Abstract
pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é um câncer mortal com um prognóstico pobre que se caracteriza pela excessiva ativação via mitogênica e marcou chemoresistance a um amplo espectro de medicamentos quimioterápicos. especificidade dual proteína fosfatase 1 (DUSP1) é um regulador negativo chave da proteína-quinases activadas mitogénio (MAPKs). No entanto, DUSP1 é abundante em células de câncer de pâncreas (CCP) em PDAC onde, paradoxalmente, aumenta a formação de colónias em agar mole e promove
in vivo
tumorigenicidade. No entanto, não se sabe se a sobre-expressão contribui para DUSP1 PDAC quimioresistência. Usando BxPC3 e COLO-357 CCP humanos, que mostram que a gemcitabina activa c-Jun quinase N-terminal (JNK) e p38 MAP quinase (MAPK p38), cinases-chave em duas grandes vias de sinalização activadas por tensão. JNK e p38 MAPK induzida por activação gemcitabina media o aumento da apoptose, mas também regula positivamente transcricionalmente DUSP1, como evidenciado pelo aumento dos níveis de ARNm DUSP1 e ARN polimerase II de carga no corpo do gene DUSP1. Por outro lado, a inibição mediada por shRNA de DUSP1 aumenta de JNK e p38 MAPK de activação e a quimiossensibilidade a gemcitabina. Usando knockdown doxiciclina-indutível da DUSP1 em tumores pancreáticos ortotópicos estabelecidos, verificou-se que a combinação com gemcitabina a inibição DUSP1 melhora a sobrevivência dos animais, atenua a angiogénese, e aumenta a morte celular por apoptose, em comparação com gemcitabina sozinha. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a sobre-regulação mediada por gemcitabina de DUSP1 contribui para um circuito de realimentação negativa que atenua a sua acção benéfica sobre as vias de stress e apoptose, levantando a possibilidade de que a segmentação DUSP1 em PDAC pode ter a vantagem de aumentar a gemcitabina quimiossensibilidade ao suprimir a angiogénese.
Citation: Liu F, Gore AJ, Wilson JL, Korc M (2014) DUSP1 é um novo alvo para Ampliação do cancro do pâncreas sensibilidade das células à gemcitabina. PLoS ONE 9 (1): e84982. doi: 10.1371 /journal.pone.0084982
editor: Rajesh Agarwal, da Universidade do Colorado em Denver, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de outubro de 2013; Aceito: 27 de novembro de 2013; Publicação: 07 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Cancer Institute (NCI) concessão CA-R37-075059 para MK, concedido pelo National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Murray Korc é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer em os EUA, com uma taxa de mortalidade anual de cerca de 38.000, uma sobrevida média de 6-7 meses e uma taxa de sobrevivência de cinco anos de 6% [1]. Enquanto ressecção prolonga a sobrevivência e oferece uma cura potencial, 80-85% de PDAC são não operável no momento do diagnóstico, devido à presença de metástases distantes, semeadura peritoneal, ou invasão em estruturas adjacentes vitais [2]. A gemcitabina agente quimioterapêutico (2 ‘, 2’-difluorodesoxicitidina, dFdC) tem sido o padrão de cuidados para pacientes com doença localmente avançada ou metastática [3]. Recentemente, a Food and Drug Administration aprovou a combinação de gemcitabina e nab-paclitaxel, com base na constatação de que esta combinação melhorou a sobrevivência global a 8,5 meses contra 6,7 meses com gemcitabina sozinha [4]. É geralmente aceite que a melhoria da capacidade de resposta a gemcitabina no PDAC levaria a um aumento adicional na sobrevida do paciente.
A resistência do PDAC à gemcitabina e muitos outros agentes quimioterápicos é devido, em parte, a uma ampla gama de genética e alterações epigenética que levam à activação anormal da sobrevivência das células e as vias anti-apoptóticas [5], uma desmoplasia intensa que interfere com a administração de fármaco para a massa de tumor [6], [7], e as alterações na expressão de moléculas-chave envolvidas no gemcitabina absorção, a activação intracelular e o efluxo de [8]. Há uma necessidade urgente, portanto, para fazer avançar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes chemoresistance no PDAC, a fim de elaborar novas e mais eficazes estratégias de quimioterápicos.
activação anormal de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) desempenha um papel crítico na regulação da sobrevivência celular e apoptose [9], [10]. MAPKs podem ser agrupados em três famílias: quinase regulada por sinal extracelular (ERK), c-Jun-NH2-quinase (JNK), e p38 MAPK [9], [10]. Após estimulação por mitogénio ou stress ambiental, MAPKs são activados através de fosforilação nos seus resíduos de tirosina e treonina por cinases a montante MAP2K [9], [10]. MAPKs fosforilam activados um espectro de substratos alvo, incluindo cinases de proteínas e factores de transcrição envolvidos na regulação da proliferação celular, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose [9], [10]. Apesar da existência de vias de diafonia entre diferentes MAPKs, mais evidências suportam o conceito de que activada ERK promove a proliferação celular, sobrevivência, e a motilidade, enquanto JNK e MAPK p38 regulam negativamente a progressão do ciclo celular e induzir a morte celular por apoptose em resposta ao stress ambiental [9] , [10].
A família de dupla especificidade fosfatase (DUSP) de proteínas é composto por 25 membros [11]. DUSPs pode desfosforilar resíduos de ambos os treonina /serina e tirosina dos seus substratos e, assim, funcionar como reguladores negativos da MAPK [11]. DUSP1 /MKP-1 é uma fosfatase MAPK nuclear que é um alvo transcricional directo do p53, a E2F-1, c-Jun e ATF2, e que é induzida em resposta ao stress oxidativo, hipóxia, e outros tipos de stress, tais como a privação nutricional e fármacos quimioterapêuticos [12] – [14]. DUSP1 é sobre-expresso numa variedade de tumores epiteliais, incluindo PDAC, cancro do pulmão de células não pequenas-, da mama, do ovário, gástrico, e cancro da próstata na fase inicial [15] – [20], e esta sobre-expressão correlaciona-se com um mau sobrevivência do paciente em cancro do ovário [18]. O aumento da expressão DUSP1 no cancro da mama está inversamente correlacionada com a actividade de JNK e marcadores de apoptose, sugerindo um papel anti-apoptótica de DUSP1 através da sua actividade de JNK em direcção [17]. Em apoio a esta conclusão, as células cancerosas que sobre-expressam DUSP1 são resistentes à quimioterapia e Fas apoptose induzida por ligando, enquanto que a redução dos níveis de DUSP1 usando um pequeno ARN interferente aumenta a sensibilidade a estes agentes, [21] – [23]. Por outro lado, no carcinoma hepatocelular (HCC) aumento dos níveis DUSP1 correlacionam com melhor prognóstico [24]. Além disso, DUSP1 regula negativamente a sinalização de ERK em células de carcinoma hepatocelular, inibindo deste modo o seu potencial proliferativo, sugerindo que DUSP1 é um gene supressor tumoral no carcinoma hepatocelular [24]. Assim, as conseqüências deletérias do DUSP1 superexpressão são o câncer provavelmente específico.
Nós relatamos que DUSP1 é abundante no PDAC, e que a supressão mediada por antisense de expressão DUSP1 reduz o desenvolvimento do tumor em ratinhos nude [15]. Não se sabe, contudo, se DUSP1 poderia ser um alvo para melhorar a resposta à quimioterapia baseada em PDAC gemcitabina. Nós agora demonstrar que a gemcitabina ativa JNK e p38 MAPK, levando assim a um aumento da apoptose e da transcrição DUSP1. Por outro lado, a inibição mediada por shRNA de DUSP1 aumenta de JNK e p38 MAPK de activação induzida por gemcitabina e sensibiliza células PDAC a gemcitabina. Usando uma estratégia de doxiciclina indutível para suprimir DUSP1 em tumores pancreáticos ortotópicos estabelecidos, que mostram que a combinação de gemcitabina com inibição DUSP1 prolonga a sobrevivência, atenua a angiogénese, e aumenta a morte celular por apoptose. Assim, DUSP1 pode ser um potencial alvo terapêutico para aumentar a sensibilidade PDAC a gemcitabina.
Resultados
JNK e p38 MAPK vias de sinalização são ativados em resposta à gemcitabina
Os efeitos da gemcitabina no crescimento de PCC foram avaliados utilizando o ensaio de MTT. Em todas as três linhas celulares, gemcitabina exerceu um efeito inibidor do crescimento dependente da dose. AsPC-1 era mais resistente a gemcitabina, com uma IC50 superior a 100 ng /mL, enquanto BxPC-3 e COLO-357 células eram mais sensíveis a gemcitabina, com valores de IC50 de 10 ng /ml e 5 ng /mL, respectivamente ( Fig. 1A).
(a) AsPC-1, BxPC-3, e células COLO-357 foram incubadas durante 48 h na ausência ou na presença de várias concentrações de gemcitabina, e ensaios MTT foram realizados. Os dados são a média ± SEM de 3 experiências. * P 0,05; ** P 0,01, comparado com o controlo. (B) AsPC-1, BxPC-3, e células COLO-357 foram incubadas durante os tempos indicados com 100 ng /ml, 10 ng /ml e 5 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, e analisados por imunotransf erência. (C) As células BxPC-3 foram incubadas durante 48 h com 10 gemcitabina ng /ml de (G), na ausência ou na presença de 10 uM SB203580 (SB) ou 10 pM SP600125 (SP), e analisados por imunotransf erência.
para avaliar os efeitos da gemcitabina na activação de MAPK, as células foram incubadas com gemcitabina a uma concentração próximo do seu respectivo IC 50 s. Em BxPC-3 e COLO-357, gemcitabina induziu a fosforilação de JNK e p38 MAPK, cinases-chave em duas grandes vias de sinalização activadas por stress (Fig. 1B). A gemcitabina também aumentou os níveis de fosfo-c-Jun nestas células (Fig. 1B). Dado que a fosfo-c-Jun é um alvo comum a jusante de p38 MAPK e JNK vias, confirmou esta observação a activação de p38 MAPK e sinalização de JNK. Além disso, os níveis de caspase 3 clivada e PARP clivada correlacionada com MAPK p38, JNK, e a activação de c-Jun, indicando que p38 MAPK e JNK vias mediar a morte celular por apoptose em resposta a gemcitabina (Fig. 1B). Em contraste, AsPC-1 foram mais resistentes a gemcitabina, como evidenciado pela ausência de p38 MAPK e a activação de JNK e os níveis mais baixos de caspase clivada 3 e PARP clivada, mesmo a uma concentração tão elevada quanto 100 ng /mL (Fig. 1B). Para determinar se a apoptose induzida através de gemcitabina p38 MAPK e a activação de JNK, células BxPC-3 foram incubadas com gemcitabina na ausência ou na presença de p38 MAPK (SB203580) ou inibidores da JNK (SP600125). Os níveis de PARP clivada e clivada da caspase 3 foram reduzidos em SB203580 SP600125 e, quando adicionado a gemcitabina (Fig. 1C). Assim, em linhas de células sensíveis, gemcitabina activa p38 MAPK e JNK sinalização que induz a morte celular por apoptose, enquanto que a gemcitabina-resistência está associada com níveis mais baixos de apoptose e a activação da MAPK p38 /JNK marcadamente atenuada.
A gemcitabina Activa DUSP1 Transcrição através de JNK e p38 MAPK sinalização
Considerando que DUSP1 é um regulador chave da actividade de MAPK [11], que em seguida examinada a expressão de DUSP1 em resposta a gemcitabina e o mecanismo subjacente que regula a sua expressão. Em ambas as células BxPC-3 e COLO-357, ARNm DUSP1 e os níveis de proteína foram induzidos às 24 h e 48 h após a adição de gemcitabina, coincidindo com a activação de p38 MAPK e JNK (Fig. 2A). Em contrapartida, não há alterações significativas nos níveis DUSP1 foram observados em células ASPC-1 gemcitabina-resistente, de acordo com os baixos níveis de apoptose e a ausência de p38 MAPK e a activação de JNK quando do tratamento (Fig. 2A).
(a) AsPC-1, BxPC-3, e COLO-357 células foram incubadas durante os tempos indicados com 100 ng /ml, 10 ng /ml e 5 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, e níveis DUSP1 foram avaliadas por Q- PCR e immunoblotting. (B, C) células BxPC-3 e COLO-357 foram incubadas durante 24 h com 10 ng /ml e 5 ng /gemcitabina ml, respectivamente, na ausência ou na presença de 10 pmol /L U0126, 10 umol /L SP600125, 10 umol /L SB203580, ou ambos e SP600125 SB203580, e Q-PCR (B) e a ARN-polimerase II ChIP seguido por Q-PCR para a região do corpo do gene DUSP1 (C) foram realizados. Todos os dados são as médias ± SEM de 3 experiências. * P 0,05; ** P . 0,01, comparado com o controlo
em resposta a vários estímulos, o factor de transcrição AP-1 (c-jun, c-Fos, ATF2), que é o principal alvo a jusante de p38 MAPK e sinalização de JNK, foi mostrado para associar com o promotor DUSP1 e regulam a sua transcrição [14], [25]. Para determinar se p38 MAPK e JNK sinalização mediar a indução da expressão DUSP1 por gemcitabina, BxPC-3 e COLO-357 células foram tratadas com gemcitabina na ausência ou na presença de SB203580, SP600125, ou sua combinação. SB203580 SP600125 e diminuiu a indução de níveis de ARNm por DUSP1 gemcitabina, ao passo que a sua combinação bloquearam completamente esta indução. Por outro lado, a inibição de ERK com U0126 não conseguiu alterar a indução mediada por gemcitabina de DUSP1, apoiando a conclusão de que p38 MAPK e JNK, em vez de ERK sinalização mediar a indução DUSP1 por gemcitabina (Fig. 2B).
O aumento da DUSP1 Os níveis de ARNm pode ser devido à actividade de transcrição melhorada a estabilidade do mRNA ou pós-transcricional. Portanto, a imunoprecipitação da cromatina contra a ARN-polimerase II, que é o principal componente da maquinaria de transcrição, foi realizada próximo, seguido por Q-PCR para quantificar a quantidade de RNA polimerase II ligado à região do corpo do gene de DUSP1. Este ensaio permite a medição directa da etapa de alongamento activo e reflecte a actividade de transcrição do gene DUSP1. incubação das células BxPC-3 e Colo-357 com gemcitabina, durante 24 h aumentou a quantidade de ARN polimerase II de carga na região do corpo do gene de DUSP1 por 6 vezes e 12 vezes, respectivamente (Fig. 2C), apontando para activação da transcrição de DUSP1 por gemcitabina . SB203580 e SP600125, mas não U0126, inibiu o aumento induzido por gemcitabina na quantidade de ARN polimerase II associada com o corpo do gene DUSP1 (Fig. 2C). Em conjunto, estes resultados indicam que a p38 MAPK e medeia sinalização JNK DUSP1 activação da transcrição de gemcitabina.
Interrupção do feedback negativo DUSP1 laço Melhora Chemosensitivity a gemcitabina e cisplatina
Para investigar o efeito de silenciar DUSP1 sobre as actividades de MAPK e quimiossensibilidade gemcitabina, AsPC-1, BxPC-3, e células COLO-357 foram estavelmente transduzidas com lentivírus expressando shRNA contra DUSP1 ou não segmentação de controlo de encriptação e depois incubadas com várias concentrações da gemcitabina. Em todas as três linhas celulares, DUSP1 knockdown utilizando dois shRNAs aumentou as acções inibidoras de crescimento de gemcitabina. Assim, silenciando DUSP1 deslocou os valores de IC50 para a gemcitabina em AsPC-1, BxPC-3 e COLO-357 células de 500 a 10 ng /ml, de 10 a 5 ng /ml, e a partir de 5 a 2,5 ng /ml, respectivamente (Fig. 3A). Estes resultados sugerem que DUSP1 knockdown reforçada gemcitabina quimiossensibilidade, e que os efeitos de sensibilização foram mais marcada em células com elevada quimioresistência.
AsPC-1, BxPC-3, e COLO-357 células foram estavelmente transduzidas com lentivírus expressando shRNA contra o controle de corrida ou DUSP1. (A) células foram incubadas durante 48 h na ausência ou na presença de várias concentrações de gemcitabina, e ensaios MTT foram realizadas. Os dados são a média ± SEM de 3 experiências. * P 0,05; ** P 0,01, comparado com o controlo. (B) AsPC-1, BxPC-3, e COLO-357 células foram incubadas durante os tempos indicados com 100 ng /ml, 10 ng /ml e 5 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, e analisados por imunotransf erência.
O anticorpo anti-DUSP1 rotineiramente revelou 2 bandas estreitamente migrando em western blot (Fig. 2-3). No entanto, com dois knockdown DUSP1 shRNAs altamente específicos segmentação DUSP1 especificamente a expressão silenciado da banda mais baixa (Fig. 3B), indicando que a banda superior foi não-específica. DUSP1 knockdown com os mesmos shRNAs altamente específicos também potenciou a apoptose induzida por gemcitabina, como evidenciado pelo aumento dos níveis de PARP clivada e clivada da caspase 3 (Fig. 3B). Níveis mais elevados de MAPK fosfo-p38 induzida por gemcitabina e fosfo-JNK também foi observado em células DUSP1 knockdown, em comparação com o controle de precipitação, o que sugere que o silenciamento DUSP1 desreprimido p38 MAPK e de sinalização JNK, conduzindo assim à morte celular por apoptose aumentada em resposta a gemcitabina (Fig. 3B).
Considerando que a gemcitabina pode ser utilizado em conjunto com a cisplatina ou 5-fluorouracilo para tratar localmente avançado ou metastásico PDAC [26], [27], que próxima procuraram determinar se segmentação DUSP1 teria um efeito estimulante semelhantes em outros agentes quimioterapêuticos para além gemcitabina. Para este fim, BxPC-3 e COLO-357 células que expressam estavelmente shRNA contra DUSP1 ou precipitação de controlo foram tratados com várias concentrações de cisplatina. Em ambas as células BxPC-3 e COLO-357, DUSP1 knockdown diminuição da IC50 de 2 a 0,5 ug /ml, e também potenciou a morte celular por apoptose induzida por cisplatina, como evidenciado pelo aumento dos níveis de PARP clivada e clivada da caspase 3 (Fig. 4A, 4B). Níveis mais elevados de fosfo-MAPK p38 induzida por cisplatina e fosfo-JNK também foi observado em células com DUSP1 knockdown (Fig. 4B), e foram obtidos resultados semelhantes com células ASPC-1 (dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a interrupção do feedback negativo de p38 MAPK e JNK sinalização suprimindo DUSP1 poderia intensificar a apoptose e melhorar a quimiossensibilidade de cancro do pâncreas para vários agentes quimioterapêuticos.
BxPC-3 e COLO-357 células eram estavelmente transduzidas com lentivírus expressando shRNA contra o controle de corrida ou DUSP1. (A) células foram incubadas durante 48 h na ausência ou na presença de várias concentrações de gemcitabina, e ensaios MTT foram realizadas. Os dados são a média ± SEM de 3 experiências. * P 0,05; ** P 0,01, comparado com o controlo. (B) BxPC-3 e COLO-357 células foram incubadas com 2 ug /ml de cisplatina durante os tempos indicados, e immunoblotting foi realizado.
Knockdown de DUSP4, Outra DUSP Nuclear, falha para melhorar Chemosensitivity
a seguir, procuraram determinar se reforçada quimio-sensibilidade é exclusivo para silenciamento DUSP1 ou uma característica comum de atacar quaisquer membros da família DUSP. Assim, optou-se por knockdown DUSP4 /MKP-2, devido à sua semelhança com DUSP1 em termos de localização subcelular e preferência substrato [11]. células ASPC-1 e BxPC-3 foram estavelmente transduzidas com codificação lentivírus shRNA contra DUSP4 ou não de metas de controle de corrida. silenciamento de sucesso de DUSP4 foi confirmada com imunotransferência (Fig. 5B). No entanto, DUSP4 knockdown não conseguiu afectar a activação de MAPK ou a resposta a gemcitabina em qualquer uma das linhas de células (Fig. 5A, 5B). Assim, DUSP1 é um alvo terapêutico potencial para potenciar MAPK activada pelo stress sinalização e aumentando a quimiossensibilidade a gemcitabina, o qual não é necessariamente uma característica comum de todos os membros da família DUSP.
AsPC-1 e células BxPC-3 foram estavelmente transduzidas com lentivírus expressando shRNA contra o controle de corrida ou MKP2. (A) células foram incubadas durante 48 h na ausência ou na presença de várias concentrações de gemcitabina, e ensaios MTT foram realizadas. (B) AsPC-1 e células BxPC-3 foram incubadas durante os tempos indicados com 100 ng /ml e 10 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, e imunotransferência foi realizada. Os dados são os meios ± SEM de 3 experiências.
gemcitabina e DUSP1 Knockdown Combinar para prolongar a sobrevivência, Atenuar Tumor Angiogenesis e proliferação, e intensificar a apoptose
A seguir, procurou avaliar o efeito de inibir DUSP1 na quimio-sensibilidade gemcitabina num modelo ortotópico mouse. Para estudar o potencial terapêutico de segmentação DUSP1 em tumores pancreáticos totalmente estabelecida, estavelmente transduzidas COLO-357 células de cancro pancreático humano com lentivírus expressando shRNA doxiciclina induzível contra DUSP1 ou um controlo não segmentação precipitação, antes de injectar as células no pâncreas de imunodeficiente camundongos em um estado TET-OFF. Duas semanas mais tarde, as células que expressam shRNA doxiciclina-inducible contra o controle formado tumores DUSP1 ou mexidos de tamanho similar, que poderiam ser facilmente palpáveis. Todos os ratinhos foram fotografadas no dia 15 pós-cirurgia, utilizando um ultra-sons de alta resolução, e os volumes dos tumores foram calculados com base nas imagens 3-D adquiridos, confirmando que os dois grupos de igual volume de tumores (Fig. 6) formado. A partir de 18 dias pós-cirurgia, doxiciclina foi continuamente administrado na água de beber, e os ratinhos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos para receber veículo ou gemcitabina (50 mg /kg, injecção intraperitoneal, duas vezes por semana). Gemcitabina sozinha ou DUSP1 silenciamento sozinha não conseguiu prolongar a sobrevivência dos animais (Fig. 7A). No entanto, a comparação do grupo de shRNA-precipitação /gemcitabina e o grupo shRNA-DUSP1 /gemcitabina revelou que DUSP1 knockdown gerada uma vantagem de sobrevivência significativa na presença de gemcitabina (p = 0,037) (Fig. 7A). O aumento no tempo de sobrevivência foi ainda maior quando se compara o grupo shRNA-DUSP1 /gemcitabina com o grupo shRNA-precipitação /veículo (p = 0,009), o que sugere que o aumento da sensibilidade DUSP1 silenciamentos gemcitabina
In vivo
(Fig. 7A ).
células COLO-357 foram transduzidas estavelmente com lentivírus expressando controle Tet-inducible shRNA (shScramble) ou-DUSP1 segmentação shRNA (shDUSP1). As células foram injectadas no pâncreas de ratinhos imunodeficientes, e 15 dias mais tarde, os tumores foram fotografadas usando um ultra-sons de alta resolução Vevo2100. (A-B) imagens de ultra-sons de alta resolução representativos (A) e quantificação dos volumes tumorais utilizando varreduras abdominais 3D (b) mostram que, antes de Dox ou tratamentos gemcitabina, shScramble e tumores shDUSP1 (T, indicadas por setas) foram semelhantes em tamanho . Dados em (B) são as médias ± SEM.
ratinhos imunodeficientes portadores de tumores ortotópicos derivadas de células COLO-357 que expressam de forma estável doxiciclina-inducible shRNA contra o controle de corrida ou DUSP1 receberam doxiciclina na água de beber e tratou-se com o controlo de veículo (solução salina) ou gemcitabina (50 mg /kg, ip, duas vezes por semana). sobrevivência (A) de Kaplan-Meier. * P 0,05, comparado com precipitação tratados com gemcitabina;
## p 0,01, em comparação com corrida tratados com solução salina. (B) medida de Q-PCR dos níveis de mRNA DUSP1. (C) coloração TUNEL e análise imunohistoquímica de CD34, Ki67, e caspase 3. Escala, 20 mm. (D) Quantificação. Os dados são a média ± SEM de 3 experiências. * P 0,05; ** P . 0,01, em comparação com corrida tratados com solução salina
De acordo com
in vitro
resultados, o tratamento gemcitabina aumento dos níveis de mRNA DUSP1 em tumores shRNA-mexidos. A maioria dos tumores shRNA-DUSP1 tinham níveis relativamente baixos de DUSP1, ao passo que um tumor mostrou níveis elevados DUSP1, possivelmente devido à exposição mais curto doxiciclina ou contaminação com o tecido não tumoral adjacente quando a colheita da amostra. Estes resultados sugerem que a doxiciclina shRNA expressão induzida com sucesso. No entanto, devido à alta variabilidade entre cada rato, a diferença em níveis DUSP1 entre diferentes grupos não era estatisticamente significativa (Fig. 7B).
Para avaliar os efeitos de silenciamento DUSP1 tratamento e gemcitabina na angiogénese do tumor, proliferação, e apoptose, tecidos de tumor foram em seguida analisadas por coloração imuno-histoquímica para CD34 (angiogénese) e Ki67 (proliferação), bem como por desoxinucleotidil transferase dUTP nick rotulagem terminal da extremidade (TUNEL) e caspase 3 clivada imunorreactividade, ambos os quais são marcadores de apoptose. A gemcitabina atenuou ligeiramente sinais de CD34 e Ki67, enquanto DUSP1 knockdown teve um efeito inibidor acentuado na coloração de CD34 e um efeito inibidor mais moderada, mas altamente significativo na coloração de Ki67 (Fig. 7C, 7D). DUSP1 silenciamento também conduziu a uma maior imunorreactividade de caspase 3 clivada e sinais de TUNEL, em comparação com tumores de controlo precipitação, o que indica que houve um aumento na morte celular por apoptose seguinte knockdown DUSP1. O aumento na clivagem de caspase 3 e fragmentação de ADN foi ainda maior quando se combina DUSP1 silenciamento com gemcitabina (Fig. 7C, 7D). Assim, visando DUSP1
in vivo
levou a angiogênese suprimida e proliferação de células cancerígenas, e apoptose induzida por gemcitabina reforçada.
Discussão
JNK1, -2, e -3 são codificada pelo
MAPK8
,
MAPK9
e
MAPK10
, respectivamente, e splicing alternativo dá origem a pelo menos dez isoformas [9]. Por outro lado, p38 MAPK-α, -β, -γ e -δ são codificados por
MAPK14
,
MAPK11
,
MAPK12
, e
MAPK13
, respectivamente, e existem duas isoformas de splicing alternativo de
MAPK14
[9]. Globalmente, JNK e p38 MAPK vias de stress activados induzem a apoptose em alguns casos, mas aumentam a sobrevivência em outros, dependendo das diferenças específicas do tipo de célula, a intensidade e duração de sinalização, e a presença ou ausência de interferência com outras vias de sinalização [9].
no presente estudo determinou-se que a gemcitabina activado JNK e p38 MAPK, induzindo a apoptose em PCCs. Enquanto o papel de isoformas específicas não foi avaliada, de JNK activada por gemcitabina e de sinalização MAPK p38 também induziu DUSP1 transcrição, tal como evidenciado pelo aumento dos níveis de ARNm DUSP1 e aumentou o carregamento de ARN-polimerase II para o corpo do gene DUSP1. Além disso a inibição, mediada por shRNA de DUSP1 melhorada induzida por gemcitabina JNK e p38 MAPK de activação e sensibilizados células PDAC de gemcitabina e cisplatina, que conduz a uma diminuição da proliferação celular e aumento da PARP e caspase 3 clivada. Estes resultados sugerem que a activação mediada por gemcitabina de JNK e p38 MAPK leva à sobre-regulação de DUSP1, que por sua vez contribui para um circuito de realimentação negativa que atenua a actividade de JNK e p38 MAPK, interferindo, assim, com as acções benéficas da gemcitabina nas vias de stress e apoptose (Fig. 8). Estas observações levantam a possibilidade que DUSP1 pode ser um alvo terapêutico potencial para aumentar a sensibilidade PDAC para vários agentes quimioterapêuticos. Além disso, DUSP1 segmentação leva ao aumento dos níveis de p-ERK1 e p-ERK2 [15], e ativação ERK em células de câncer de pâncreas aumenta a gemcitabina chemoresistance [28]. Assim, os aumentos induzidos por gemcitabina em JNK e p38 MAPK atividades são cruciais para suas ações pró-apoptóticos.
A gemcitabina ativa JNK e p38 MAPK (p38) de sinalização, que medeia a morte celular por apoptose. Activado JNK e p38 MAPK, em seguida, regular positivamente a transcrição DUSP1, que modula negativamente a actividade de sinalização JNK e p38 MAPK e atenua a morte celular induzida por gemcitabina. Inibindo DUSP1 em associação com a gemcitabina melhora significativamente a quimio-sensibilidade das células de câncer de pâncreas.
regulação negativa do DUSP1 suprime a expressão de fatores angiogênicos, tais como SH2D2A e VEGF-C no cancro do pulmão de células não pequenas-( NSCLC) células, e os ensaios funcionais têm confirmado o papel de DUSP1 na promoção de angiogénese de tumores [29]. Além disso, em espécimes humanos com NSCLC, DUSP1 co-localiza com as estruturas vasculares CD31-positivo, e uma estreita correlação entre aumento da expressão de VEGF-C e DUSP1 tem sido demonstrada [29]. Estes resultados suportam o conceito de que DUSP1 pode desempenhar um papel importante na angiogénese tumoral. Embora PDAC é caracterizada por a desmoplasia acentuada e hipoperfusão, também exibe uma elevada propensão para metastizar através hematog�icas ou linfáticos rotas, mesmo quando o tumor primário é pequeno [30]. Além disso, PDAC exposições focos de micro-angiogênese e sobre-expressar múltiplos factores pró-angiogénicos e angiogênese reforçada, altos níveis séricos de VEGF-A, e aumentou VEGFR-2 foram correlacionadas com um pior prognóstico em pacientes PDAC [30]. Juntos, estes relatórios sublinham a importância potencial da angiogénese aberrante no PDAC e implicam DUSP1 como contribuir para este processo.
Usando knockdown doxiciclina-inducible de DUSP1 em tumores pancreáticos ortotópicos estabelecidos, no presente estudo determinou-se que a combinação de gemcitabina com a inibição prolongada sobrevivência dos animais DUSP1 e morte celular por apoptose aumentada, em comparação com gemcitabina sozinha. Além disso, DUSP1 knockdown marcadamente atenuada proliferação PCC e angiogénese tumoral. A nossa utilização de ratinhos imunodeficientes opõe-se uma avaliação das consequências da inibição DUSP1 sobre o sistema imunitário ou no número de macrófagos e a activação dentro da massa de tumor pancreático. Dado que DUSP1 é conhecido para modular a proliferação de macrófagos e ativação [31], os estudos com singênica ou modelos de ratos geneticamente modificadas de PDAC será obrigado a abordar este aspecto da função DUSP1 no PDAC.
Os mecanismos que levam ao aumento expressão DUSP1 no PDAC não são conhecidos. Foi demonstrado, no entanto, que a hipoxia pode regular positivamente a transcrição DUSP1 [14], e PDAC é um tumor altamente desmoplásica com um ambiente hipóxico marcadamente [5] – [7]. Além disso, na presença de estresse oxidativo, E2F1 induz a expressão DUSP1 [13], e E2F1 é regulada positivamente em PDAC como uma consequência da disfunção RB e activação excessiva de PI3K [32], [33]. Tomados em conjunto com as descobertas atuais, estas observações sugerem que PDAC pode ser “ferrado” para expor o aumento da activação DUSP1 em resposta a gemcitabina, e sugerem que a segmentação DUSP1 no PDAC poderia potencializar as ações benéficas de gemcitabina, promovendo apoptose e suprimindo a proliferação de células do câncer de pâncreas e angiogênese tumoral
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de animal Care and Use da Universidade de Indiana (número de autorização: 10108).. Todos os estudos com animais descritos foram conduzidos de acordo com os padrões aceitos de cuidados com animais humano e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Cultura celular
ASPC-1 e BxPC-3 pancreáticas células cancerosas humanas eram obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). células COLO-357 foram uma oferta do Dr. R. Metzger da Universidade de Duke, e foram originalmente colocadas em cultura por Morgan,
et al
. [34], a partir de um paciente com PDAC metastático. Eles têm sido extensivamente utilizados [15], [35], [36], e foram autenticado por análise cromossómica. AsPC-1 e células BxPC-3 foram cultivadas em meio RPMI 1640, e as células COLO-357 foram crescidas em DMEM. A menos que especificado de outro modo, os meios foram suplementados com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (meio completo).
3- (4,5-dimetiltiazol-2 -il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT)
ensaio de MTT foi realizado como descrito [35].
imunotransferência
imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [ ,,,0],35], utilizando anticorpos contra os seguintes antigénios: PARP, caspase-3 clivada, caspase-3 (Asp175), MAPK fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfo-JNK (G9), e fosfo-c-Jun ( Ser63) a partir de Cell Signaling Technology, Danvers, MA; DUSP1 (C-19), MKP2 (S-18), a JNK (FL) e ERK2 (C-14), a partir de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.