Abstract

O bortezomib /PS-341 /Velcade, um inibidor do proteassoma, é amplamente utilizado no tratamento de mieloma múltiplo. Enquanto vários mecanismos da citotoxicidade do fármaco foram propostos, o mecanismo real permanece elusiva. Nós teve como objetivo identificar genes que afetam a citotoxicidade de bortezomib na levedura de fissão

S.pombe

como a droga inibe ciclo de divisão celular deste organismo, como mutantes de proteassoma. Entre os 2815 genes selecionados (que abrangem 56% das ORFs total), 19 genes, cujas exclusões induzir forte letalidade sintética com bortezomib, foram identificados. Os produtos dos 19 genes incluiu quatro enzimas de ubiquitina e proteassoma um fator nuclear, e 13 deles são conservados em seres humanos. Nossos resultados vão fornecer informações úteis para a compreensão das ações de bortezomib dentro das células

Citation:. Takeda K, Mori A, Yanagida M (2011) Identificação de genes que afetam a toxicidade do Anti-Cancer da droga bortezomib pela Genome-Wide triagem em

S.

pombe. PLoS ONE 6 (7): e22021. doi: 10.1371 /journal.pone.0022021

Autor: Michael Polymenis, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de março de 2011; Aceito: 12 de junho de 2011; Publicação: 08 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Takeda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. KT foi apoiado financeiramente pela bolsa de pesquisa de Astellas Fundação para a investigação sobre doenças metabólicas (https://www.astellas.com/jp/byoutai/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a via da ubiquitina /proteassoma é um importante maquinaria proteolitica em células e tem um papel central no ciclo de divisão celular, apoptose, etc. [1]. Por conseguinte, esta via é considerada como um forte alvo potencial para o tratamento clínico de doenças tais como o cancro, e os produtos químicos que modulam a actividade da via da ubiquitina /proteassoma têm sido intensivamente investigados [2], [3]. Bortezomib /PS-341 /Velcade é um ácido borónico de péptido que inibe a actividade de tipo quimotripsina da subunidade beta 5 do proteassoma

In vitro

. Bortezomib tem fortes efeitos potenciais anti-tumorais em

in vitro e estudos com animais,

e foi desenvolvido como uma droga anti-cancro para o tratamento de mieloma múltiplo e outros cancros [3], [4]. A inibição do proteassoma provoca efeitos pleiotrópicos. Portanto, vários mecanismos para a citotoxicidade do bortezomib têm sido sugeridos, como a inibição das proteínas anti-apoptóticas, estabilização de p53, perturbação da progressão do ciclo celular, etc. [5]. Para aumentar o conhecimento dos mecanismos dos efeitos anti-tumorais e efeitos adversos do bortezomib, será benéfico para identificar genes que envolvem na citotoxicidade da droga. Um esforço pioneiro para identificar esses genes foi relatada por grupo Lightcap em 2010 [6].

A levedura

Schizosaccharomyces pombe

é um eucariota unicelular simples e tem sido usado como um organismo modelo de base biologia celular, devido à sua tratabilidade genética e a sua semelhança com a eucariotas superiores. Uma biblioteca de 2815 cepas eliminada do gene está disponível para estudos genômicos de sensibilidade às drogas [7], [8], [9].

Aqui, tentamos identificar genes evolutivamente conservadas que afetam a citotoxicidade de bortezomib tirando partido da biblioteca de genes-supressão em

S. pombe

e estabeleceu um método para realizar a triagem letal sintética do genoma com bortezomib. Entre os 2815 genes selecionados, estirpes de deleção de 19 genes teve forte letalidade sintética com bortezomib (tais genes foram a seguir designada tão letal sintético com bortezomib; SLB). Dos 19 genes SLB, 13 são conservados a partir de levedura para a saúde humana e incluem fatores envolvidos na proteólise ubiquitina /proteassoma dependente, silenciamento da cromatina, transporte nuclear /citoplasmático, aminoácidos e metabolismo da vitamina, o tráfico vesicular, metabolismo de RNA, etc.

resultados

paragem da mitose e fracasso na segregação cromossômica induzida por bortezomibe

Nós descobrimos que o bortezomib (LC Laboratories) proliferação efetivamente inibiu de

S. pombe

, enquanto MG132, um inibidor de proteassoma autêntica em células de mamíferos não inibir a proliferação (Figura S1). Em seguida, examinou o nível de proteínas ubiquitinadas-poli na presença ou ausência de bortezomib (Figura S1). culturas em fase logarítmica foram recolhidas a 0, 4, e 9 horas após a adição de 1 mM e bortezomib proteínas totais foram extraídas para análise de imunotransf erência. Na presença de bortezomib, proteínas ubiquitinadas-poli acumulada de um modo dependente do tempo. Portanto, concluímos que bortezomib efetivamente inibe a proliferação celular e a actividade proteolítica do proteassoma em

S.

pombe.

mutantes sensíveis à temperatura de componentes do proteassoma (

mts3-1 Compra de Rpn12 de 19S partícula regulamentar e

mts2-1 Compra de Rpt2 de 19S partícula reguladora ) são presos na fase M, devido à inibição da degradação dos reguladores mitóticas como CDC13 (ciclina) [10], [11]. Esta descoberta levou-nos a examinar em detalhe como bortezomib afeta o ciclo celular. Após a adição de bortezomib culturas para meio em fase logarítmica, as concentrações de células e a viabilidade foram medidos ao longo do tempo (Figura 1A). A proliferação celular, eventualmente cessou e a viabilidade diminuiu de 21, 10, e 4,7% a 4, 6 e 9 horas após a adição de bortezomib. Sem bortezomib, as células continuaram a dividir-se e sustentada viabilidade. Para examinar como o ciclo celular foi afetada pelo bortezomib, DNA cromatina, os microtúbulos, e os corpos polares de fusos (SPB: homóloga a centrossoma) foram visualizados por marcação proteína fluorescente verde ou vermelho para histona H2A (por cromatina), alfa-tubulina (microtúbulos) e proteína Sid4 (SPB, o centrossoma levedura equivalente, como um ponto na Figura 1C), respectivamente. A proporção de células com cromossomas sobre condensado e fusos em metafase foi mais elevada (30%) em 1 hora após a adição e, subsequentemente, bortezomib diminuiu (Figura 1B e 1C-A). À medida que a proporção de células em metafase diminuiu, a proporção de células com um núcleo deslocado aumentada (Figura 1C-b), em que cromatídeos irmãos não foram separadas e o núcleo foi deslocado do centro. À medida que a proporção de «núcleos deslocadas ‘foi mais elevada a 4 h e diminuição das células e as células subsequentemente, anucleadas com um núcleo gigante aumentada (Figura 1B e C-C). Este era provavelmente o resultado da conclusão citocinese em células com um núcleo deslocado. Assim, na presença de bortezomib, as células foram brevemente preso na metáfase, incapaz de separar-irmãs cromatídeos, e a viabilidade foi perdida. Estes fenótipos induzidas pelo bortezomib são virtualmente idênticos aos mitótica defeitos causados ​​por

mts2-1

, a mutação sensível à temperatura em Rpt2 subunidade 19S de partícula [10]. No caso de

mts3-1

mutação (Rpn12 de 19S), fenótipo prisão metaphase é mais grave; 75% de células são rapidamente preso na metafase [11]. Em ambos os casos, a detenção metáfase é temporal e o núcleo é deslocada subsequentemente, tal como mostrado no caso do tratamento com bortezomib. Dado que o defeito na transição /anafase metáfase é devido à inibição da proteólise, substratos ubiquitinados do proteassoma, tais como CDC13 (ciclina) deve acumular [12]. Para examinar esta, células que ectopicamente expressas de hexa-histidina (His6) tagged ubiquitina foram preparadas e cultivadas na presença ou ausência de bortezomib durante 4 h a 26 ° C. As proteínas foram então extraídas a partir de ambas as culturas sob condições de desnaturação com 6M guanidina-HCl e os extractos resultantes foram aplicados a pérolas TALON (Clontech), que absorvem a etiqueta His6, para purificar as proteínas ubiquitinadas. proteínas Purificou-Talon foram analisados ​​por imunotransf erência usando um anticorpo contra CDC13 (Figura 1D). Na presença de bortezomib, multi-ubiquitinada CDC13 foi observada, como relatado em mutantes sensíveis à temperatura do proteassoma [12]. Estes resultados demonstraram que um inibidor químico para o proteassoma podem ser utilizados para substituir os mutantes TS de proteassoma. Este fármaco pode ser útil para analisar os fenótipos de proteassoma de defeitos a uma temperatura baixa, por exemplo, na meiose ou nas experiências em que as respostas de choque de calor devem ser evitados. Por isso, adotamos bortezomib para posterior triagem genética para identificar os genes que afetam o fenótipo disfunção proteossómica.

(A) bortezomib (1 mM) inibiu a proliferação celular. As concentrações de células e viabilidades são apresentados. BZ: bortezomib (B) bortezomib (1 mM) inibiu a progressão normal da fase M. O gráfico indica a proporção de células com fusos metafásicas e over-condensados ​​cromossomos (azul, células mostrado na Figura 1C-

a

), as células com um núcleo deslocadas (vermelho, Figura 1C-

b

), as células sem núcleo e com um núcleo gigante (laranja, Figura 1C-

c

), e as células com cromossomo rasgada pelo septo (verde, Figura 1C-

d

e

e

). (C) Os cromossomas, microtúbulos, e SPB foram observadas na presença de bortezomib. As células que apresentam anormalidades mitóticas correspondente à Figura 2B são apresentados na A-E (painel superior: + BZ). Imagens de progressão normal da divisão celular são mostradas no painel inferior (Bz). Barra = 10 uM ciclina (D) poli-ubiquitinada /CDC13 acumulada na presença de bortezomib. Veja o texto para mais detalhes.

mutantes relacionados-proteassoma hipersensibilidade ao bortezomib

Antes da triagem abrangente, examinamos como a citotoxicidade bortezomib é afetado por mutações relacionadas com a ubiquitina /proteassoma sistema. Em comparação com o tipo selvagem foram cinco mutantes relacionados proteassoma da seguinte forma:

mts2-1

,

mts3-1

,

pts1-727

(mutado na beta 5 subunidade 20S complexo [13]),

ump1-620

(mutação no fator 20S maturação Ump1 [13]), e

Δcut8

(mutante gene-apagamento de

cut8

+

necessário para a correcta localização nuclear do proteassoma [14], [15]). Cada estirpe foi incubada numa placa de agar rico SIM para formar uma colónia e em seguida, manchado em placas de agar contendo 0, 100, 250, ou 500 uM bortezomib, assistido por um sistema de robô (rotor, Cantor, Reino Unido). Após 3 dias de incubação a 26 ° C, avaliou-se a capacidade de formação de colónias de cada mancha (Figura 2A e B). O tipo selvagem colônias em todas as placas formadas, enquanto que mutantes relacionados com o proteassoma eram defeituosos na colónia-formação em placas bortezomib (

Δcut8

a 100? M e outros em 500 mm). A hipersensibilidade clara de

Δcut8

para Bortezomib nos levou a adotar o método descrito acima para o rastreio ainda mais todo o genoma de mutantes letais sintéticos com bortezomib.

(A) Estratégia para o rastreio letal sintética ( B) os mutantes de componentes da via da ubiquitina /proteassoma hipersensibilidade ao bortezomib. Oito colónias de cada estirpe foram em placas de agar com várias concentrações do bortezomib banhado a réplica e foram incubadas durante 3 dias a 26 ° C. (C) Resumo de triagem letal sintético com bortezomib. Veja o texto para mais detalhes. (D) Validação de mutantes isoladas que tiveram defeitos de crescimento em 100 M bortezomib através da identificação de cinco diluições em série de células em crescimento vegetativo.

Genome-wide screening sintético letal com bortezomib

Para identificar os genes que afetam a citotoxicidade de bortezomib no

S. pombe

, nós analisamos 2815 mutantes gene-exclusão para a inibição do crescimento sintético em placas de agar SIM com bortezomib usando assistida por robô plaqueamento de réplicas. A partir do rastreio primário, 59, 62, e 135 amostras foram isoladas que tiveram defeitos de crescimento em meios com 100, 250 e 500 mm bortezomib, respectivamente. Não houve mutante resistente ao bortezomib clara que cresceu mais rápido do que a estirpe do tipo selvagem em 500 meio? M bortezomib. Um resumo da análise é mostrado na Figura 2C (exemplos de matérias-resultados da despistagem primária e a lista de genes são mostrados na Figura Tabela S2 e S1). As 59 estirpes que tinham defeitos de crescimento com 100 uM foram novamente testados bortezomib através da identificação de cinco diluições em série de culturas em fase logarítmica de cada estirpe (a partir de 10 células a 6250 células) em placas de SIM com e sem bortezomib (Figura 2D). Realizamos estes novos testes em duplicado. Como resultado, 19 mutantes gene-apagamento mostrou reprodutível defeitos de crescimento em placas SIM com 100 M bortezomib. Dezessete e 12 amostras apresentaram defeitos de crescimento, com 250 e 500? M bortezomib, respectivamente. O resto dos mutantes não apresentaram defeitos de crescimento claras com bortezomib no teste de mancha. Nenhum dos mutantes testados em doses mais baixas (1 nM-10? M) de bortezomib mostrou defeitos de crescimento significativas (Figura S3). Por isso, adotamos uma concentração de 100 mM de bortezomib para o rastreio de hipersensibilidade de

S.pombe

mutantes em nosso presente estudo, embora no estudo anterior e similar em células humanas, uma concentração de 4 a 7 nM de bortezomib era utilizados para o rastreio [6]

os 19 genes que mostraram defeitos de crescimento claras em 100 placas? M bortezomib no teste de manchas foram categorizados de acordo com a função:. cinco pertenciam a via da ubiquitina /proteassoma, quatro a proteínas /cromatina nuclear e transporte nuclear, três para o tráfego vesicular, três ao aminoácido e vitaminas metabolismo, três ao metabolismo de ARN, e proteína quinase a (Tabela 1). A Tabela 1 lista os nomes sistemáticos, nomes primários (se aplicável), brotação de levedura

Saccharomyces cerevisiae Comprar e orthologs humanos, e uma breve descrição de cada gene SLB. Entre os 19 genes SLB, 13 genes são relatados para ter potenciais orthologs em seres humanos.

Discussão

No presente estudo, demonstramos que bortezomib, um inibidor do proteassoma amplamente utilizado como um fármaco anti-cancro, efectivamente inibe a proliferação de

S.pombe

e induz a paragem da mitose bem como mutações sensíveis à temperatura das subunidades do proteossomo. Dezanove dos genes mutantes de eliminação foram identificados pelo rastreio do genoma a ser sintético letal com bortezomib.

Apesar do forte efeito de bortezomib para prender o ciclo celular, outros inibidores de proteassoma, MG132, tinha efeitos inibitórios mais fracos sobre a proliferação em o presente estudo. MG132 é, no entanto, relatada para inibir a proteólise dependente de protesome no lisado celular de

S.pombe

, indicando que o proteassoma de

S.pombe

é sensível a este inibidor [16]. Em

S. cerevisiae

, MG132 é usado para inibir a proteólise

in vivo

sob a deleção do gene da PDR5, a maior bomba de efluxo de drogas, o que pode eficazmente excretar MG132 da célula [17].

S.pombe

possui dois orthologs PDR5, Pdr1 e Bfr1. A diferença nos efeitos do bortezomib e MG132 pode ser devido às suas diferenças na permeabilidade celular ou a eficácia de excreção por bombas de efluxo. Bortezomib pode servir como uma ferramenta útil para o estudo da via da ubiquitina /proteassoma no

S.pombe

.

Realizamos a tela sintética letal para identificar genes que afetam a sensibilidade para o bortezomib, usando o 2815 mutantes gene-apagamento de

S.

pombe. Dezanove mutantes de eliminação foram identificados com defeitos de crescimento graves induzidos por 100 uM bortezomib (listados na Tabela 1 e Figura 3). Cinco dos genes responsáveis ​​(designada SLB) foram ubiquitina /proteassoma-relacionados: pof3, cul3, mug30, ubp16 e cut8. Sua letalidade sintética com bortezomib pode ser explicada através de uma acção inibitória da droga contra o proteassoma. Por exemplo, ubiquitina ligases proporcionam os substratos para proteassoma de modo que a diminuição tanto pode causar efeitos graves sintéticos. Outros não têm sido relatados para ser relacionada com a função de proteassoma. No entanto, alguns dos genes SLB ainda poderia ser explicada por meio das funções do proteassoma. Durante três genes SLB tráfico vesicular (sec28, ftp105 e ryh1), defeitos na via secretora invocar ER estresse (retículo endoplasmático), que pode aumentar a exigência da atividade do proteassoma [18]. Uma das tráfico vesicular genes SLB, ftp105, codifica a proteína localização de Golgi que foi relatado para interagir com deubiquitinase Usp5 e ser necessários para a localização Golgi de Usp5 [19]. O ortólogo humano de Ftp105 é C17orf28 /DMC1 (sub-regulada em vários tipos de cancro), um potencial supressor de tumores [20]. Portanto, a letalidade sintética de ftp105 supressão com bortezomib será estudada ainda mais no futuro. Ryh1 foi recentemente relatado para regular TORC 2 (alvo do complexo rapamicina 2)

S.pombe

[21]. No que diz respeito proteínas SLB nucleares, mais proteassoma pode ser necessária quando a dinâmica da cromatina é comprometida em mutantes de deleção de reguladores de cromatina, como o proteassoma nuclear é conhecido por contribuir para a regulamentação da cromatina como reparação de danos ao DNA, replicação de DNA, e transcrição [15], [22 ], [23], [24]. Um dos produtos de genes nucleares SLB é Rik1, um componente do complexo CLRK ubiquitina-ligase necessária para a cromatina silenciamento [25], [26]. Embora os substratos de CLRK ubiquitina-ligase não são conhecidos, pode ser uma curiosa experiência para examinar se bortezomib afecta ADN cromatina silenciamento. PKA foi relatado para ser envolvido em regulamentos metaphase /anáfase na levedura e em sistemas de Xenopus de ovo

in vitro

[12], [27], [28]. Enquanto alguns dos outros genes SLB, tais como factores de vitamina metabólicos, são difíceis de ser explicado, podem ser implicada a um dos muito diversas funções celulares do proteassoma. Bortezomib pode, eventualmente, ter diferentes do proteassoma no interior das células de

S alvos.

pombe. Assim avaliação dos genes SLB aparentemente não relacionados com ubiquitina /proteassoma pode valer a pena para considerar outros alvos. Combinação de deleção do gene de SLB e mutações sensíveis à temperatura do proteossomo será útil para avaliar se a letalidade sintética é devido à inibição do proteassoma ou a outras perturbações causadas pelo bortezomib. Se a letalidade sintética é devido à inibição do proteassoma, é esperado que o duplo mutante do gene SLB e o proteassoma para exibir um fenótipo mais severo do que um único mutante de proteossoma. Na verdade, um mutante de

cut8

, um gene SLB, mostra letalidade sintética a mutações proteossomo

mts2-1

e

mts3-1

[14]. Embora ele deve ser mantido em mente que o bortezomib tem outro alvo, os presentes resultados têm implicações potencialmente importantes para a biologia básica do proteassoma, abrindo caminhos para descobrir relações novas e inesperadas entre o proteassoma e outros percursos celulares. Uma tela de todo o genoma similar em células humanas sugeriu que as traduções de proteína, ER /via de Golgi, via DNA reparar danos, e regulamentação de Myc e poliaminas estão envolvidos na morte celular induzida pelo bortezomib [6]. Os resultados do presente estudo recentemente sugerem que os genes envolvidos em vitaminas e aminoácidos vias metabólicas, silenciamento da cromatina, nuclear /citoplasma vaivém, e da via de cAMP estão relacionados com o proteassoma na levedura de fissão

S.pombe

. Portanto, mais esforços devem ser feitos para compreender os mecanismos da letalidade sintética dessas eliminações inesperadas gene SLB com bortezomib.

Treze genes SLB conservados são mostrados em vermelho.

Foram identificados 13 genes conservados SLB potencialmente interessantes para estudos posteriores. Como mencionado nos resultados, de 4 a 7 nm de bortezomib foi usada para genes de tela que afectam a citotoxicidade do bortezomib em linhas celulares de cancro, e 100 ^ M de bortezomib foi utilizado para

S.pombe

rastreio mutante no presente estudo . A diferença na sensibilidade bortezomib pode reflectir a diferença na biologia destes organismos, tais como a permeabilidade de drogas e de excreção da droga. Em geral, células de levedura são mais resistentes a perturbações por inibidores químicos. Portanto, ortólogos de genes humanos SLB conservados deve ser examinado por pequena interferência de ARN para ver se o knockdown afecta a capacidade de sobrevivência de células humanas em doses mais baixas do bortezomib. Se os mesmos efeitos sintéticos ocorrem nas células humanas, tais genes SLB tem potencial para a inovação de novas terapias ou diagnósticos. Por exemplo, se inibidores químicos para esses produtos SLB conservados são desenvolvidas, tais produtos químicos serão candidatos utilizados para terapia de cocktail com bortezomib. Por outro lado, os pacientes com um fundo geneticamente fraca devido a estas ortólogos SLB pode ter graves efeitos adversos aquando da administração bortezomib. Assim, novas investigações sobre os orthologs SLB em humanos são esperados no futuro.

Materiais e Métodos

tratamentos Strain, médio, de cultura e de drogas

S. pombe

heterotálicas haplóides 972

h

– Comprar e 975

h

+

e foram utilizados seus derivados. Conclua rica YE, YES e minimal media EMM2 foram utilizados [29]. As soluções de reserva do bortezomib (LC Laboratories, Woburn, MA) foram preparadas em DMSO e as drogas foram adicionadas à cultura líquido ou meio de agar à concentração indicada.

Sintético letal rastreio

Para todo o genoma triagem, adotamos a biblioteca supressão do

S. pombe

haplóides comprado de Bioneer Corp. (Coreia do Sul). As estirpes do tipo selvagem de controle são ED666 (

h

+ ade6-M210 ura4-D18 leu1-32

) e ED668 (

h

+ ade6-M216 ura4-D18 leu1-32

), que também foram adquiridos a Bioneer Corp. A biblioteca de genes de supressão-haplóide foi fornecida como stocks de glicerol em placas de 96 poços. Primeiro, 5 ul de estoque de cada estirpe de deleção foi manchada em placas de SIM a partir de uma placa de 96 poços utilizando o sistema de automatização do laboratório BioMek FX (Beckman Coulter, Brea, CA). Após 3 dias de incubação a 26 ° C, uma colônia de cada cepa foi captado e viu em outra placa SIM (considerado as placas-mãe), utilizando o robô rotor (Cantor Instruments, UK). Uma colônia foi quadruplicou para verificar a reprodutibilidade. Das placas mãe, manchado colónias foram novamente captado e viu em placas SIM contendo 0, 100, 250 e 500 mm bortezomib, respectivamente. placas manchado com várias concentrações da droga foram incubadas durante 3 dias a 26 ° C e a formação de colónias de cada estirpe foi avaliada. Para a validação da despistagem primária, sensibilidades bortezomib de estirpes seleccionadas a partir do rastreio primário foram novamente testados utilizando testes de manchas.

Immunoblot e proteína purificação

Para a análise immunoblot, proteínas totais foram extraídos utilizando o ácido tricloroacético (TCA) método. quantidades idênticas de proteínas foram separados por gel de SDS-PAGE e transferidas para membranas de nitrocelulose. Anti-poli-ubiquitina (FK-2 monoclonal de rato, a MBL, Japão), anti-alfa-tubulina (TAT1; monoclonal de ratinho, uma oferta do Dr. Gaivota) e anti-CDC13 (policlonal de coelho) foram utilizados como anticorpos primários. anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e um sistema de quimioluminescência ECL (GE Healthcare) foram usados ​​para amplificar a expressão de sinal. Para purificar proteínas ubiquitinadas, o método anteriormente descrito foi aplicado com pequena modificação [15].

microscopia fluorescente

Todas as imagens foram obtidas utilizando um microscópio de fluorescência configuração Axioplan 2 (Zeiss, Alemanha). Métodos de construção de GFP ou RFP gene fundido foram previamente descritos [30].

Informações de Apoio

Figura S1.

bortezomib inibe a proliferação de

S.pombe

. (A) bortezomib e MG-132 foram adicionados a uma cultura em fase logarítmica de

S. pombe

nas concentrações indicadas e proliferação celular foi examinada durante 8 horas. Dobrável aumenta em 8 horas após a adição de drogas são apresentados no eixo Y. (B) Os níveis de proteínas ubiquitinadas-poli foram examinados na presença (+) ou ausência (-) de 1 mM de bortezomib. proteínas ubiquitinadas-Poly acumulado de uma forma dependente do tempo após a adição do bortezomib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s001

(TIF)

Figura S2.

Um exemplo da despistagem primária é mostrado. Tal como descrito no texto, todas as colónias de cada estirpe gene-supressão foi manchado para cada posição (A1, A2, …) de placas de agar de SIM com 0, 100, 250, e 500 uM bortezomib. Para o rastreio estirpes 2815, foram preparados 31 conjuntos destas placas. Após incubação a 26 ° C durante 3 dias, avaliou-se a formação de colónias. estirpes do tipo selvagem foram vistos a posições H2 e H3 (linha quebrada branco). Cepas manchado na A3, B8, B10 e C10 foram selecionados como candidatos com defeitos de crescimento graves com 100 M bortezomib e foram novamente testados através da identificação de diluição em série

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s002

(TIF )

Figura S3.

sensibilidade a doses mais baixas do bortezomib. capacidade Colony-formação de cinco mutantes slb foi examinada em meio de agar SIM contendo 0, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM, 10 uM, 100 uM e bortezomib como descrito na Figura 2 (D). Sob 10 mM bortezomib, não foi observado defeito de crescimento significativa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s003

(TIF)

Tabela S1.

lista de genes que foram identificados para mostrar defeito de crescimento na presença de 100, 250 e 500 uM bortezomib a partir do rastreio primário.

doi: 10.1371 /journal.pone.0022021.s004

(XLS)

Reconhecimentos

Temos uma grande dívida com o Dr. Colin Gordon pelo fornecimento do

S. pombe

tensões e Dr. Keith Gull para o fornecimento de anticorpos.