Sumário

caracterização atempada da evolução de um câncer é necessária para prever a eficácia do tratamento e para detectar a resistência inicial. análise de conteúdo de alta dos únicos de circulação células tumorais (CTCs) permite a caracterização sequencial de alterações genotípicas, morfométricas e expressão de proteínas em tempo real ao longo do tratamento do câncer. Este conceito foi investigada em um paciente com cancro da próstata resistentes à castração progredindo através de quimioterapia e terapia-alvo. Neste estudo de caso, integramos em quatro pontos temporais 41 variação do número de cópia (CNV) perfis além de parâmetros morfométricos e níveis de proteína receptor de andrógeno (AR) de todo o genoma. Notavelmente, pouca mudança foi observada em resposta à quimioterapia padrão, evidenciado pelo facto de que um único clone (A), que exibem perfis de CNV altamente rearranjados e AR + fenótipo foi encontrada em circulação antes e após o tratamento. No entanto, a resposta clínica e subsequente progressão após terapia-alvo foi associada com a redução drástica do clone A, seguido pelo aparecimento sequencial de duas sub-populações CTC distintas que diferem entre si tanto em RA genótipo e o fenótipo de expressão. Enquanto as células AR com perfis CNV planas ou pseudo-diplóide (clone B), foram identificados pelo tempo de resposta, foi detectada uma nova linhagem de tumor de células RA + (clone C) com perfis alterados durante a CNV recaída. Nós mostramos que o clone C, apesar filogeneticamente relacionado para clonar A, possuía um único conjunto de alterações somáticas CNV, incluindo

MYC

amplificação, um evento ligado ao hormônio fuga. Interessante, mostramos que ambos os clones adquiriu

AR

amplificação do gene por meio da implantação diferentes caminhos evolutivos. No geral, estes dados demonstram o prazo da evolução do tumor em resposta à terapêutica e fornecer um quadro para a análise multi-escala de biópsias de fluidos para quantificar e monitorar a evolução da doença em pacientes individuais

Citation:. Dago AE, Stepansky A , Carlsson A, Luttgen H, J Kendall, Baslan T, et al. (2014) Rápido fenotípica e genômica mudar em resposta a pressão terapêutica no cancro da próstata inferida pela alta de Análise de Conteúdo de células circulantes único tumor. PLoS ONE 9 (8): e101777. doi: 10.1371 /journal.pone.0101777

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de dezembro, 2013; Aceito: 11 de junho de 2014; Publicação: 01 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Dago et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Award Número U54CA143906 do Instituto Nacional do Câncer. A. E. Dago é um destinatário de um PA-12-149- Suplementos de investigação para promover a diversidade de Pesquisa em Saúde-Related concedido pelo National Cancer Institute (NCI). A. Carlsson é financiado pelo Conselho de Pesquisa sueco, Dnr 2012-235. JH, JK, TB e MW foram apoiados por uma concessão especial do Dr. Marilyn Simons para a investigação do cancro em CSHL, um cancro da mama concessão Cancer Research Foundation, e apoiar a investigação de Skyline Genomics. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Dr. Asya Stepansky de Skyline Genomics teve um papel significativo no desenvolvimento do protocolo para o isolamento de DNA a partir de células HD-CTC e realizou os preparativos biblioteca Illumina. Genomics Skyline apoiado financeiramente o seqüenciamento Illumina na instalação de Cold Spring Harbor Genome como uma demonstração das suas capacidades como prestador de serviços futuro. A empresa não ter um papel no desenho dos experimentos ou interpretação dos dados

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e ter conflitos para divulgar. A tecnologia de ensaio de HD-CTC aqui descrita foi licenciado para Ciências épica. ML, AK, KB e PK tem participações em Ciências épica. AS é um funcionário da Skyline Genomics, e teve um papel significativo no desenvolvimento do protocolo para o isolamento de DNA a partir de células HD-CTC e realizou os preparativos biblioteca Illumina. AS não têm qualquer papel na concepção dos experimentos ou interpretação dos dados. JH é um co-fundador e acionista em genômica do horizonte. AED, AC, JK, TB, MW e MEG e declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

O receptor de andrógeno-andrógeno (AR) via de sinalização é essencial para o desenvolvimento e progressão de cancro da próstata e é um alvo fundamental de muitos agentes terapêuticos [1]. No cancro metastático da próstata (PCA), terapia de privação de andrógeno (ADT), constitui o tratamento padrão ouro para induzir a regressão do tumor através da supressão de activação AR. Apesar de resposta inicial a ADT, os pacientes muitas vezes desenvolvem resistência e progresso para o câncer de próstata resistente à castração (CRPC), uma doença incurável, com prognóstico reservado. Estes pacientes são frequentemente tratados com terapias de salvamento dirigida-hormonais, incluindo agentes tais como não-esteróides anti-andrógenos e inibidores da síntese de androgénio-[1]. Na gestão destes tratamentos, prevendo resposta terapêutica e identificação de indicadores precoces de resistência terapia são grandes desafios. Os níveis de antigénio específico da próstata (PSA), uma proteína regulada androgénio medido no soro, é utilizado para monitorizar a resposta terapêutica em pacientes CRPC, contudo, a sua capacidade de previsão para este grupo de pacientes é limitada [2]. Além disso, embora muitos estudos tenham identificado os eventos moleculares que podem contribuir para a resistência à terapêutica com agentes de direccionamento de androgénio, é difícil aplicar esses achados, devido à quantidade limitada de tecido sequencialmente adquirida e a heterogeneidade esperada em vários depósitos metastáticos presente em qualquer indivíduo paciente [3], [4]. Como tal, os métodos que permitam a monitorização sequencial não invasiva através do curso clínico de terapia seria de grande valor para os clínicos.

circulantes células tumorais (CTCs) tem o potencial de fornecer um meio não-invasivas de avaliar cancros progressivos em tempo real durante a terapia, e ainda mais, para ajudar a terapia directo por monitorização das alterações fisiológicas e fenotípicas genéticas que ocorrem em resposta à terapia. Na maioria dos pacientes CRPC, o tumor primário ter sido removido, e CTC são esperados para consistir de células de metástases derramam, proporcionando um ‘fluido biópsia’. Atualmente, o único método aprovado para CTC enumeração (CellSearch, Veridex) é baseado em uma abordagem de enriquecimento imunológico que pré-seleciona para células que expressam células epiteliais Molécula de adesão (EpCAM), um marcador de superfície de células epiteliais [5]. Embora, a quantificação numérica de CTCs usando CellSearch rendeu algumas informações prognóstico em certos tipos de câncer [6] – [8], esta metodologia tem limitações como a baixa sensibilidade (células com expressão baixa ou ausente EpCAM não serão capturados) e a presença regular /contaminação de leucócitos genomically normais na preparação de amostras que dificulta ainda mais a caracterização molecular e interpretação de dados. Recentemente, alterações genômicas com base na matriz de CGH e sequenciamento limitada foi relatado em CTCs isoladas com o sistema CellSearch [9]. A análise detalhada em tumores e metástases emparelhadas (n = 2) e CTC (n = 8) sugeriram que a maioria das mutações detectadas no CTC estavam presentes a um baixo nível no tumor primário [9]. No entanto, porque um único ponto no tempo durante o curso clínico da doença foi investigada neste estudo não trata de como um tumor pode responder e evoluir para pressão terapêutica.

Aqui, nós demonstrar o poder de duas tecnologias recém-desenvolvidos, a fim para fornecer um retrato mais abrangente das alterações moleculares que ocorrem, no nível de uma única célula, em um paciente CRPC sob a pressão de tratamento em ambas as configurações de quimioterapia e ADT. A Alta Definição-CTC (HD-CTC) método foi utilizado para a identificação e contagem longitudinal dos CTC [10] e para avaliar a expressão do ar [11]. O ensaio emprega um protocolo imparcial para examinar e distinguir entre os leucócitos CTC circundantes, com base na sua positivo (CK +) fenótipo citoqueratina por imunofluorescência usando uma imagem de alta resolução. Além disso, a tecnologia de HD-CTC preserva a morfologia das células, de tal maneira que permite a quantificação morfométrica e o indirecto dos níveis de expressão de proteína AR e CK para todos os CTC identificados na amostra de sangue. Para melhor caracterizar cada CTC, foi desenvolvido um protocolo para a extracção de células individuais em condições adequadas para a análise genómica subsequente por uma modificação do método de sequenciação núcleo único descrito por Navin,

et ai.

[12] e Baslan,

et al.

[13]. Os métodos combinados habilitado para rastrear ao longo do tempo as mudanças moleculares na população CTC, correlacionando os dados morfométricas e expressão de proteínas com genoma alterações CNV de largura para cada um dos 41 CTCs individuais isolados em quatro instantes clinicamente significativas. Fomos capazes de associar o surgimento de subpopulações CTC distintos dotados com alterações moleculares específicos com o curso clínico da doença, especialmente durante o período de ADT alvo, que foi clinicamente representado por um curto período de resposta seguido por resistência e fuga clínico.

material e Métodos

história clínica e exames de sangue coletadas durante Tratamento

o estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB), da Universidade do Sul da Califórnia Comprehensive Cancer Center. O paciente forneceu consentimento informado por escrito.

O paciente apresentou com PCA metastático a um vértebras lombares no momento do diagnóstico para o qual a biópsia primário representa o primeiro espécime deste estudo. O tratamento inicial consistiu de terapia de privação de andrógeno (acetato de leuprolide). Após 5 meses, houve progressão clínica para CRPC eo paciente foi matriculado em um ensaio clínico de docetaxel combinado com bevacizumab e everolimus (clinicaltrials.gov identificador: NCT00574769). Antes de quimioterapia foi iniciada, um empate arterial basal foi tomada (Draw 1) de acordo com o protocolo de coleta de amostras. A evolução clínica foi observado após 4 meses de quimioterapia especificado pelo protocolo. Ao longo dos próximos 3 meses, doses adicionais de docetaxel, bem como radioterapia externa e de samário (

153Sm) lexidronam (um radiofármaco de metas de osso) foram empregados com benefício paliativos limitado. Ao fim de 12 meses após o diagnóstico, o tratamento com acetato de abiraterona, um inibidor da síntese de androgénio altamente selectivo, foi iniciado. O sangue foi colhido antes de se iniciar abiraterona (Draw 2), às 3 semanas de tratamento contínuo coincidindo com uma resposta clínica representado pela diminuição do nível de dor e PSA (Draw 3), e às 9 semanas coincidindo com a progressão clínica representado pelo aumento dos níveis de dor e de PSA (Draw 4). Na sequência de abiraterona, o tratamento foi alterado para cabazitaxel sem resposta clínica seguida de uma deterioração clínica rápida. O paciente morreu de câncer de próstata metastático amplamente 4 meses após Desenhar 4 (17 meses após o diagnóstico).

Collection Amostra de Sangue e Processamento de CTC Detecção

amostras de sangue periférico dos pacientes foram coletadas de acordo com um IRB protocolo aprovado. As amostras foram enviadas para o nosso laboratório e processados ​​dentro de 24 horas depois da hora do sorteio. A preparação da amostra foi anteriormente descrito em [10]. Em breve, é constituída por uma lise das células vermelhas do sangue, seguido por plaqueamento das células nucleadas como uma monocamada em personalizado feito de adesão celular lâmina de vidro, seguido por armazenamento num biorrepositório. Cada amostra produzida pelo menos 14 lâminas independentes para identificação e caracterização CTC.

Imunofluorescência Coloração e CTC enumeração

Para este estudo, foi utilizado um protocolo baseado no ensaio de HD-CTC publicada juntamente com a avaliação do estado do receptor de andrógeno (AR) dentro da citoqueratina (CK) população CTC positivo [11]. Resumidamente, as células foram marcadas usando monoclonal de ratinho citoqueratina 19 (1:100; Dako) e panCK (1:100; Sigma) para identificar anticorpos primários citoqueratina (CK) de células positivas. AR HD-CTC positivas foram identificadas usando um anticorpo de coelho anti-AR monoclonal (1:250, Cell Signaling Technology). Ambos os antígenos CK e AR foram visualizadas utilizando anticorpos secundários AlexaFluor; os anticorpos primários de CK foram reconhecidos com Alexa Fluor 555 anticorpo IgG1 secundário (1:500, Invitrogen) e o anticorpo de coelho AR foi reconhecida com Alexa Fluor 488 IgG (H + L) anticorpo secundário (1:1000, Invitrogen). Alexa Fluor 647 conjugado com anti-CD45 (1:125; AbD Serotec) anticorpo primário foi usado para identificar os leucócitos como um marcador de exclusão. Para confirmar que as células são nucleadas e para permitir a análise de morfologia nuclear de todas as células foram coradas com uma 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).

As lâminas foram fotografadas e CTC putativos foram registados usando um high-throughput microscópio de fluorescência computadorizado em 10 x de ampliação. CTC foram identificados por um técnico de hematologia utilizando os critérios previamente publicados de ter um núcleo mais DAPI + positividade a citoqueratina e CD45 negatividade [10]. a expressão da proteína do receptor de androgénio e localização foram avaliadas utilizando dois critérios (1) presença (AR

+) ou ausência (AR

-) de coloração de AR, e (2) AR localização subcelular (AR nuclear contra coloração citoplasmática ou ambos ). O limiar para a positividade AR foi definida como um sinal de mais do que 6 desvios padrão sobre a intensidade média do sinal (sdom) observada nos leucócitos arredores (fundo). localização subcelular foi medido utilizando a densidade de pixels relativa de coloração AR sobre o núcleo eo citoplasma.

HD-CTC Ensaio Reprodutibilidade

O ensaio HD-CTC foi tecnicamente validado com linha celular spiking experimentos para chegar um R

2 = 0,9997 em testes de linearidade conforme relatado anteriormente. Estas experiências foram realizadas utilizando linhas celulares SK-BR-3 e de 0 a 3 × 10

2 células por ml de sangue de controlo dador normal. O coeficiente de variação é de 16% e correlação inter-processador é R

2 = 0,979. processo de preparação de amostras aderiram aos procedimentos operacionais padrão para as amostras do paciente através de um sistema de código de barras para todos os consumíveis e instrumentação. Toda a instrumentação off-the-shelf foi calibrado de acordo com os protocolos de validação técnicos estabelecidos durante o comissionamento [14].

Extração de células individuais

Como procedimento padrão, que visa minimizar as células fragmentação do DNA foram apanhados no prazo de 5 dias do procedimento de coloração inicial. O protocolo experimental para a captura de fase fluida HD-CTC foi dividido em três etapas seqüenciais discretos:. (1) deslocalização CTC, (2) de extração de células e (3) de isolamento e manipulação de CTCs individuais para análises moleculares jusante

HD-CTC foram transferidos (passo 1) usando uma matriz de transformação da aquisição de dados inicial para a identificação de HD-CTC. Após a calibração e relocação, cada célula candidato foi re-trabalhada com uma resolução de 40 × para a análise morfométrica detalhado. Para a extracção de células (passo 2) uma transferência de Eppendorf Homem NK2 micromanipulador foi usada para capturar a célula de interesse dentro de uma micropipeta denteado 25 ° (piezo broca ponta ES, Eppendorf) por aplicação de sucção de fluido. Uma vez que a célula de interesse foi capturado dentro da micropipeta (passo 3), as células foram lavadas com PBS e depositados dentro de um tubo de 0,2 mL de PCR contendo 2 mL de tampão de lise (200 mM de KOH; DTT 50 mM). A amostra foi, em seguida, e imediatamente congeladas e armazenadas a -80 ° C até posterior processamento. Todos os instrumentos e consumíveis foram descontaminados utilizando uma solução DNAAS e exposição à luz UV por 30 min antes do experimento.

Single Cell Next Generation Sequencing and Analysis Bioinformatic

A célula que contém frascos foram transferidos em gelo seco para o laboratório de sequenciação. Resumidamente, a mistura de células lisadas foi descongelada e sujeita a WGA e construção da biblioteca de sequenciação conforme relatado anteriormente [13]. WGA foi realizada manualmente em um formato de placa de 96 poços utilizando o WGA4 Genomeplex Single Cell Kit de Amplificação do genoma inteiro (Sigma-Aldrich), seguido por purificação utilizando um QIAquick PCR Purification Kit 96 (Qiagen). Concentração de ADN eluído foi medida utilizando um Nanodrop 8000 (Thermo Scientific). Para cada poço, a amplificação foi considerado bem sucedido, se a concentração de DNA resultante foi ≥70 ng /ul (volume de eluição de 50 ul), seguido de mais de controlo de qualidade (CQ) para confirmar a distribuição de tamanho de amostra apropriada utilizando o Agilent Bioanalyzer 2100 (High- sensibilidade DNA Ensaio e Kit, Agilent Technologies).

Além disso, os métodos detalhados utilizados para analisar os dados de sequenciamento foram publicados recentemente pelo nosso grupo [13]. Resumidamente, os métodos de informática envolve três etapas: primeiro, deconvoluting a sequência de leituras com base em códigos de barras; segundo, mapeando a lê para o genoma humano (hg19, Genome Consortium Referência GRCh37, banco de dados do navegador UCSC Genome) [15], e remoção de duplicatas de PCR; e terceiro, normalizando para guanina-citosina conteúdo (GC) e estimativa do número de cópias usando o algoritmo de segmentação CBS. Os perfis número de cópias deste relatório baseiam-se em 20.000 caixas comprimento do genoma variáveis, com média de um comprimento de ~ 150 pares de kilo-base cada, e foram calculados como proporção em relação ao normal (hg 19). Os dados aqui tinham uma contagem média de 1.780.000 exclusivamente mapeamento lê, com um intervalo de 244.190 (corte mínimo 200.000) para 5,33 milhões.

Análise Cluster

O agrupamento hierárquico foi realizado em R [16] utilizando a função heatmap.2 no pacote gplots. O método de Ward com métrica de distância Euclidiana foi usado para o agrupamento. O mapa de calor é de cor de acordo com os pontos de corte descritos acima e o agrupamento foi realizada utilizando média centrada dados.

Análise de freqüência para definir Genomic Alterações

Usando mediana centrado perfis CNV, rácios de corte versus a mediana de 0,8 e 1,25 foram utilizados para definir e deleções amplificações, respectivamente. Estes cortes foram usados ​​tanto para colorir o mapa de calor e fazer a análise de frequência.

Estatísticas e celular análise da morfologia

A forma da célula (

arredondamento celular

) foi analisado por rastreamento o contorno citoplasma da célula na imagem composta de cada CTC. A imagem celular rastreado foi importado para R, e reticências foi montado para a forma usando mínimos quadrados ajustadas algoritmo descrito por Halir e Flusser [17]. O algoritmo produz eixo maior da célula, que é o maior raio da elipse equipada (Consulte as informações de suporte). O arredondamento celular (

c

) é estimado como a fração de

de facto

área celular (

A

) e a área de um círculo com o raio (

r

) definido como eixo principal da célula.

o valor de p usado na comparação da circularidade entre as CTCs no Draw 3 e 4 foi calculada utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon.

resultados e Discussão

tratamento de resposta monitoradas pelo CTC análise Molecular longitudinal

a fim de avaliar a resposta do paciente à análise única célula tratamento de alta conteúdo, incluindo: (1) fenótipo expressão da proteína AR , (2) AR localização subcelular e (3) CNV perfis genómico foram realizadas no CTC identificados nas amostras de sangue recolhidas em quatro intervalos diferentes que representam pontos de decisão no tratamento padrão da CRPC, incluindo: (Draw 1) imediatamente antes do início do docetaxel quimioterapia baseada, (Draw 2) imediatamente antes do acetato de abiraterona (um inibidor da síntese de androgénio altamente selectiva), (Draw 3) ao fim de três semanas, e (Draw 4) depois de nove semanas de tratamento contínuo de abiraterona. Os dados específicos para todas as células perfiladas é apresentado na informação de apoio. Além disso, um método baseado sequenciação semelhante foi utilizado para obter o perfil de CNV de um local metastático a partir do paciente utilizando uma biópsia óssea tomadas no momento do diagnóstico (5 meses antes de desenhar um) antes de receber qualquer terapia específica do cancro. Como mostrado na Figura 1A, e durante o período de 7 meses entre Chama 1 e 2, a paciente apresentou resposta inicial à quimioterapia com docetaxel, seguido pela resistência. Ao mesmo tempo, a biópsia de fluido do paciente mostrou uma proporção constante do AR

+ e AR

-. Subpopulações enquanto o número total de CTCs diminuiu (Figura 1A, 1D, figura S1 e Tabela S1)

( a) as contagens totais de HD-CTCs, incluindo o número de fenotipicamente distintas AR

+ e AR

– células, foi determinada para cada sangue Empate recolhidas durante a intervenção terapêutica. CTC foram definidos como AR positiva se a intensidade do sinal de AR foi maior do que seis desvios padrão da média mais de (sdom) dos leucócitos circundantes (fundo). O gráfico de barras mostra a mudança na distribuição do AR

+ e RA

– subpopulações CTC ao longo do curso do tratamento, indicadas em vermelho e azul respectivamente, e os números são apresentados por cima de cada barra. concentração (B) de PSA medido em cada ponto de tempo de tratamento. (C) Boxplot da redondeza célula para cada CTC indivíduo identificado através dos diferentes pontos no tempo de tratamento. (D) representativos de 40 × imagens de imunofluorescência de AR

+ e AR

– HD-CTCs das subpopulações identificadas em cada ponto de tempo de tratamento. canais de imunofluorescência são coloridos da seguinte forma: núcleo: blue; citoqueratina: red; AR: branco; e CD45: verde. AR fenótipo é indicado no canto inferior esquerdo de cada imagem. Todos os gráficos foram construídos usando os pacotes ggplot2 e RGL na R.

Os perfis genômicos CNV de CK

+ células a partir de Sorteios 1 e 2 eram de dois tipos (Figuras 2 e S2). Três destas células foram negativas para a expressão AR (CK

+ AR

-), enquanto a maioria (16/19) mostraram altos níveis de proteína AR (CK

+ AR

+). Uma AR

– e um AR

+ célula tinha perto CNV normais perfis comparáveis ​​aos obtidos a partir único CK

-CD45

+ leucócitos (Figura 2). Todas as outras CK

+ AR

+ células exibiram um padrão complexo de rearranjos genômicos que eram semelhantes ao perfil genômico obtido retrospectivamente a partir de metástase óssea do paciente (hormônio amostra de tecido naïve) obtido no diagnóstico (Figura 2 e Figura 3A) . Os CK células + AR + e a amostra metástase óssea partilhada múltiplos ganhos e perdas de braços do cromossoma mais uma amplificação focal característica em 3p13 centrada na subunidade reguladora da fosfatase PPP4R2 e contendo pelo menos dois genes implicados no cancro, FOXP1 [18], [19] e MITF [20] (Figura 2). Para o nível de resolução disponíveis, cada um dos eventos comuns mostrou pontos de interrupção genómicas idênticos, e na análise de agrupamento hierárquico AR

+ células de tira 1 e 2 agrupado em conjunto com a metástase óssea (Grupo A na Figura 3A). A partir dessa constatação, infere-se que estas células são

bona fide

CTCs derivado de linhagem metastático do paciente. Apesar da relação linhagem claro, a AR

+ células difere da metástase no locus AR circulante, mostrando amplificação de cópias múltiplas de vários segmentos em Xq12 contendo o gene de AR em si. amplificação AR é frequente em CRPC, e tem sido associada à progressão de cancro da próstata sensível a castração a CRPC [21]. É digno de nota que cada uma das amplificações AR (Figura 3C) são únicas, resultantes de vários pontos de interrupção diferentes em ambos os lados do gene de AR, o que indica que a amplificação AR surgiu múltiplas vezes independentes (evolução convergente) provavelmente como resultado da pressão selectiva imposta pela a terapia da privação do andrógeno

Copiar número variação perfis de metástase óssea do paciente.; um controle único WBC; e CTC individuais de cada um dos quatro instantes de tratamento são mostrados. A imagem fluorescente correspondente da célula utilizada para gerar o perfil de CNV está mostrado à direita. alterações genômicas relevantes e suas localizações cromossômicas que ocorrem em cada sorteio específico são indicadas com barras azuis pálidos.

(a) três linhagens clonais diferentes, representados como Cluster A, B e C, foram identificados com base na comparação de 41 perfis de células CNV individuais em um agrupamento hierárquico não supervisionado. A coleta de sangue a partir do qual cada célula foi isolado é indicado como Draw 1: amarelo; Desenhe 2: laranja; Desenhe 3: roxo; e Draw 4: preto. Para referência, o tecido FFPE metástase óssea foi incluído na árvore, colorido de verde. Abaixo da árvore, uma heatmap indica as amplificações (vermelho) e deleções (azul) ao longo de todo o genoma de cada célula individual. (B) Freqüência de ampliações genómicas e supressões nos três clusters identificados. Áreas amplificados exclusivamente (vermelho) ou excluído (azul) no cluster A e C são realçados. (C) Um gráfico do evento amplificação AR colorido por sorteio para cada cluster individuais detalhe é mostrado.

No sorteio 3, após três semanas de tratamento com acetato de abiraterona, o paciente apresentou uma resposta clínica clara quanto definido pela diminuição da dor e do PSA (Figura 1B). Esta resposta coincidiu com uma mudança abrupta na fenótipos e genótipos CTC. Embora o número absoluto de CTC no Draw 3 era comparável ao de desenhar 2, houve uma depleção quase completa do AR

+ CTC população (Figura 1A). O CK

+ células identificadas no Draw 3 expressa pouca ou nenhuma proteína AR e também diferiram morfologicamente, que parece ser significativamente mais alongado do que o AR

+ células de Empates 1 e 2 (Figura S1 e Tabela S1). Esta mudança morfológica se reflete em uma diminuição na redondeza celular mediana (Figura S3) de 0,87 (DP = 0,14) no Draw 1 e 2 para 0,62 (sd = 0,15) no Draw 3, p 10

-11 Wilcoxon Rank teste -sum (Figura 1C).

o efeito aparente de tratamento também foi evidente na análise genômica de Desenhe 3, onde os estados fenotípicas alterados correlacionadas com perfis genômicos distintas. A maioria (10/12) de fenotipicamente AR

– células de tração 3 não foram amplificados por AR e exibiu aparentemente normal ou quase perfis normais (pseudodiploid) (figura S2) colocando-os em Cluster B nas Figuras 3A. Um dos dois Ar

– células deste ponto de tempo tinha o assinatura CNV típico de Cluster A, incluindo amplificação do AR, enquanto que o outro associado com um terceiro grupo (Grupo C na Figura 3A), dominada por células a partir do ponto de tempo subsequente ( Desenhe 4). Mutações que afetam a estabilidade da proteína AR e /ou mutações nonsense no gene AR poderia explicar a disparidade AR genótipo-fenótipo nas duas últimas células. Interpretamos que a resposta inicial ao acetato de abiraterona esgotado significativamente o andrógeno-dependentes AR

+ população, e que outra AR

– população dominada pelas células pseudodiploid estava presente na circulação. Com base na contagem de células totais, mantendo-se constante entre desenha 2 e 3, podemos inferir que o desenhar três população é uma consequência de cancro, mas a partir de uma fonte fora da linhagem do tumor principal (Figura 3A).

Desenhar 4 foi recolhido no momento da progressão clínica, quando os níveis de PSA aumentou após 9 semanas de abiraterona (Figura 1B). Neste ponto, a contagem CTC tinham diminuído para 47% do ponto temporal anterior, mas mais uma vez submetidos a uma mudança fenotípica significativa, como a maioria dos CTC foram novamente AR

+ com um valor arredondamento celular de 0,81 típica de células a partir dos dois primeiros chama (Figura 1C e Figura S1). Esta descoberta, o que sugere uma associação entre a resposta terapêutica e um fenótipo CTC em vez de com a contagem total do CTC, é consistente com um estudo publicado recentemente, onde a expressão de dois marcadores para o caminho de sinalização AR em CTC foi monitorizada em resposta a terapia dirigida por androgénio [ ,,,0],22].

Alterações em resposta à terapia foi novamente evidente ao nível genómico, como células (6/10) formado a maioria de um novo, aparentemente clonal, subpopulação (Cluster C nas Figuras 3A e S2). As assinaturas CNV em Cluster C são claramente na linhagem original, voltando para a metástase óssea amostradas antes de qualquer terapia sistêmica, mas agora é caracterizada por eventos funcionalmente relevantes, tais como um amplicon estreita contendo MYC, e o desaparecimento do FOXP1 /amplicon MITF juntamente com outras diferenças observadas nas Figuras 2, 3A e 3B. MYC amplificação é uma das alterações mais comuns observadas em tumores metastáticos, e tem sido sugerido como um mecanismo para a resistência de derivação independente AR [23]. Curiosamente um exame mais detalhado da amplificação AR genómico (descrito na Figura 3C) mostra que, em contraste com os limites de amplificação heterogéneos observados em células anteriores (grupo A), as células no conjunto C exibem uma forma de perfil único com pontos de interrupção quase uniforme e significativamente níveis mais elevados de amplificação de AR. Tomados em conjunto os elementos genômicos sugerem que as células Cluster C representam uma linhagem nova, aparentemente resistente ao acetato de abiraterona, e gerou talvez a partir de uma única célula resistente.

Além disso, análises morfométricas de localização subcelular AR mostrou que a AR era geralmente localizada no núcleo de células de Chama 1 e 2, mas foi identificado como significativamente menos localizada para o núcleo na CTC isoladas no Draw 4 recolhido em progressão (p = 0,00017 teste de Wilcoxon rank-sum) (Figura 4). Esta descoberta é particularmente interessante à luz de estudos recentes indicam que as variantes do ligando independente AR splicing podem mediar a resistência de abiraterona num modelo de xenoenxerto CRPC humano [24], e que estas formas truncadas e constitutivamente activas de AR é encontrado para ser localizada no núcleo bem como citoplasma em linhas celulares de cancro da próstata [25].

(a) Comparação da localização subcelular AR nas CTC identificados no sangue antes e depois de nove semanas de tratamento de abiraterona. A correlação entre os sinais de AR e DAPI dentro da célula é indicativa de AR sendo co-localizada com DAPI,

i.

Localizada no núcleo da célula. Alta correlação foi geralmente observada antes do tratamento de abiraterona, mas uma mudança para menos mancha nuclear foi observada após nove semanas de tratamento (p = 0,00017, Wilcoxon teste soma-rank). (B) e (D) Altura mapas construídos a partir das intensidades de pixel de CK (vermelho), AR (verde) e DAPI (azul) no CTCs representativos para visualizar a localização subcelular da AR. A célula em (B) foi isolado antes do início de abiraterona e exibe a coloração AR confinada ao núcleo, ao passo que a coloração citoplasmática AR é observada na CTC identificadas no momento de recaída terapêutico (D). (C) e os gráficos (E) de RA versus intensidade de sinal DAPI para cada pixel no interior da célula em 40 × imagens dos CTC em (B) e (D), respectivamente. Cada ponto da trama é colorido pela intensidade do sinal CK correspondente. A localização nuclear foi observada correlação positiva entre as duas intensidades (C), e a exclusão nuclear como correlação negativa (E). phenotype-genotype.

doi:10.1371/journal.pone.0101777.s004

(DOCX)

Acknowledgments

We