Abstract

Fundo

O câncer de pele é o câncer mais comum em todo o mundo. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) ea aquisição de células-tronco cancerosas (CSCs) -como propriedades emergem passos críticos na metástase de cancros da pele humana. O ácido cafeico (CAA) exerce efeitos anticancerígenos. No entanto, os efeitos da CaA sobre a capacidade migratória e sobre as propriedades CSCs-como de células de câncer de pele, e os mecanismos moleculares subjacentes não são totalmente compreendidos.

Métodos

células HaCaT malignos foram tratadas pela CAA. ensaio Transwell foi realizada para determinar que CaA atenuou a capacidade migratória; ensaio de formação de esferóide foi realizada para confirmar que o fenótipo CaA diminuiu-CSCs semelhantes; células HaCaT malignos tratados foram molecularmente caracterizado por RT-PCR, Western blot, blot sudoeste, e imunoprecipitação.

Resultados

Em queratinócitos humanos maligno tratados com CaA (células HaCaT malignos), a inibição da foram observadas capacidade migratória e fenótipo CSCs-like. CaA-regulada a fosforilação da p38 e regulados negativamente a activação do factor nuclear kB (NF-kB) /via de sinal caracol. Com efeito, p38 diminuiu a actividade de ligação do ADN de NF-kB para o promotor de

caracol

gene, o que resultou na inactivação transcricional de

caracol. Bloqueio de p38 atenuou a inibição induzida por CaA da capacidade migratória e fenótipo CSCs, como em células HaCaT malignas.

Conclusões

CaA atenua a capacidade migratória e CSCs-como Propriedades de queratinócitos humanos maligno, em que, p38 mediada por sub-regulação da via de sinal /caracol NF-kB está envolvida

citação:. Yang Y, Li Y, Wang K, Wang Y, Yin W, Li G (2013) p38 /NF-kB /Snail Caminho está envolvida na inibição Caffeic Acid-Induzida de células-tronco do câncer Como Propriedades e Capacidade migratórios em maligno dos queratinócitos humanos. PLoS ONE 8 (3): e58915. doi: 10.1371 /journal.pone.0058915

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de outubro de 2012; Aceito: 08 de fevereiro de 2013; Publicação: 13 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelas Fundações ciência Natural da China (81072338) e um projecto financiado pela Prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (2010). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pele é o câncer mais comum em todo o mundo [1], [2]. Para as duas últimas décadas, a taxa de mortalidade de câncer de pele é estável, em parte devido à doença metastática [3]. As opções de tratamento para o câncer de pele metastático continuam a evoluir em várias fronteiras. Dacarbazina, atualmente o único Food and Drug Administration dos EUA (FDA) aprovou a quimioterapia para o tratamento da doença metastática, até à data resultou em pouco ou nenhum impacto sobre a sobrevivência, mesmo quando avaliado em combinação com a terapêutica com diversos mecanismos de ação [4]. Novos agentes quimioterapêuticos para o tratamento de pacientes com cancro de pele malignas disseminadas são urgentemente necessárias.

de ocorrência natural derivados de ácido hidroxicinâmico são referidos como tendo anticancerígeno, anti-inflamatória, e propriedades antioxidantes [5], [6]. A sua origem natural e de ocorrência ubíqua levaram forte interesse na utilização deles como agentes anticancerígenos. O ácido cafeico (3, 4-di-hidroxicinâmico ácido, CaA) é o principal ácido hidroxicinâmico dietético. Estudos recentes sugerem que CaA exerce efeitos anticancerígenos [7]; CaA exerce efeitos protectores contra os danos na pele induzida por UVB, suprimindo a activação das cinases de proteína activada por mitogénio interleucina-10 e (MAPKs) em pele de ratinho [8]; Além disso, a CAA inibe a actividade da quinase de Fyn (um mediador-chave necessários para o cancro da pele induzido por UVB), que podem estar envolvidos na supressão da carcinogénese da pele [9]. No entanto, os efeitos de CaA sobre a capacidade metastática do cancro da pele, e os mecanismos moleculares subjacentes, não estão totalmente compreendidos.

A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um processo de desenvolvimento pelo qual células epiteliais são convertidos a células mesenquimais, durante a embriogénese, remodelação de tecidos, cicatrização de feridas e [10]. Durante este processo, as células epiteliais adquirem propriedades das células mesenquimais, e mostram a aderência intercelular reduzida e o aumento da invasão [11]. A activação do programa de EMT tem sido implicado como um importante passo na metástase de muitos tumores humanos, incluindo a pele [10], [12].

Um conceito recentemente proposto para explicar as características de tecidos neoplásicos é a existência de células auto-renovação, haste-como dentro de tumores, que foram chamados de “células-tronco cancerosas (CSCs)” [13]. CSCs foram identificados em muitos cancros humanos, incluindo a pele, da mama, do fígado, do pulmão, e assim por diante [1], [12], [14], [15]. Dentro de um tumor, CCC, que constituem uma pequena porção de células neoplásicas, são definidas pela sua capacidade para produzir novos tumores. Por este motivo, eles foram também denominadas “células tumorais iniciar ‘[13]. A relação entre a EMT e CSCs tem sido observado que, durante o processo de EMT, células epiteliais adquirir tronco traços semelhantes a células e que CSCs exibem uma mesenquimais-como a aparência [16]. Esta ligação entre o processo EMT ea indução de CSCs podem explicar por que o programa EMT induz a iniciação e progressão tumoral.

Aqui, descobrimos que CaA atenuado a capacidade migratória e CSCs-como propriedades em queratinócitos humanos malignos (maligno células HaCaT). CaA melhorou a fosforilação de p38, que bloqueou a activação do factor nuclear kB (NF-kB) /via de sinal caracol. A inibição da p38 aboliu a inibição induzida por CaA da capacidade migratória e fenótipo CSCs, como em células HaCaT malignas.

Resultados

CaA atenua a capacidade migratória das células HaCaT malignas

para determinar os efeitos de CaA sobre o potencial de migração de células HaCaT malignas, foi realizada Transwell ensaio. Como mostrado na Figura 1, as células HaCaT malignas exibida elevada capacidade migratória; Em contraste, a CAA atenuado a capacidade migratória das células HaCaT malignas de um modo faz-dependente. Desde 100,0 M de CaA diminuiu a capacidade migratória das células HaCaT malignos de forma eficaz, e uma vez que não tinha citotoxicidade detectável (Figura S1), escolhemos esta concentração para posterior investigação.

células HaCaT malignos foram tratados com 0,0, 50,0 , ou 100,0 uM de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) analisa ensaio Transwell da capacidade migratória das células HaCaT malignas, bar = 125 mm; (B) Quantificação do Transwell ensaio de migração celular. As células migraram foram coradas com violeta de cristal. Os resultados foram expressos como o número de células migradas por campo de visão (média ± DP, n = 5). **

p Art 0,01 em comparação com 0,0 M de maligna grupo células HaCaT tratadas com CaA.

CaA induz mesenquimal-epitelial (MET) em células HaCaT malignas

Para as células HaCaT malignas, alteração da epitelial a morfologia mesenquimal fusiforme é uma manifestação [17]. Desde EMT permite célula para mover e invadir [18], que, em seguida, determinou os efeitos de CaA sobre o processo de TEM em células HaCaT malignas. Como mostrado na Figura 2A, as células HaCaT malignas exibida uma aparência mesenquimais do tipo fibroblastos; No entanto, depois de essas células foram expostas a Caa durante 48 h, eles mostraram uma morfologia epitelial semelhante. A inibição da capacidade adesiva celular está associado com a iniciação EMT [18]. Aqui, ensaios de adesão mostrou que CaA melhorou a capacidade adesiva das células HaCaT malignos (Figura 2B). Em seguida, os efeitos de CaA sobre a expressão de EMT /adesivo marcadores:, foram determinados de E-caderina, N-caderina, e vimentina. Depois de células HaCaT malignas foram tratadas pela CAA durante 48 h, o nível de E-caderina foi aumentada, em contraste, N-caderina e vimentina níveis foram reduzidos (Figura 2C). Assim, mudanças tanto morfológicos e moleculares demonstram que, com a exposição a CaA, as células HaCaT malignas submetidos a um TEM.

células HaCaT malignos foram tratados com 0,0 ou 100,0 M de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) imagens morfológicas de células HaCaT malignas (bares: linha sólida = 500 mm e linha pontilhada = 125 mm); (B) Quantificação do ensaio de ades, tal como descrito na secção

Materiais e Métodos

. Foram utilizados os rácios de adesão de células HaCaT não tratados malignas para determinar o nível de 100%; (C) análises de Western blot de E-caderina, N-caderina, e os níveis de vimentina. As manchas foram normalizadas por utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga das proteínas. **

p Art 0,01 em comparação com 0,0 M de maligna grupo células HaCaT tratadas com CaA.

CaA diminui as propriedades CSCs-como de células HaCaT malignas

A indução de EMT tem sido associada com a aquisição de haste características semelhantes a células, incluindo a expressão de marcadores de células estaminais tal de superfície não aderente, o crescimento, e as alterações na expressão de glicoproteínas da superfície celular [16]. CD34 e K5 são marcadores de superfície celular de células-tronco da pele [19], [20]. No nosso estudo, as células HaCaT malignos mostraram expressão elevada de

CD34 Comprar e

K5

mRNAs; No entanto, após o tratamento de células HaCaT malignas com CaA durante 48 h, uma diminuição da expressão de tais mRNAs foi observado (Figura 3A). A formação de esferóides demonstra a capacidade das células para a auto-renovação e para a iniciação de tumores, que são características de células estaminais do cancro (CSCs) [21]. Em seguida, determinou os efeitos de CaA sobre a formação de esferóides de células HaCaT malignas. Em pratos não aderentes, as células HaCaT malignas formado, esferas viáveis ​​flutuantes; No entanto, após o tratamento de células HaCaT malignas com CaA durante 48 h, tal fenómeno foi desaparecido (Figura 3B e 3C). Estes dados demonstram que as propriedades de CaA diminui-CSCs como de células HaCaT malignas.

células HaCaT malignas foram tratadas com 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) analisa RT-PCR de

K5 Comprar e

CD34

níveis de mRNA. Bandas foram normalizados pela utilização de GAPDH para corrigir as diferenças no carregamento dos ADNc; (B) de livre flutuação, esferas viáveis ​​formados por células HaCaT malignas (barra = 125 mm); (C) Esfera quantificação (média ± DP, n = 3). **

p Art 0,01 em comparação com 0,0 M de maligna grupo células HaCaT tratadas com CaA.

CaA inibe a ativação da via de sinalização /caracol NF-kB por p38

Caracol, um fator de transcrição dedo de zinco , funciona como um regulador para suprimir a expressão de moléculas de adesão e para auxiliar a fuga de células tumorais a partir de morte celular durante EMT [22]. NF-kB, um mediador chave envolvidos na transformação maligna das células HaCaT [17], up-regula caracol expressão e induz EMT [23], [24]. Colocámos a hipótese de que o NF-kB via de sinal /caracol podem estar envolvidos na inibição induzida CaA de propriedades CSCs-like e capacidade migratório em células HaCaT malignas. Aqui, tal como mostrado na Figura 4A, CaA diminuiu a expressão de fosfo-RelA (indicando a activação de NF-kB) e caracol, o que sugeriu que CaA bloqueou a activação da via de sinal /caracol de NF-kB.

células HaCaT malignos (a) foram tratados com 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 24 h, respectivamente. análises de Western blot de caracol, p-p38, e os níveis de p-relA. As manchas foram normalizadas por utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga das proteínas; (B) Depois de células HaCaT malignas foram pré-tratadas por 10,0 uM de SB203580 (um inibidor de p38) durante 6 horas, foram expostas a 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 24 h, respectivamente. (B) As células topo, lisados ​​foram sujeitos a imunoprecipitação com o anticorpo de NF-kB /RelA, e os imunoprecipitados foram sujeitos a sudoeste blots para determinar a ligação de NF-kB para as sequências de ADN de

caracol

promotor (5 ‘ –

taa Restaurant –

AGT-GGG-TGG-CGG

-3 ‘); (B, parte inferior) os imunoprecipitados foram sujeitos a Western blot para determinar o nível RelA, o qual foi utilizado para corrigir diferenças no carregamento dos imunoprecipitados; (C) As células HaCaT malignas foram tratadas como descrito em (B), RT-PCR (topo) e Western blot (inferior) análises de ARNm de caracol e os níveis de proteína. Blots /bandas foram normalizados pela utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga das proteínas /ADNc.

Para determinar adicionalmente o regulador a montante do NF-kB /caracol Na CAA tratada células HaCaT malignas , investigou-se a activação de p38 (um inibidor de NF-kB e EMT [25]). Como mostrado na Figura 4A, CaA melhorou a fosforilação de p38 (indicando a activação de p38). Com base nestes dados, a hipótese de que em células HaCaT malignas, CAA bloqueou a via de sinal /caracol NF-kB por p38.

Em seguida, usamos imunoprecipitação e ensaio de transferência Texmex para confirmar a nossa hipótese. SB203580 é um inibidor específico da p38, e utilizou-se 10,0 uM de SB203580 para bloquear a activação induzida por CaA de p38 (Figura S2). Depois de células HaCaT malignas foram pré-tratados com 10,0 uM de SB203580 durante 6 horas, foram expostas a 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 24 h, respectivamente. RelA foi imunoprecipitada com o anticorpo específico, e os imunoprecipitados foram então sujeitas a sudoeste blots utilizando a sonda marcada com biotina “

gggagttggc

” (Figura S3) para determinar a ligação de NF-kB para as sequências de ADN de

caracol

promotor. Como mostrado na Figura 4B, a CAA diminuiu a ligação de NF-kB para

caracol

promotor em células HaCaT malignas; No entanto, a inibição de p38 aboliu este efeito. Além disso, o bloqueio da expressão de p38 atenuou a diminuição mediada por CaA de ARNm caracol e os níveis de proteína (Figura 4C). Estes resultados sugerem que, em células HaCaT malignas expostas ao AAG, p38 diminuir a actividade de ligação do ADN de NF-kB para

caracol

promotor, o que resulta na transcrição a sub-regulação de caracol.

p38 está envolvido na MET-CaA induzida de células HaCaT malignas

, em seguida, determinadas as funções de p38 mediada Met-CaA em células HaCaT malignas. Depois de células HaCaT malignas foram pré-tratados com 10,0 uM de SB203580 durante 6 horas, foram expostas a 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 48 h, respectivamente. Tal como mostrado na Figura 5. Em células malignas HaCaT tratados com CAA, nível de E-caderina foi aumentada, mas os níveis de N-caderina e vimentina foram reduzidos (Figura 5A); capacidade adesiva celular foi melhorada (Figura 5B); e as células adquiriu uma morfologia epitelial-like (Figura 5C). No entanto, a inibição de p38 aboliu o fenómeno acima induzida pela CAA (Figura 5A, 5B, e 5C). Estes resultados sugerem que a p38 está envolvido em MET induzida por CaA de células HaCaT malignas.

Depois de células HaCaT malignas foram pré-tratadas por SB203580 (um inibidor de p38), durante 6 horas, foram expostas a 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) analisa Western blot da caderina-E, N-caderina, e os níveis de vimentina. As manchas foram normalizadas por utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga das proteínas; (B) Quantificação do ensaio de ades, tal como descrito na secção

Materiais e Métodos

. Foram utilizados os rácios de adesão de células HaCaT não tratados malignas para determinar o nível de 100%; (C) imagens morfológicas de células HaCaT malignas (bares: linha sólida = 500 mm e linha pontilhada = 125 mm). **

p Art 0,01 em comparação com (CAA + SB203580) tenha sido tratada com maligna grupo células HaCaT.

P38 está envolvido na inibição induzida por CaA de propriedades CSCs-como em células HaCaT malignas

Além disso, nós determinados os efeitos de p38 sobre a inibição induzida por CaA de propriedades CSCs semelhantes em células HaCaT malignas. As células foram tratadas tal como descrito acima. Como mostrado na Figura 6, a CAA atenuou a expressão de

CD34

e

K5

ARNm (Figura 6A), e diminuiu a formação de esferóides (Figura 6B e 6C). No entanto, a inibição de p38 aboliu o fenómeno acima induzida pela CAA (Figura 6A, 6B, e 6C). Estes resultados indicam que a p38 está envolvida na inibição induzida pela CaA de propriedades CSCs semelhantes em células HaCaT malignas.

Depois de células HaCaT malignas foram pré-tratadas por SB203580 durante 6 horas, foram expostas a 0,0 ou 100,0 uM de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) analisa RT-PCR de

K5 Comprar e

CD34

níveis de mRNA. Bandas foram normalizados pela utilização de GAPDH para corrigir as diferenças no carregamento dos ADNc; (B) de livre flutuação, esferas viáveis ​​formados por células HaCaT malignas (barra = 125 mm); (C) Esfera quantificação (média ± DP, n = 3). **

p Art 0,01 em comparação com (CAA + SB203580) tenha sido tratada com maligna grupo células HaCaT.

CaA atenua a capacidade migratória das células HaCaT malignas por p38

Por fim, determinou-se CaA diminuiu o migratória capacidade das células HaCaT malignas via p38. células HaCaT malignas foram expostas a Caa (0,0 ou 100,0 uM) na presença ou ausência de SB203580 como descrito na Figura 6, e o potencial de migração de células HaCaT maligna foi determinada por ensaio Transwell. Como mostrado na Figura 7, a CAA atenuado a capacidade migratória das células HaCaT malignas; No entanto, a inibição de p38 aboliu este fenómeno. Estes dados sugerem que a p38 está envolvida na inibição induzida pela capacidade de CaA migratório em células HaCaT malignas.

Depois de células HaCaT malignas foram pré-tratadas por SB203580 durante 6 horas, foram expostas a 0,0 ou 100,0 uM de CaA para 48 h, respectivamente. (A) analisa ensaio Transwell da capacidade migratória das células HaCaT malignas, bar = 125 mm; (B) Quantificação do Transwell ensaio de migração celular. As células migraram foram coradas com violeta de cristal. Os resultados foram expressos como o número de células migradas por campo de visão (média ± DP, n = 5). **

p Art 0,01 em comparação com (CAA + SB203580) tenha sido tratada com maligna grupo células HaCaT.

Discussão

CaA é um dos principais metabólitos produzidos pela hidrólise de ácido clorogênico, um dos principais fitoquímico fenólica em vários alimentos, incluindo o café [8]. Uma vez que uma grande quantidade de ácido clorogénico é absorvido sob a forma metabolizado, uma atenção considerável tem sido focada sobre os efeitos biológicos de metabolitos, tais como CaA, a fim de avaliar o possível

In vivo

efeitos de dietas contendo ácido clorogénico [9 ]. Evidências sugerem que CaA tem o potencial para inibir o desenvolvimento de cancro da pele, por exemplo, CaA inibe a promoção do tumor da pele induzida por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato em pele de rato [26]. No entanto, os efeitos de CaA na capacidade migratória das células malignas da pele, e os mecanismos moleculares subjacentes, permanecem obscuros. Aqui descobrimos que CaA atenuou a capacidade migratória e propriedades CSCs-like de queratinócitos humanos maligno, no qual, p38 mediada por down-regulação da via de sinal /caracol NF-kB estava envolvido.

EMT refere-se a um programa durante o desenvolvimento embrionário normal, apresentando uma perda de propriedades epiteliais, tais como a adesão celular e expressão do marcador epitelial, e-caderina, e a aquisição de propriedades mesenquimais, tais como o aumento da motilidade celular e a expressão do marcador mesenquimal, N-caderina e vimentina [ ,,,0],10]. EMT é vista como um passo importante na invasão tumoral e metástase [27]. Aqui descobrimos que, após a exposição de células HaCaT malignas para CaA durante 48 h, eles mostraram uma morfologia epitelial-like e uma capacidade adesiva melhorada. Além disso, não foram um aumento da expressão de E-caderina (marcador epitelial), e redução da expressão de N-caderina e vimentina (marcadores mesenquimais). Estes resultados demonstram que, com a exposição a CaA, as células HaCaT malignas submetidos a um TEM.

Aquisição de CSCs-como propriedades emergir como um passo crítico na progressão do câncer [28]. Muitos genes são expressos em CSCs pele, incluindo

CD34,

K5

, e assim por diante [19], [20]. Na pele,

CD34

é especificamente expresso em SCs queratinócitos, e

CD34

expressão é fundamental para a carcinogénese da pele [19];

K5

é um marcador de SCs pele indiferenciadas ou CSCs [20]. No nosso estudo, as expressões de

CD34 Comprar e

K5

mRNA foram substancialmente reduzidos nas células HaCaT malignos tratados com CAA. SCs e CSCs compartilhar uma variedade de propriedades, incluindo selfrenewal, embora seja tipicamente desregulado na oncogénese. Muitos SC ou CSC linhas cultivadas formar aglomerados esféricos de livre flutuação de células viáveis ​​contendo uma preponderância do SCs ou CSCs [21], [29]. No presente estudo, a CAA-tratados células HaCaT malignas capacidade atenuada exibiu para a formação de esferas. Estes resultados indicam que as células HaCaT características malignas perdidos CSCs-, como por exposição a CaA.

Snail, um factor de transcrição de dedos de zinco, funciona como um regulador para suprimir a expressão de moléculas de adesão e para auxiliar a fuga de células tumorais de morte celular durante EMT [22], [30]. Snail é frequentemente expressa em muitos tipos de células tumorais em que a expressão de E-caderina é reduzida. Além disso, esta relação inversa de caracol e E-caderina foi frequentemente observada nos tipos de tumores invasivos [31]. Estudos posteriores confirmaram um efeito supressor do caracol na

E-caderina

promotor através de uma ligação aos três e-caixas específica

(cacctg)

na região promotora de -178 a +92 do

E-caderina

gene [31]. Além disso, caracol também tem sido associada à aquisição de características como CSC-[22]. Aqui em células HaCaT malignos tratados com CAA, foi observada uma diminuição da expressão de caracol.

Para determinar ainda o regulador up-stream de caracol em células HaCaT malignas CAA tratada, investigamos a ativação de NF-kB. NF-kB é pensado para iniciar e acelerar a tumorigénese, e a sua transformação celular blocos de inibição induzida por promotores de tumores [16], [23]; NF-kB induz alterações morfológicas, migração celular, ativação de caracol e repressão da produção de E-caderina [24], [32]. NF-kB liga-se ao

caracol

promotor e regula positivamente a transcrição caracol expressão [23]. Aqui, em células malignas HaCaT tratados com CAA, foi observada uma diminuição da expressão de p-RelA. Além disso, a CAA regulada negativamente a actividade de ligação do ADN de NF-kB para

caracol

promotor, o que resultou na inibição da transcrição de caracol. Estes resultados indicam que CaA induz uma inactivação da via de sinal /caracol de NF-kB.

As vias de MAPK transdução de sinais que levam a diversas respostas celulares, tais como o crescimento celular, diferenciação, proliferação, apoptose, e respostas ao stress ambiental aos estímulos [33]. O sinal extracelular regulado cinase 1/2 (ERK1 /2) via tipicamente transduz sinais do factor de crescimento que levam à proliferação ou diferenciação celular, enquanto que as citocinas e os sinais de estresse activar as quinases c-Jun N-terminal (JNK) e vias de MAPK p38, resultando na resposta ao stress, a paragem do crescimento, ou apoptose [34]. Além de ser um mediador central da resposta inflamatória e do stress, a p38 desempenha um papel importante nos processos de não-inflamatórias, tais como a regulação do ciclo celular e diferenciação celular [35]. Uma vez activado, p38 fosforila uma grande variedade de substratos no citoplasma e no núcleo, regulando assim a expressão do gene, do ciclo celular e a polarização celular. Os estudos sobre os papéis de famílias MAPK na gênese da EMT têm produzido resultados conflitantes, devido à heterogeneidade dos modelos celulares e as diferentes abordagens experimentais usados ​​[25], [36]. estudo anterior demonstra que a p38 promove a expressão de E-caderina, suprimindo-TGF-β activado quinase 1 (TAK1) -nf-kB sinalização [25]. Aqui, em células malignas HaCaT tratados com CAA, p38 diminui a actividade de ligação do ADN de NF-kB para

caracol

promotor, o que resulta na transcrição a sub-regulação de caracol. A p38 /NF-kB /caracol via está envolvida na inibição induzida pela CaA de propriedades CSCs-like e capacidade migratória nos queratinócitos humanos malignos (Figura 8).

Em células HaCaT malignas expostas ao AAG, a p38 diminui actividade de NF-kB para a

caracol

promotor, o que resulta na transcrição a sub-regulação de caracol de ligação a DNA-. Tal processo molecular provoca a inibição de propriedades CSCs-like e capacidade migratória das células HaCaT malignas.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

O maligno transformado As células HaCaT foram anteriormente desenvolvido pelo nosso laboratório [17]. As células foram mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI-1640 (Life Technologies /Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). O inibidor de p38, SB203580 foi adquirido a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). Todos os outros reagentes utilizados eram de grau analítico ou de grau mais elevado disponível.

Transwell ensaio

ensaio Transwell foi realizada usando de crescimento reduzida-fator revestidos por Matrigel (8 um de tamanho de poro, BD, Franklin Lakes, NJ) filtros em placas de 24 poços. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e semeadas sobre a câmara superior do transwells (3 × 10

4 células /cavidade) em 1640 suplementos livres. As câmaras inferiores dos transwells foram cheias com o meio 1640 contendo 100 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (EGF, R D Systems). As câmaras foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 24 h. No final da incubação, as células na superfície superior do filtro foram removidas utilizando um cotonete. As células migram através do filtro para a superfície inferior foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos e coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 5 minutos. As células migraram foram vistos e fotografados sob um microscópio de contraste de fase (Olympus, Tóquio, Japão), e contou em cinco campos escolhidos aleatoriamente.

Ensaio de aderência de

Um total de 1 × 10

4 células tratadas foram cultivadas numa placa de 96 poços durante 24 h, seguido por lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes e a fixação com etanol a 70% durante 15 min à temperatura ambiente. As restantes células aderentes foram avaliadas pelo WST-8 hidrólise utilizando contagem celular Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc.). Resumidamente, depois as células foram lavadas em PBS, foram incubadas com 20,0 ul de solução de CCK-8 para 4 h. A absorvância a 450 nm foi medida com um leitor de placas multi-poços (Modelo 680, Bio-Rad, EUA). As proporções de células não tratadas de controlo foram utilizados para determinar o nível de 100%.

Western blots

Os lisados ​​celulares foram separados por electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio e transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno ( Millipore, Billerica, MA, EUA); os complexos imunitários foram detectados por quimioluminescência aumentada (Cell Signaling Technology). Os anticorpos utilizados foram caderina-E, N-caderina, vimentina, caracol, p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), RELA, p-RelA (Ser536, Cell Signaling Technology); Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH, Sigma, St. Louis, MO). As manchas foram normalizadas por utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga das proteínas.

da transcriptase reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O ARN total (2 ug) foi transcrito em cDNA utilizando transcriptase inversa de AMV (Promega, Madison, WI, EUA). Primers para

CD34

(para a frente, 5′-TTGGGCATCACTGGCTATTT-3 ‘; reversa, 5′-GGAAGGGTTGGGCGTAAGA-3’),

K5

(para a frente, 5′-GAGCAGGGCACCAAGAC-3 ‘; reversa , 5’-CTCCGCATCAAAGAACATC-3 ‘), e

snail

(para a frente, 5′-TTCTCCCGAATGTCCCT -3′; reverso, 5′-TCAGCCTTTGTCCTGTAGC -3 ‘) foram usadas para a amplificação por PCR. A reacção de PCR foi avaliada, verificando os produtos de PCR em 2% w /v de géis de agarose. Bandas foram normalizados pela utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga do ADNc

formação esferoidal

em pratos não aderentes (Costar, EUA), as células (1 x 10

4) eram suspensas em meio definido, isento de soro composto de DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml de factor de crescimento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF, R D Systems, EUA), e 10 ng /ml de EGF. As células foram cultivadas durante 10 dias e alimentadas a cada 48 h. Total de esferas foram depois contadas sob um microscópio (Olympus).

A imunoprecipitação

As células foram extraídas durante 30 min com tampão de lise. Após centrifugação das preparações, os sobrenadantes foram incubados com anticorpos RELA e subsequentemente com grânulos + G Sepharose (Sigma) a 4 ° C durante a noite. As pelotas foram lavadas três vezes, re-suspenso em tampão de amostra de dodecilsulfato de sódio, e fervida para remover a proteína a partir das pérolas. Os imunoprecipitados foram analisados ​​por manchas sudoeste com uma sonda marcada com biotina (5 ‘-

taa Restaurant –

AGT-GGG-TGG-CGG

-3′)., Ou por Western blot

ensaios sudoeste

Southwestern análises foram realizadas como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, os imunoprecipitados foram separados por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore). Após a transferência, os filtros foram hibridados durante 2 h a 20 ° C com tampão de ligação contendo 40 ng de sonda marcada com biotina (

caracol

promotor: 5 ‘-

TAA

–

GGG-AGT-TGG-CGG-3 ‘). As posições dos oligonucleótidos marcados na extremidade com biotina foram detectadas por uma reacção quimioluminescente de acordo com as instruções do fabricante (Pierce, EUA) e visualizadas por autorradiografia.

A análise estatística

valores, os quais foram apresentados como o significa SD ±. Dunnett do

t

de teste e one-way análise de variância (ANOVA) foram usadas para avaliar as diferenças significativas entre os diferentes grupos. A significância estatística foi determinada pelo teste de Fisher.

P

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Informações de Apoio

Figura S1..

Efeitos de CaA sobre a viabilidade das células HaCaT malignas. Depois as células foram expostas a 0,0, 50,0, 100,0, 200,0 pM ou de CaA durante 24 e 48 h, respectivamente, as suas viabilidades foram medidos por utilização de um kit-8 de contagem de células de ensaio. As proporções relativas de viabilidade celular foram determinados por comparação do crescimento de células expostas a nenhuma CaA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058915.s001

(TIF)

Figura S2.

Efeitos de SB203580 sobre a viabilidade das células e na fosforilação de p38. (A) Os efeitos de SB203580 sobre a viabilidade das células HaCaT malignas. Depois as células foram expostas a 0,0, 5,0, 10,0, 20,0, ou 40,0 uM de SB203580 durante 24 h, as suas viabilidades foram medidos por utilização de um kit-8 de contagem de células de ensaio. As proporções relativas de viabilidade celular foram representadas graficamente com células não tratadas a determinação do nível de actividade de 100%. (B) SB203580 bloqueou a fosforilação induzida por p38 de CaA. (

gggynrrrcc

).

doi:10.1371/journal.pone.0058915.s003

(TIF)

Acknowledgments

The