Abstract

Objectivo

Para explorar os genes reguladores-chave associadas com câncer de pulmão, a fim de reduzir a sua ocorrência e progresso através de silenciar esses genes-chave.

Métodos

para identificar os genes reguladores-chave envolvidos no cancro do pulmão, foi realizada uma combinação de variedade genética e bioinformática análises para comparar os perfis de transcrição gênica em cepas de células 3 monoclonais com alto, médio ou baixo habilidades metastáticas, que foram separados do SPC -A-1sci e SPC-A-1 linhas celulares, limitando ensaio de diluição monoclona. Em seguida, analisamos actividades biológicas desses genes por derrubar a sua expressão em células SPC-A-1sci utilizando siRNA e vectores shRNA lenti-viral, seguida por determinações da capacidade de invasão e de migração das linhas celulares resultantes in vitro, bem como o seu potencial para induzir a ocorrência e metástase de câncer de pulmão in vivo. Para examinar a relevância clínica destes resultados, foram analisados ​​os níveis de genes identificados expressão em tecidos de câncer de pulmão humano (n = 135) e combinou tecidos normais adjacentes por imuno-histoquímica (IHQ) coloração.

Resultados

Três linhagens celulares monoclonais caracterizados com alta, média ou baixa capacidade metastáticos foram selecionados com sucesso. conjunto de genes e bioinformática análises implícito que osteopontina, LAMB3 e ITGB1 foram os principais genes envolvidos no câncer de pulmão. Knockdown destes genes suprimidos invasão de células de cancro de pulmão humano e metástase in vitro e in vivo. análises de amostra clínica indicou que osteopontina, LAMB3 e ITGB1 níveis de expressão de proteína foram maiores em pacientes com câncer de pulmão, em comparação com os tecidos adjacentes não-cancerosas, e correlacionados com metástase linfática.

Conclusões

Nós confirmou que osteopontina, LAMB3 e ITGB1 desempenharam papéis importantes na ocorrência e metástase de câncer de pulmão, assim fornecido pistas importantes para a compreensão do mecanismo molecular de metástase e contribuindo para o tratamento terapêutico de câncer de pulmão

Citation:. Wang XM, Li J, Yan MX, Liu G, Jia DS, Geng Q, et ai. (2013) As análises integrativas Identificar osteopontina, LAMB3 e ITGB1 tão crítico Genes Pro-metastáticos de câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (2): e55714. doi: 10.1371 /journal.pone.0055714

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 12 Agosto, 2012; Aceito: 29 de dezembro de 2012; Publicação: 18 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa de Pesquisa chave básica Nacional da China (2009CB521803), e “plano de acção para a inovação” do fundo de Ciência e Tecnologia de Xangai (10140902400). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte por cancro no mundo (

1 milhão de mortes por ano no mundo) [1] – [2]. A metástase é um sinal e um recurso de câncer de pulmão maligno e é também a principal causa de morte e tratamento da insuficiência relacionada ao câncer de pulmão [3]. Embora mais de um século de trabalho intenso tem-se centrado em investigar o processo metastático, os mecanismos moleculares que facilitem a progressão do carcinoma in situ de carcinoma metastático permanecem em grande parte elusiva. É certo, todavia, que a metástase é um processo multi-fase dinâmica e progressiva. Várias etapas distintas são discerníveis na cascata biológica de metástases: perda de adesão celular, o aumento da motilidade e invasividade, a entrada e a sobrevivência na circulação, espalhados em novos tecidos e eventual colonização de um local distante [4]. estudos de referência consideráveis ​​têm determinado que apenas determinadas subpopulações de um tumor primário ter o potencial invasivo e metastático de se submeter ao processo metastático completo de invasão, intravasamento e extravasamento de [5] – [6]. Emergindo estes estudos foram dois conceitos fundamentais para nosso léxico câncer: ‘subpopulações metastáticas’ e ‘ineficiência metastático “[7]. Assim, um estudo sobre os diferentes perfis de expressão gênica entre subpopulações metastáticos e ineficiência metastático pela tecnologia gene chip irá revelar os genes críticos envolvidos na metástase do câncer.

Em nosso trabalho anterior, foi estabelecido um sub-linha celular altamente invasivo (SPC -A-1sci) e uma sub-linha de células fracamente invasiva (SPC-a-1) por selecção in vivo em ratinhos NOD /SCID [8]. Estas linhas de células, desde um modelo adequado para estudar o mecanismo de cancro do pulmão metastático. Aqui, nós separados mais 2 linhagens celulares monoclonal a partir da linha de células-SPC-A 1sci e uma estirpe celular monoclonal de SPC-A-1 (a linha celular parental) que caracterizou com elevados, médios ou baixos capacidades metastáticos, respectivamente, limitando monoclona ensaio de diluição. Nós, então, realizada gene-chip combinado com bioinformática análises sobre estas três estirpes.

De acordo com os resultados de matriz genética, encontramos 2277-regulada e 2257 genes regulada para baixo entre as três linhagens celulares. A análise bioinformática revelou mais detalhes sobre as funções importantes, caminhos, tendências expressivas e fluxos de sinal destes genes diferentes. O gráfico resultante a partir do modelo de sinal de fluxo indicada papéis reguladores-chave para SPP1 (ou osteopontina), LAMB3, MAPK1, e Jun na metástase da linha de células-SPC-A 1sci.

Previamente, tem sido relatado que as células mudam suas propriedades de adesão célula-célula, reorganizar a matriz extracelular (ECM) meio ambiente, e reorganizar os seus citoesqueleto para facilitar a migração e muito invasion.A de evidências indicaram que osteopontina facilitou a fixação de células à ECM através da ligação a várias tipos de integrinas (INTs), aumentou a expressão e a actividade da MMP-2, e promoveu o crescimento de tumores e metástases através da activação dos percursos de sobrevivência [9] – [13]. Laminina também promoveu a adesão celular e migração através da interacção com interrupções [14] – [16]. Aqui, foi verificado que abaixo de knock-osteopontina, LAMB3 ITGB1 e diminuiu as metástases da linha de células-SPC-A 1sci através de uma série de experiências in vitro e in vivo. Estas descobertas confirmaram que a osteopontina, LAMB3 e ITGB1 desempenharam papéis importantes na metástase de câncer de pulmão e oferecem pistas valiosas para o estudo do mecanismo de metastática do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

ética Declaração

Todos os protocolos experimentais em animais utilizados neste estudo foram aprovados pela Comissão animal Care Shanghai Medical Experimental em Shanghai Jiaotong University (ID aprovação ShCI-12-023).

Linhas Celulares

O pulmão linha de células adeno-carcinoma humano SPC-A-1 foi obtido a partir Instituto Cellular da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Esta linha celular foi originalmente isolada a partir dos espécimes cirúrgicos de um homem chinês com pulmão avançado adeno-carcinoma de Shanghai Chest Hospital e Instituto Cellular da Academia Chinesa de Ciências, em 1980 [17]. O humano de alta linhagem de células de câncer de pulmão metastático SPC-A-1sci foi estabelecida por Yao Ming (Shanghai Jiaotong University, Shanghai Cancer Institute) [8]. Ambas as linhas foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% (v /v) de soro fetal de bovino a 37? C, 5% de CO

2.

Limitando Isolamento Diluição monoclona

SPC-A -1sci células foram tripsinizadas e ressuspensas em DMEM a uma concentração de 100 células por ml, 10 dos quais 0,1 ml foram adicionados a cada poço de placas de 96 poços que já contêm 0,1 ml de meio DMEM FBS a 10%. Duas semanas mais tarde, cada poço foi observado sob um microscópio, e 20 estirpes de células monoclonais SPC-A-1sci foram seleccionados e propagados.

Análise de Dados Microarray

O ARN total de cada linha celular foi colhido usando reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total foi enviada para o Shanghai Biotechnology Co., Ltd (Xangai, China). O ARN total foi hibridizado para o U133 Affymetrix mais 2,0 matriz (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) e processados ​​de acordo com os protocolos Affymetrix técnicas. algoritmos estatísticos foram usados ​​na análise de dados de expressão GeneChip.

Bioinformática Análise

Gene Ontology (GO) análise.

GO análise foi aplicado para analisar as principais funções do genes diferencialmente expressos de acordo com Gene Ontology, a classificação funcional fundamental do NCBI. Geralmente, o teste exato de Fisher e χ

2 de teste foram usados ​​para classificar a categoria GO, e foi calculado a taxa de falso descoberta (FDR) para corrigir o

P

-valor, com um FDR menor correspondente a um menor erro no julgamento do

P

-valor. O FDR foi definido como, onde N

κrefers para o número de teste de Fisher

P

-Valores menos do que o χ

2 test

P

-Valores. Calculamos

P

-Valores para as classificações ir de cada gene diferencialmente expressos. Enriquecimento fornece uma medida da importância da função: como o enriquecimento aumenta, a função correspondente é mais específico, o que nos ajuda a identificar os GOs no experimento com mais descrições funcionais concretas. Dentro de cada categoria significativa, o enriquecimento de (Re) foi dada por:, em que n

f

é o número de genes diferenciais dentro da categoria particular,

N

é o número total de genes dentro da mesma categoria,

N

f

é o número de genes diferencialmente expressos em todo o microarray, e

N

é o número total de genes no microarray [18] – [21].

Go-mapa.

The Go-map, uma rede de interação dos GOs significativas dos genes diferencialmente expressos, foi construído de acordo com as classificações Gene Ontologia para identificar interações entre os GOs significativas diretamente e sistemicamente. O mapa potencialmente resume as interacções funcionais dos genes diferencialmente expressos sob condições de doença [22] – [24]

Pathway Analysis

De modo semelhante, a análise via foi usado para determinar as vias de significativas.. os genes diferencialmente expressos de acordo com KEGG, Biocarta e Reatome. Mais uma vez, utilizamos o teste exato de Fisher e χ

2 de teste para selecionar as vias significativas, eo limiar de significância foi definido pela

P

-valor e FDR. O enriquecimento foi calculada de acordo com a equação acima descrito [19], [21].

Caminho-Net.

A Caminho-Net foi construído para identificar directamente e sistemicamente interações entre as vias significativas dos genes expressos diferencialmente de acordo com as interacções entre a base de dados de percursos KEGG. É fornecido um resumo das interações via dos genes diferencialmente expressos sob condições de doença e assistida para determinar por que um determinado percurso foi activado [23].

Signal-flow

estímulo celular externa afeta celular comportamento e se reflete na interação de proteínas e expressão gênica cinética. Nós, portanto, inferir uma rede de transcrição dinâmico, calculado de acordo com a expressão dobra de genes e suas interações nas vias. As relações dos dados de expressão de genes foram inferidas usando uma rede tempo contínuo recorrente neural (CTRNN) como um modelo dinâmico abstrato para a rede de transcrição mediando a decisão celular para migrar em cima de um estímulo externo. O modelo descreve a influência mútua dos genes e sua resposta estímulo como elementos dinâmicos, independentemente de como tal interação ou estimulação é realizado em termos biológicos concretos. O modelo CTRNN é geralmente descrito como, onde denota o tempo constante, denota a entrada externa,

denota o peso do gene

j

no gene

i

, indica o desvio gene

j

, denota função de ativação sigmóide, e denota o gene

i

valor da expressão no

t

tempo ponto. Usando este algoritmo genético, estimamos os parâmetros do modelo [25]

Transfection siRNA

oligonucleotídeos siRNA com as sequências seguintes foram sintetizados por empresa (Jima, Xangai, China). Controle negativo siRNA, sentido : 5′-GAA UUC UCC CGU GUC Utt ACG-3 ‘e anti-sentido: 5′-ACG CAC GUU UGA CGG AGA ATT-3′; osteopontina siRNA, sentido: 5’-CCA UUC AUC UGA UGA UGA L-3 ‘e anti-sentido: 5′-AAG UAC UUC AUC agosto AGA G-3′; LAMB3 siRNA, sentido: 5’-CCA UUC UGA UGA UGA AUC U-3 ‘e antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA agosto G-3′; ITGB1 siRNA, sentido: 5’-CCA UUC UGA UGA UGA AUC U-3 ‘e antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA agosto G-3’. Entrega de siRNAs foi conseguida utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Burlington, ON) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 3 × 10

5 células /poço foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas durante a noite para atingir 50-70% de confluência, em seguida, lavada com DMEM sem soro e antibióticos. Reagente Lipofectamine 2000 e siARN foram misturados e adicionados às células a concentrações finais de 5 uL /​​poço e 2,5 ug /poço, respectivamente, seguido de incubação a 37 ° C durante 48 h.

Preparação de extractos de proteína

Proteínas a partir das linhas celulares SPC-a-1sci cultivadas que receberam tratamentos de siRNA foram colhidas e reunidas a partir de 10 poços de duas placas de 6 poços. Todos os procedimentos de extracção de proteína foram realizados em gelo. Resumidamente, as células foram lavadas com PBS frio, rasparam pelo raspador de células, em seguida, transferido para tubos de 1,5 mL e foram lisadas com 200 ul de tampão de lise arrefecido com gelo por tubo. Depois de 40 min de incubação em gelo, os homogenatos foram centrifugados a 12000 g durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugation.All extractos proteicos foram armazenadas a -20 ° C.

Análise Western Blot

Usando a proteína total isolado acima. SDS-PAGE (12%) Os géis foram corridos e subsequentemente transferidos para membranas de nitrocelulose a 4? C. As membranas foram bloqueadas em PBS contendo 5% de leite, durante 2 horas, seguido pela adição de anticorpos primários contra a osteopontina (1:400), ITGB1 (1:500), LAMB3 (1:500), e β-actina (1: 15000) Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados à temperatura ambiente durante 1,5 horas. As membranas foram então lavadas com PBST (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, 0,05% de Tween-20), e as proteínas específicas foram detectadas utilizando o sistema de HRP.

quantitativa em tempo real A análise de PCR

o RNA total das linhas celulares SPC-a-1sci cultivadas que receberam tratamentos de ARNip foi colhido usando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando reagentes de transcrição reversa (Takara) e seguindo as instruções do fabricante. a análise por PCR em tempo real foi realizada em um sistema em tempo real 7300 PCR com SDS software de estudo RQ (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. modelos de ADNc foram combinadas com SYBR Verde pré-mistura contendo Rox (Takara) para realizar as reacções de PCR quantitativo. Os iniciadores utilizados para PCR quantitativo foram como se segue: A osteopontina para a frente: 5′-GACAGCCAGGACTCCATT-3 ‘; osteopontina reversa: 5’-GATGTCAGGTCTGCGAAA -3 ‘; LAMB3 frente: 5’-AGGCAAGAACTGTGAGCG-3 ‘; LAMB3 reversa: 5’-GGGTTGGCGTAGGTGAGT-3 ‘; ITGB1 frente: 5’-AATGTAACCAACCGTAGC-3 ‘; ITGB1 reversa: 5’-CAGGTCCATAAGGTAGTAGA-3 ‘; p-actina para a frente: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘; p-actina reverso: 5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ‘. A expressão de genes foi normalizada para p-actina. Todas as reacções foram realizadas em triplicado.

ferida-scratch Cura Ensaio

O ensaio zero-se a cura foi realizada com ligeira modificação do descrito anteriormente [26]. As células foram cultivadas a cerca de 90% de confluência em placas de 24 poços, em seguida, em jejum em meio de soro baixo (1% de FBS em DMEM) durante a noite. Um zero linear na monocamada de células foi feita utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL para simular uma ferida. As células foram lavadas com PBS e cultivadas com 1% de FBS em DMEM durante mais 24 h. Três imagens por poço foram então recolhidas a partir de campos aleatórios utilizando um microscópio CKX41 (Olympus, Japão). A porcentagem de área ferido que foi preenchido foi calculado da seguinte forma: {(média amplitude feridos – média amplitude restantes) /média amplitude feridos} x 100 (%)

migração e invasão Ensaios

. Os ensaios de migração e invasão celular foram realizadas utilizando 6,5 mm câmaras trans-poços (tamanho de poro 8 pm, Corning), como descrito anteriormente, com algumas modificações [27]. As células foram semeadas a 100000 células por poço em câmaras de trans-poços e Matrigel-revestidas câmaras trans-poços para ensaios de migração e invasão. Os poços foram lavados com PBS, depois de 24 h para ambos os ensaios. As células que tinham migrado e invadido para o lado basal da membrana foram fixadas e coradas com H E ou violeta de cristal, visualizadas e fotografadas com um microscópio CKX41 a 400 x de ampliação e um sistema DP20 tratamento de imagens (Olympus, Japão). Foram obtidas imagens de três campos aleatórios de três cavidades replicadas, e o número de células que tinham migrado e invadiu foi contado.

Experimentos shRNA

O vector shRNA lenti-viral foi construído como descrito anteriormente [28]. Resumidamente, controle negativo, osteopontina, LAMB3 e ITGB1 shRNA foram subclonados no

Mlu

I /

Cla

locais I do vector pLVTHM (Addgene), utilizando os seguintes oligonucleótidos: 5′-CGCGTCGTAGCGACTAAACACATCAATTttc aagagaAATTGATGTGTTTAGTCGCTATTTTTTGGAAT -3 ‘e 5′-CGATTCCAAAAAATAGCGACTAAACACATCAATTtctcttgaaAATTGATGTGTTTAGTCGCTACGA-3′ para o controlo negativo, 5’-CGTCGGCCATGACCACATGGACGATTTT

CAAGAG

AAATCGTCCATGTGGTCATGGCTTTTTTGGAAT-3 ‘e 5’-CGATTCCAAAAAAGCCATGACCACATGGACGATTT

CTCTTG

AAAATCGTCCATGTGGTCATGGCCGA-3′ para a osteopontina, 5′- CGCGTCGCCCGGATCCTAGATGCAAAGA

TTCAAGAGA

TCTTTGCATCTAGGATCCGGGTTTTTTGGAAT-3 ‘e 5’CGATTCCAAAAAACCCGGATCCTAGATGCAAAGA

TCTCTTGAA

TCTTTGCATCTAGGATCCGGGCGA-3′ para LAMB3 e 5′-CGCGTCGGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT

TCAAGAG

ATGAAACTTCGGATCTGTACACTTTTTTGGAAT-3 ‘e 5’- CGATTCCAAAAAAGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT

CTCTTGA

ATGAAACTTCGGATCTGTACACCGA -3 ‘para ITGB1. geração lenti-vírus e infecção de células SPC-A-1sci foram realizadas como descrito acima.

Experimentação Animal

cinco a ratinhos nus machos de seis semanas de idade foram mantidos sob pathogen- específica (SPF) condições. Os ratos foram manipulados e alojados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão Animal Care Medical Experimental Xangai. Para analisar as capacidades metastáticas in vivo das células SPC-A-1sci com osteopontina bateu-out, β3 laminina ou β1 Integrina, 2,0 × 10

células 6 SPC-A-1sci foram injectados na veia da cauda de ratinhos nus. Dez semanas mais tarde, todos os ratinhos foram sacrificados e os pulmões foram removidos e processados ​​para estudos histológicos padronizados de fixação em formalina a 10%. As amostras fixadas foram embebidos em parafina, e três secções em série não sequenciais foram obtidos por animal. Os cortes foram corados com H . E e analisadas para a presença de metástases

Tecidos NSCLC Humanos

As amostras dos pacientes neste estudo foram obtidos após consentimento informado, de acordo com um protocolo estabelecido aprovado pela Comissão de ética da Shanghai Jiao Tong University School. Os dados não contém nenhuma informação que pode levar à identificação dos pacientes. pares correspondentes (n = 135) de tecidos de cancro do pulmão e tecidos cancerosos adjacentes foram utilizados para a construção de uma micromatriz de tecido (Xangai Biochip Co., Ltd. Xangai, China), tal como descrito anteriormente (34). coloração imuno-histoquímica foi realizada para detectar a expressão de osteopontina, LAMB3 e ITGB1 nos tecidos de cancro do pulmão e combinados tecidos não cancerosos. Os anticorpos primários contra a osteopontina, LAMB3, e ITGB1 foram obtidos a partir de Sigma (1:250), Santa Cruz (01:50), e Abgent (01:50). Pontuação foi medido pela percentagem de células positivas com as seguintes intensidades de coloração: menos de 5% teve “0”; 5-24% marcou “1”; 25-49% marcou “2”; 50-74% marcou “3”; e mais do que 74% teve “4”.

Análise estatística

Os resultados são apresentados como a média ± DP. Comparações de dados quantitativos foram analisados ​​pelo

t-

teste de Student entre dois grupos (de duas caudas;

P Art 0,05 foi considerado significativo). O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar as variáveis ​​qualitativas. As análises foram realizadas com o SAS 9.0 para Windows.

Resultados

diferentes cepas do-SPC-A 1sci Linha do Display célula diferente metastático Potenciais

Em nosso trabalho anterior, altamente a linha celular de cancro do pulmão metastático (chamado SPC-a-1sci) foi estabelecida a partir da linha celular de cancro do pulmão humano metastático mal SPC-a-1 por meio de três ciclos de selecção in vivo. O potencial metastático significativamente mais elevada do-SPC-A 1sci linha celular em relação à linha SPC-A-1 tem sido comprovada por uma série de experiências in vivo e in vitro. Para explorar as causas do elevado potencial metastático da linha celular SPC-A-1sci, obteve-se ainda mais as linhagens celulares monoclonais SPC-A-1sci H e SPC-A-1sci M a partir das células-SPC-A 1sci eo SPC monoclonal estirpe celular -A-1D a partir da linha celular de SPC-a-1, limitando ensaio clonal de diluição, tal como descrito anteriormente, com ligeiras modificações (Figura 1A).

(a) Morfologia de cinco linhagens de células monoclonais seleccionados a partir de RCM-a-1sci e linhas celulares de SPC-a-1 pelo ensaio de diluição limitante. As células parentais SPC-a-1sci e SPC-A-1sci H e celulares SPC-A-1sci M estirpes toda a forma exibem rodada. (B) atividades motilidade do SPC-A1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 e células SPC-A1 L foram determinadas por ensaios de cura zero-ferida. (C) ensaios de invasão do SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 e células L SPC-A1 (400 × ampliação). (D) os ensaios de migração de SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 e células SPC-A1l (400 × ampliação). Três experimentos independentes foram realizados; os resultados são expressos como a média + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P . 0.001

Para explorar o potencial metastático de SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM e SPC-A-1D , cicatrização de feridas-zero (Figura 1B) e os ensaios de migração e invasão foram realizados (Figura 1C, D). Os resultados mostraram que as três estirpes de células monoclonais apresentados marcadamente diferentes potenciais metastáticos; SPC-A-H 1sci teve um potencial metastático semelhante a de SPC-A-1sci, SPC-A- G tinha uma potencial metastático semelhante ao SPC-A-1 e A-SPC-1sciM teve um potencial metastático intermediário.

As análises de bioinformática de linhagens celulares monoclonais com alta, média e baixa metastático Potenciais

primeiro, identificamos genes diferencialmente expressos em pelo menos duas vezes no SPC-a-1sciH, as células SPC-a-1sciM respectivamente, em comparação para células SPC-a-1D. Verificou-se que um total de 4534 genes foram diferencialmente expressos como a intersecção de SPC-A-1sciH vs SPC-A-1L e SPC-A-1sciM vs SPC-A-1L. Destes genes, 2277 genes foram regulados positivamente e 2257 genes foram reprimidos.

Para identificar mais precisamente os genes chave relacionados com a metástase do câncer de pulmão, análise bioinformática foi aplicado para analisar as diferenças funcionais e de trajetória entre SPC-A- 1sciM vs SPC-A-1L e SPC-A-1sciH vs SPC-A-1D, respectivamente (Figuras S1, S2). Os resultados apresentados no mapa Go-revelado as interacções e atribuições para as funções importantes dos genes diferencialmente expressos. Com um limiar

P

-valor 0,0001, a partir da análise funcional dos genes regulados diferencialmente expressos, descobrimos que funções significativas foram associados principalmente com a montagem hemidesmossoma, regulação positiva de diferenciação dos eritrócitos, a organização da vesícula, synaptogenesis, microtúbulos e citoesqueleto organização e regulação, paragem do ciclo celular e regulação, adesão celular e endocitose, a transcrição do DNA, a inactivação da actividade MAPK, desfosforilação aminoácido proteínas e transporte de proteína intracelular. A proliferação celular, a diferenciação e a apoptose também foram influenciados, acompanhada por funções de resposta imune e inflamação correspondente. Ao mesmo tempo, a maioria dos genes expressos diferencialmente regulados de deslocamento tinham funções em termos de proliferação celular, incluindo: a replicação do ADN e regulação durante a mitose, a organização do fuso, a duplicação do centrossoma e checkpoint do ciclo celular, de nucleótidos e a regulação negativa da proliferação de células epiteliais, bem como resposta ao estímulo danos ao DNA através de reparo do DNA e recombinação, montagem ou desmontagem da cromatina, carboidratos, o metabolismo lipídico e de aminoácidos e outros

.

a partir da análise de caminho e caminho-Net, chegamos à conclusão de que o up -regulated genes participam principalmente na via de sinalização MAPK, via de sinalização Wnt, via de sinalização de JAK-STAT, via de sinalização de TGF-beta, e de adesão da célula. genes identificados também influenciam a capacidade da célula para alterar a sua polaridade e citoesqueleto e estão envolvidos na ocorrência, a migração e o metabolismo de tumores. Enquanto isso, os genes regulados por baixo participou principalmente na reparação de emparelhamentos incorrectos e recombinação homóloga ou foram associados com a de PPAR, o TGF-beta, e as vias de sinalização de p53, as interacções do receptor de ECM e numerosas vias metabólicas (limiar

P

-valor . 0,001) (Figuras S3, S4)

de acordo com as vias significativas acima identificados, e as interacções dos genes expressos diferencialmente envolvidos nas vias (de acordo com a base de dados KEGG), um modelo de fluxo foi de sinal- construído. Uma rede de regulação quantitativa, é calculada por uma rede neural utilizando as intensidades de sinal dos genes diferencialmente expressos. Determinada a partir da diferença de peso entre os 2 genes e os genes que cada gene é ligado com, o status de SPP1, LAMB3, MAPK1 e Jun como reguladores chave foi demonstrado (Figura 2). Os níveis de osteopontina, LAMB3, e ITGB1 expressão foram medidos por qRT-PCR, e os resultados foram concordantes com os perfis de expressão de gene. Os níveis de expressão de osteopontina, LAMB3, e ITGB1 eram mais elevados nas linhas de células SPC-A-H e 1sci SPC-A-M 1sci do que na linha celular de SPC-A-1? L (Figura S5).

modelo Signal-flow da união expressão diferencial de genes. O ponto representa o gene e a direcção da linha representa a direcção da regulação. O número na linha é o peso regulamento: quanto maior o peso, mais espessa da linha e mais forte a capacidade reguladora. A forma alvo de seta da linha representa o modo de regulação de ativação.

Células-SPC-A 1sci transfectadas com ARNi contra osteopontina, LAMB3 e ITGB1 Mostrar migração de baixo e Invasão In Vitro

Para explorar os papéis de osteopontina, LAMB3 e ITGB1 na metástase do câncer de pulmão, células transfectadas SPC-a-1sci com siRNA-osteopontina, siRNA-LAMB3 ou siRNA-ITGB1 e realizou ensaios de migração e invasão. RT-PCR e análise por Western blot demonstrou eficaz knock-down de osteopontina, LAMB3, e ITGB1 nas células-SPC-A 1sci (Figura 3A, B). células-SPC-A 1sci transfectadas com ARNsi-osteopontina, siARN-LAMB3 ou siRNA-ITGB1 exibida capacidades migração e invasão significativamente inferiores quando comparado com a linha celular parental SPC-A-1 sci (Figura 3C e D). Em seguida, mRNA osteopontina e os níveis de expressão de proteína foram medidos em SPC-A-1sci que transfectadas com siRNA contra LAMB3 e ITGB1, os resultados mostraram knock-down de LAMB3 e ITGB1 níveis de expressão não teve influência na expressão da proteína OPN. LAMB3 ITGB1 e teve os mesmos resultados (Figuras S6A, B). Para determinar a relação entre a osteopontina, LAMB3 e ITGB1, nós transfectadas células SPC-A-1sci com ARNsi-osteopontina + siRNA-LAMB3, siARN-osteopontina + siRNA-ITGB1, siARN-ITGB1 + siRNA-LAMB3 e siRNA-osteopontina + siRNA-LAMB3 + siRNA-ITGB1, a capacidade de migração e invasão de estas células co-transfectadas com dois ou mais siARN significativamente foram reduzidos em comparação com a capacidade de invasão e migração das células co-transfectadas com um ARNsi ((Figuras S6 C, D, e). os resultados indicam um papel trans-regulação de osteopontina, LAMB3 ITGB1 e na metástase do cancro de pulmão.

(a) RT-PCR foi realizado e mostrou eficaz knock-down de expressão mediada por siARN-osteopontina, siARN-LAMB3 e siRNA-ITGB1. (B) Western blot mostrou diminuição da expressão de osteopontina, LAMB3 e ITGB1. (C e D) Migração e ensaios de invasão de SPC-A-1sci, SPC-A1sci /siRNA-osteopontina,-SPC-A 1sci /. siRNA-LAMB3 e SPC-A1sci /siRNA-ITGB1 (400 × ampliação) três experiências independentes foram realizados; os resultados são expressos como a média + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P . 0.001

Knock-down de osteopontina, LAMB3 e ITGB1 Em SPC-a-1sci células resultou em baixa potencial metastático Em vivo

para desvendar ainda se osteopontina, LAMB3 e ITGB1 estão envolvidos na metástase de câncer de pulmão in vivo, de 4 a ratinhos nus femininos de 6 semanas de idade foram randomnly divididos em 4 grupos e receberam injeção na veia da cauda de 2 × 10

células 6 SPC-a-1sci transfectadas com o controle shRNA-negativos, shRNA-osteopontina, shRNA-LAMB3 ou shRNA-ITGB1. Dez semanas depois, os pulmões foram coletadas para análise imuno-histoquímica (Figura 4)

Imagens representativas histológicos de pulmão de rato inspecionados quanto à presença de lesões microscópicas (20 ×, superior; 400 ×, inferiores). Dez semanas após Cauda veia injeções com células-SPC-a 1sci expressando estavelmente shRNA contra o controle negativo (shRNA-NC, deixou 1), osteopontina (shRNA-osteopontina; deixou 2), β3 laminina (shRNA-LAMB3, certo 2), e β1 integrinas ( shRNA-ITGB1, à direita 1).

Contamos também os ratos com metástases de câncer de pulmão e nódulos metastáticos em cada grupo. Como apresentado na Tabela 1, alguns metástases nodais pulmonares foram detectados nos ratinhos injectados com células-SPC-A 1sci transfectadas com shRNA-osteopontina, shRNA-LAMB3 ou shRNA-ITGB1. Em contraste, as metástases pulmonares eram aparentes em ratinhos injectados com células de controlo negativo. Portanto, é evidente que a osteopontina, LAMB3 e ITGB1 desempenham papéis importantes no processo metastático da linha de células de câncer de pulmão SPC-A-1sci.

osteopontina LAMB3 e Expressão ITGB1 Níveis em Lung Cancer Are associados com estádio clínico avançado, grau histológico e Linfonodo Metástase

Para validar os efeitos da osteopontina, LAMB3 e ITGB1 expressão no câncer de pulmão, em comparação seus níveis de expressão em tecidos de câncer de pulmão humano (n = 135) e combinando tecidos normais adjacentes por meio de imuno-histoquímica (IHC) coloração.