, miR- 31, miR-92a, miR-101, miR-106a e miR-145) é mostrado de sequenciamento profundo e qRT-PCR para 88 amostras de pacientes que foram analisadas com ambos os métodos. A. As barras representam a soma do número total de leituras (x10

6) para cada miARN de sequenciação profunda. B. As barras representam a soma da expressão relativa (2

-dCt) a partir de qRT-PCR.

High expressão de miR-10b-5p e miR-615-3p e baixa expressão de miR-592 foram associados com tumor localizado no cólon direito em relação ao cólon esquerdo e reto (q 0,001 e p 0,001).

Associações entre miRNA Expressão e Resultado

no LASSO e análise de Cox univariada, 5 miRNAs (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365B-3p, miR-454-3p, miR-194-3p e miR- 15b-3p) com o desenvolvimento de metástase como endpoint surgiu, e um miRNA (miR-101-5p) com a sobrevida global endpoint foi identificado, porém nenhuma delas permaneceu significativamente associada com qualquer sobrevida livre Globalmente- ou metástase após o ajuste para testes múltiplos. Todos os miRNAs identificados por estas análises foram expressos em níveis muito baixos em nossa coorte com a mais alta expressão média observada para miR-454-3p com 187 leituras para o menor para miR-194-3p com apenas 19 lê.

Discussão

no presente trabalho, a sequenciação de profundidade foi utilizada para quantificar a expressão de miRNA em uma grande coorte de amostras tumorais de CRC. Esta abordagem pode contribuir vantagens potenciais na análise global de expressão miRNA, mas também acarreta novos desafios em matéria de análise de dados, como a quantidade de dados coletados após o seqüenciamento profunda contém milhões de leituras que precisam ser mapeados para o genoma e normalizada [30]. Nos 88 pacientes CRC analisados ​​com sucesso, 523 miRNAs maduros foram detectados. Outras sequências de ARN pequenos, também foram detectados, mas as baixas frequências de detecção de outras classes de ARN e regiões genómicas mostraram que a selecção para miARNs tivesse sido bem sucedida, e em conformidade com os resultados anteriores [29], [31]. Além disso, a excelente concordância observada entre repetições técnicas sugeridas reprodutibilidade adequada.

Os cinco miRNAs mais abundantemente expressas na coorte CRC examinadas foram miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p e miR-192-5p, e todos eles têm mostrado previamente ser desreguladas em CRC [32] – [38]. Estes miRNAs também estavam entre os miRNAs mais altamente expressos em um estudo prévio realizado utilizando profunda sequenciamento de 8 amostras de CRC e tecidos normais [39] correspondente. Curiosamente, as cinco principais miARNs mais altamente expressos responsável por tanto quanto 54% do número total de sequências de miARN detectados. Isto está em concordância com um estudo anterior sequenciação profunda realizada em amostras de sangue periférico, em que a família deixou-7 foi responsável por 77% do total de miARN ler as contagens [29]. A importância relativa de alta versus baixa expressão miRNA é difícil de interpretar, já que a ausência ou a presença abundante de miRNAs podem representar sinais de regulação biológicas igualmente importantes. No entanto, sobre-representação de um pequeno número de miARN pode implicar que estes miARN desempenham um papel importante como reguladores negativos de alvos a jusante e as vias biológicas afectadas por estes alvos. As metas previstas das 5 miRNAs mais altamente expressos foram significativamente associados com vias de câncer relevantes, incluindo a via CRC. Entre os objectivos previstos na via de CRC foram oncogenes, genes supressores de tumores e de reparação de ADN que estão envolvidos em várias vias de sinalização importantes, incluindo Wnt, MAPK, do ciclo celular, a TGF-β, e p53. metas previstas (hMSH2 e hMSH6) também estavam envolvidos com downregulating genes de reparo de DNA que afetam microssatélites e são, assim, envolvido na via de instabilidade de microssatélites. Estes resultados sugerem que o identificou top cinco mais altamente expresso miRNA são câncer relevante e provavelmente relevante no CRC, mas uma investigação mais aprofundada é necessária para validar as metas e avaliar os efeitos a jusante.

Uma das supostas vantagens de sequenciamento de profundidade em comparação com a análise de microarray e qRT-PCR é melhorada especificidade e sensibilidade, o que sugere que este método poderia retornar medições mais correto de cada miARN do que os outros métodos. Ao comparar os nossos resultados anteriores, medindo a expressão de seis miRNA utilizando qRT-PCR com os dados de sequenciamento de profundidade, a correlação do nível de amostra individual foi ruim para todos os miRNAs examinados. seqüenciamento profunda é muitas vezes validados por qRT-PCR, mas as comparações detalhadas entre as duas abordagens não foram realizados. Em um estudo de sequenciamento de profundidade em amostras de câncer de bexiga 9, miRNAs selecionados de sequenciamento de profundidade foram validados por qRT-PCR, e relatou correlacionar-se bem quando analisados ​​por diferenças de expressão dobra em um terreno bar [40]. Num outro estudo realizado em 10 amostras de neuroblastoma, coeficientes de correlação entre 0,1 e 1 foram encontrados quando se compara a soma de expressão miARN de qRT-PCR e sequenciação profunda [41]. As maiores discrepâncias na nossa comparação entre qRT-PCR e sequenciamento foi encontrado com miR-101 e miR-145. O ensaio utilizado para qRT-PCR bem como a sequenciação foram ambos capazes de detectar, mas não entre para separar isoformas conhecidas destes miARNs. Nos dados de sequenciamento, há variações de nucleotídeos foram encontrados que poderiam explicar as discrepâncias. Em teoria, a ausência de detecção do miR-101 por qRT-PCR pode ser um problema de sensibilidade, ao passo que para o miR-145, a falta de especificidade do ensaio de qRT-PCR pode explicar as discrepâncias. Assim, parece claro se qRT-PCR pode ser usado para fins de validação, uma vez que os dados de sequenciação profundas qRT-PCR e são gerados com diferentes métodos e aparecer em diferentes escalas com intervalos de expressão variável, tornando-se difícil comparar os dois conjuntos de dados sobre um paciente -para-paciente base.

Um dos objetivos deste estudo foi investigar a associação entre a expressão miRNA e os parâmetros clínico e resultado. Dada a baixa variabilidade observada entre as amostras, não é surpreendente que algumas dessas associações foram detectados. Usando univariada de Cox de regressão de risco proporcional, não há miARNs foram encontrados para ser associado com o desenvolvimento de metástase ou sobrevivência global após correcção para múltiplos ensaios. Não miRNA foram selecionados na análise LASSO. Baixa expressão de miR-592 e expressão elevada de miR-10b-5p e miR-615-3p foram associados com tumores localizados no cólon direito em comparação com tumores no cólon esquerdo e do recto. Alta expressão de miR-615-3p também foi associada com tumores pouco diferenciados. MiR-10b foi previamente relatado para ser reprimidos no CRC e alta expressão foi associada com o avançado pT-stage [42], mas nenhuma dessas associações foram detectados em nossa coorte. MiR-592 foi anteriormente encontrada para ser regulada negativamente em tumores com reparação de emparelhamentos incorrectos deficiente em comparação com tumores proficientes reparação de emparelhamentos incorrectos [43], [44]. Deficiência de reparo incompatível dá origem a instabilidade de microssatélites, e no CRC esporádica, tumores instáveis ​​microssatélites são freqüentemente localizado no lado direito do cólon [45], [46]. Assim, a baixa expressão de miR-592 em tumores do cólon direito no presente estudo seria consistente com os resultados anteriores, mas desde muito pouco se sabe a respeito dos alvos deste miRNA, clarificar esta questão exigiria estudos adicionais. MiR-615 exibiram a maior diferença na expressão entre o direito e cólon esquerdo nesta coorte, e também foi altamente expressa em tumores pouco diferenciados. Há poucos relatos sobre a expressão e função deste miRNA, mas em um estudo, miR-615 expressão foi reprimidos quando a proposta NGX6 supressor de tumor foi experimentalmente introduzido na linha de células CRC humano HT29. Em nossa coorte, 7 dos 10 tumores pouco diferenciados foram localizado no cólon direito.