Abstract

tridimensional (3D)

ensaios baseados in vitro

celulares para Cancer Research próstata (PCA) estão rapidamente se tornando a alternativa preferida à de culturas 2D convencionais em monocamadas. ensaios 3D imitar mais precisamente o microambiente encontrado

in vivo

, e, portanto, são ideais para avaliar os compostos e sua adequação para a progressão na calha descoberta de drogas. Para alcançar a taxa de transferência de alta desejado necessário para a maioria dos programas de rastreio, é necessário quantificação automatizada de culturas 3D. Para este fim, este artigo relata o desenvolvimento de um módulo de análise de protótipo para um sistema (HCA), que permite a investigação precisa e rápida de

em modelos de cultura de células in vitro

3D para CaP de alta conteúdo de análise automática . O programa baseado em Java, o que temos chamado PCaAnalyser, usa novos algoritmos que permitem a quantificação precisa e rápida da expressão da proteína em cultura de células em 3D. Como atualmente configurado, o PCaAnalyser pode quantificar uma série de parâmetros biológicos, incluindo: núcleos de contagem, a previsão de adesão núcleos-esferóides, várias funções de classificação baseado das áreas periféricas e não-periféricas para medir a expressão de biomarcadores e os componentes de proteína conhecida por estar associada com PCA progressão, bem como definir efetivamente-objetos celulares segregar para uma gama de relações sinal-ruído. Além disso, a arquitectura PCaAnalyser é altamente flexível, funcionando como uma única análise independente, bem como no modo de lote; essencial para a alta taxa de transferência de triagem (HTS). Utilizando o PCaAnalyser, uma análise precisa e rápida de uma forma automatizada transferência alta é fornecido, e análise reprodutível da distribuição e da intensidade dos marcadores bem conhecidos associados com a progressão CaP numa gama de metastáticos linhas celulares de CaP (DU145 e PC3) numa modelo 3D demonstrou

Citation:. Hoque MT, Windus LCE, Lovitt CJ, Avery VM (2013) PCaAnalyser: Um 2D-imagem Módulo Based Análise para Determinação eficaz de cancro da próstata progressão na cultura 3D. PLoS ONE 8 (11): e79865. doi: 10.1371 /journal.pone.0079865

editor: Gajendra P. S. Raghava, CSIR-Instituto de Tecnologia Microbiana, Índia |

Recebido: 24 Março, 2013; Aceito: 26 de setembro de 2013; Publicação: 20 de novembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Câncer de Próstata da Austrália concedido ao VMA. TH reconhece o Conselho de Regentes Louisiana, através do Conselho de Regentes Fundo de Apoio, LEQSF (2013-16) -RD-A-19 parcialmente para preparar o manuscrito final. CJL foi apoiado por uma concessão do Australian Pós-Graduação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) tem a maior prevalência de câncer na Austrália, com cerca de 20.000 novos casos diagnosticados a cada ano [1]. No início da APC, o tratamento envolve a ablação de androgénios, o que retarda temporariamente a progressão, no entanto, a recorrência de cancro numa forma independente de androgénios é comum [2]. Nesta fase, o PCA já não pode ser controlada pelas terapias convencionais, a metástase ocorre, o que é a principal causa de mortalidade. Assim, novas terapias são necessários para combater a doença antes da progressão metastática.

A importância da utilização de modelos em 3D na avaliação de desenvolvimento de tumor foi previamente descrito [3], [4]. Nós, e outros, têm mostrado que as culturas 3D proporcionam uma melhor plataforma para o estudo das massas de tumores sólidos como células tumorais neste microambiente discernir perfis antigênicos e comportamentos fenotípica que imitam mais precisamente células tumorais como encontrado

in vivo

[ ,,,0],3], [4]. cultura de células 3D permite a interacção de células subtil das mesmas ou diferentes origens dentro de uma matriz, imitando célula-célula e as interacções célula-matriz semelhante aos encontrados

In vivo

. Além disso, o alinhamento adequado e organização espacial em 3D é essencial para a progressão do tumor [5]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que as culturas em 3D pode servir como um modelo mais biologicamente relevante na calha de descoberta de drogas.

Alterações

perfis antigénicos de tumores excisados ​​de pacientes com CaP avançada já identificados na expressão de numerosas proteínas. Destes, o receptor de androgénio (AR) [6], α6 [7], [8] e b1 integrina subunidades [9], e mais recentemente, o receptor de quimiocina CXCR4 [10] expressão têm sido associados ao aumento de Gleason e disseminação metastática em CaP. tumores de pacientes mostram consistentemente um aumento da regulação da subunidade β1 integrina [11] e o receptor de quimiocinas CXCR4 [12], acompanhada de uma redistribuição e regulação para baixo dos α6 integrina [7], [8].

Fortemente implicada na CaP metástases ósseas desenvolvimento e progressão é a subunidade de integrina β1 [13] – [15]. Expressão de α5β1 e α2β1 em células CaP foi relatado para facilitar interações com células estromais óssea [15] e promover activamente a invasão e aderência de células APC aos estroma ósseo

in vitro

[14] e metástases ósseas experimentais

in vivo

[13]. Da mesma forma o α6β1 integrina de ligação a laminina foi mostrado para permitir o extravasamento de células humanas de CaP de circulação para o estroma ósseo

In vivo

[16] – [18].

De modo semelhante, estudos têm indicado que a quimiocina, CXCL12, desempenha um papel no tráfico de células APC aos ossos. CXCL12 é expressa pelas células estromais em órgãos alvo de CaP metástase (osso, cérebro, linfa), mas não em outros tecidos, [19] e do seu receptor, CXCR4, é altamente expressa por osso células CaP metastáticos [20], [21]. Foi o objectivo do presente estudo para avaliar e analisar os padrões de distribuição e de estes marcadores bem conhecidos associados com a progressão CaP de expressão, utilizando um modelo 3D em conjunto com a análise de imagem de alto rendimento.

Outra proteína altamente influente que contribui para o desenvolvimento de PCA é o AR [6]. A AR pertence a uma superfamilia de receptores nucleares e medeia a acção de androgénios, tais como 5-α-di-hidrotestosterona (DHT). A AR e os seus ligandos de activação desempenhar um papel importante na progressão CaP mediando as respostas de androgénios e activar a transcrição de genes. Embora muitos dos efeitos bem caracterizados de AR nas células CaP são dependentes dos efeitos genómicos que envolvem a transcrição de genes alvo, os efeitos não genómicos de androgénios também influenciar o comportamento das células. Estes incluem a activação de cascatas de cinase e o rearranjo do citoesqueleto, que pode estimular a motilidade celular [22] – [24]

Anteriormente, relataram que as células metastáticas CaP PC3 re-expressam AR não-transcricionalmente activo, que está em. parte mediada pela via de Src [4]. Utilizando um modelo 3D em conjunto com análise de imagem de alto rendimento, que era um outro objectivo do presente trabalho avaliar o potencial relevância funcional da AR endógeno aumento da regulação nesta linha celular e como ela pode afetar outros constituintes de proteína importante conhecidos para mediar CaP progressão incluindo integrina β1.

a capacidade de analisar com precisão vários parâmetros de imagem obtidos a partir de cultura de células 3D é a data dependente de programas altamente especializados que não são de forma automatizada. O software de imagem existente sofre em grande parte do problema inerente de uma incapacidade de se adaptar rapidamente e acomodar as necessidades mudando de forma eficaz [25]. Aqui, temos desenvolvido um software de base de análise de imagem automatizada chamada “PCaAnalyser” que é capaz de analisar uma variedade de parâmetros medidos em cultura de células 3D com base em imagens 2D.

PCaAnalyser tem sido desenvolvido como um ImageJ [26 ] – [28] plugin, portanto, tem a capacidade de compartilhar e melhorar várias funções básicas fornecidas em ImageJ. A análise realizada por PCaAnalyser é uma composição de duas grandes algorítmicos-interfaces. No primeiro passo, o limite do esferóide 3D celular é detectada e as máscaras necessárias são gerados. No segundo passo, os núcleos são detectados e esferóides-associações são então previsto utilizando as máscaras e os limites. Abordagens semelhantes são seguidos para detectar e estudar áreas citoplasmáticos segregando-os de ruído crítico.

O paradigma da PCaAnalyser, incluindo o componente de relatórios, foi projetado para ser flexível para permitir ao usuário manipular facilmente a análise relacionada em um variedade de formas, para além das opções padrão.

no que diz respeito à eficiência da PCaAnalyser, que tem incorporado um algoritmo baseado candidato-adesão para acelerar o processo de detecção de núcleo-esferóide, fazendo com que o tempo de processamento global consideravelmente mais rápido. Tempo de análise de complexidade foi fornecida neste artigo, para ajudar com estimativas sobre o tempo de processamento, que se baseia nos dados disponíveis-parâmetros, tais como número de esferóides por imagem, o número de núcleos por esferóide e o perímetro do núcleo. Este recurso também fornece uma base para comparação da PCaAnalyser com outros algoritmos publicados.

No presente estudo, utilizamos um Perkin Elmer Opera ™ [29], um sistema de imagem confocal de alto rendimento, para gerar a saída do um modelo de cultura de células CaP 3D em formato microplaca adequado para HTS. reconstrução completa dos esferóides em 3D foi memória e tempo intensivo, assim aquisição-imagem 2D dos objetos 3D, ao longo do

xy

-Plane, foi aplicado como uma alternativa. Nesta população de esferóides, o 2D-imagem do 3D objetos variada na resolução ea nitidez da imagem devido aos diferentes planos focais, portanto, profundidades físicas, bem como a composição das diferentes componentes celulares das objectos 3D, que colectivamente feitas segmentação e detecção desafiador. Detecção de vários objetos co-localizados e de múltipla contextuais dentro da mesma imagem-canal também colocou desafios significativos. PCaAnalyser foi projetado para enfrentar com êxito esses desafios. Assim, o PCaAnalyser aqui apresentado fornece um recurso valioso para investigações que utilizam modelos 3D baseados celular, especialmente para uso em sistemas automatizados de rendimento elevados.

Utilizando a PCaAnalyser, relatamos aqui a análise bem-sucedida da distribuição e intensidade do bem marcadores estabelecidos associados com a progressão CaP em uma gama de linhas celulares metastáticas CaP (DU145 e PC3) em um modelo 3D. Especificamente, mostraram que, em resposta ao ligando, SDF-1α, distribuição e expressão de CXCR4 alterado, indicativo de um receptor funcional. Além disso, apresentamos aqui novos dados relativos à infra-regulação da integrina β1 após o tratamento com DHT. Estes resultados sugerem que, em células PC3, AR não-transcricionalmente activa pode mediar outras proteínas importantes associados com a progressão CaP. Estes resultados têm implicações de longo alcance sobre AR alvo terapêutica na fase final de tratamento CaP.

Materiais e Métodos

1. Linhas celulares de cancro

O DU145, PC3 e linhas de células MDA-MB-231 foram comprados de

American Tissue Centro de Cultura

(ATCC). As linhas celulares DU145 e PC3 CaP, foram mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen), suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS, Gibco). A linha celular do cancro da mama (BCA) MDA-MB-231 foi mantida em DMEM-F12 (Invitrogen), suplementado com 10% de FBS. Todas as células foram propagadas a 37 ° C em condições de cultura de células padrão (5% de CO

2, 37 ° C) em frascos T75. Media foi reabastecido a cada 3 dias. Uma vez que as células tinham atingido confluência de 80-90% foram novamente plaqueadas (1/10) em frascos T75. Depois de 10-12 passagens, as células foram interrompidas.

2. Culturas de Células miniaturizados 3D

Para as linhas de células APC, as células foram plaqueadas no topo de um leito de gel matriz 3D (Matrigel: BD Bioscience) em placas de 96 poços com fundo de vidro (matricial: PerkinElmer). Para culturas em 3D miniaturizados, os poços foram cheios com 60 ul de meio de Matrigel ™ /cultura (70%) e polimerizada a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 1 h. As células foram então semeadas a ~5000 células por poço e mantidas como anteriormente descrito acima. Mídia foi cuidadosamente removido e reabastecido a cada três dias. As culturas foram mantidas durante até 12 dias. Para a linha de células BCa MDA-MB-231, 1000 células por poço foram plaqueadas em cima de 15 mL de Factor de Crescimento Reduzida Matrigel (TFG Matrigel) numa placa de 384 poços CellCarrier (PerkinElmer).

3. Ligando e tratamento da toxicodependência Ensaios

Utilizando um formato de placa de células PC3 de 96 poços foram cultivadas em culturas 3D de Matrigel, tal como descrito acima. Após 9 dias em cultura, as células foram tratadas com 3D um androgénio natural, dihidrotestosterona (DHT, Sigma-Aldrich) durante 30 horas em meio livre de soro a 0, 1, 5 e 10 concentrações nM. Como alternativa, as culturas em 3D foram privadas de soro durante 16 horas e depois tratou-se com um ligando de CXCR4: SDF-1α: (30 ng /ml, R D Systems) durante 0, 20 e 40 minutos. As células foram depois fixadas e processadas para imunocitoquímica.

No caso de MDA-MB-231, as células foram incubadas durante 3 dias antes da aplicação de 720 nM de doxorubicina (Sigma-Aldrich) durante 72 horas. Para visualizar o núcleo dessas células Hoechst (1:500, Invitrogen) foi aplicada durante 2 horas antes de imagens de células vivas foi realizado. Doxorrubicina emite fluorescência endógena (excitação comprimento de onda de 480 nm, comprimento de onda de emissão de 530 nm).

4. Imunohistoquímica

O ensaio baseado imagem foi realizada como descrito anteriormente [4] com pequenas modificações. Resumidamente, após 10 dias em cultura, as culturas em 3D de células CaP DU145 foram lavadas com PBS e fixadas com PFA (4%, 10 minutos para 2D, 20 minutos para 3D), lavadas duas vezes com PBS e bloqueadas durante 2 horas com 2% de BSA , 0,1% de Triton-X, de 0,05% de TWEEN. anticorpos de rato primária anti-a6 e anti-p1 de subunidade de integrina (5 ug /ml, R D Systems) ou de murganho anti-CXCR4 (5 ug /ml, R D Systems) foi então adicionado durante 24 horas a 4 ° C em tampão de bloqueio. As células foram lavadas com PBS (3 × 5 minutos) e incubadas à temperatura ambiente (TA) durante 4 horas com os anticorpos secundários (5 ug /mL 488 de cabra anti-ratinho) e mancha nuclear Hoechst (1/1000, Invitrogen).

5. Aquisição de Imagem

Todas as células fixas foram fotografadas usando o celular Imager PerkinElmer Opera ™ Quádruplo Excitação Alta Sensibilidade confocal com um PerkinElmer 20 /.75 íris da água. As imagens foram adquiridas utilizando o espectro de 488 e 405 emissões. imagens de células vivas foi concluída usando a PerkinElmer Opera usando o objectivo de 10 × ar com excitação pelos 405 e 561 lasers nm. As imagens obtidas foram utilizadas como entrada para o software PCaAnalyser para o estudo analítico aqui descrito.

Resultados

1. Informação do canal e Desafios

Neste caso, as imagens através de dois canais fluorescentes foram investigadas: (1) Ch-1, para detectar o núcleo (Hoerchst: emissão de 405) e (2) Ch-2, para detectar a a expressão da proteína de interesse, (CXCR4, aB ou b1 subunidades de integrina) e distribuição.

Ch-1 é utilizado para identificar (a) o núcleo, e (b) a área do esferóide. Para extrair informações relativas a um ou outro do núcleo e /ou a área do esferóide as imagens deste canal foram tratadas como imagens de campo brilhante, que permitem que dois contextos diferentes da imagem a ser extraído do mesmo sinal.

o conteúdo da imagem tem o seu próprio bem complexidade: mesmo que um sistema de imagem confocal é empregue, os esferóides possuem uma estrutura 3D que incorpora profundidade e variação, resultando em iluminação irregular do plano focal. esferóides 3D são cultivadas num gel semi-sólido, e como tal eles se sentam em uma multiplicidade de diferentes z-planos. Assim, há um número relativamente pequeno de células que têm imagem em foco dentro desse plano focal. Estas imagens são constituídas por uma combinação de ambas as estruturas bem definidas e mal definidos e desfocada componentes mal definidas, proporcionando assim um desafio considerável para detectar com precisão o núcleo de cada célula. Isto torna-se ainda mais problemática quando se utiliza a análise automatizada, como estes sinais são muitas vezes integrados em um resultado final ou intensidade. Assim, foi necessário um maior controlo sobre os níveis de limiar e a capacidade de filtrar parâmetros dentro do software para obter os dados representativos precisos.

Ch-2 fornece as imagens que definem a membrana celular e no citoplasma das células individuais do massa esferóide. Imagens adquiridas através deste canal tem uma baixa relação sinal-ruído (SNR). Os desafios com estas imagens específicas são: (a) para o segmento, identificar e ler a área intensidade a zero ou baixo, juntamente com a área de maior intensidade do citoplasma, (b), para desenvolver e definir as funções adequadas para classificar várias regiões do citoplasma, e ( c) para evitar ruídos. A coloração de imunofluorescência qualquer dado marcador tem com ela uma gama de valores de SNR. manchas Nuclear (Ch-1) imagens são geralmente medido dentro da gama do espectro de comprimento de onda de 405 nm, o que em comparação com a 488 nm (verde) ou espectros de 594 nm (vermelho), são altamente permeáveis ​​manchas. Assim, CH-1 imagens têm menos ruído em comparação com os obtidos com CH-2. Além disso, o sistema Opera ™ é uma alta taxa de transferência confocal imager automatizado, em que parâmetros variáveis ​​não puderam ser definidas para imagens individuais, assim, um ambiente especial, por vezes, funciona melhor para 6 a 10 imagens, mas não para o restante. Portanto, o nosso software foi customizado para resolver estes problemas, bem como reduzir o ruído indesejado.

2. Análise de Imagem

Nossa PCaAnalyser foi desenvolvido como um plug-in de ImageJ [26] – [28], que oferece um excelente ambiente para personalização, bem como o fácil acesso a muitos imagem-arquivo-formatos diferentes devido para LOCI plug-in ea biblioteca Bio-Formatos de Java [30], [31]. Uma versão comprimida dos ficheiros associados FLEX foi gerada, que é o formato de ficheiros de imagem primária são obtidos. FLEX ficheiro é o ficheiro de formato padrão gerado pelo sistema PerkinElmer Opera ™ que temos utilizado para capturar as imagens em bruto. Estes são compatíveis com MBF_ImageJ [32] (versão do ImageJ) através de suportes estendidos de loci Bio-Formatos (https://loci.wisc.edu/bio-formats/imagej)

.

Além disso, um independente FLEX para conversor TIFF foi desenvolvido para fornecer imagens em um formato mais genérico. Muitos parâmetros no

GenericDialog

de ImageJ precisava ser acomodados para o conseguir. Infelizmente,

GenericDialog

foi limitada em lidar com mais do que alguns parâmetros, portanto, era necessário combinar mais ImageJ e NetBean (versão 6.8) [33] para desenvolver um personalizado com guias de vidros de diálogo (Figura 1) para PCaAnalyser . Este abas de vidros de diálogo é prontamente e eficientemente acomodar quase 30 parâmetros de diferentes tipos. O coração do software é

ParticleAnalyzer

de ImageJ [26] – [28]; no entanto nós estendemos ainda mais para ser usado em

batch-mode

para complementar o

monomodo

opção. ImageJ foi actualizado em conformidade e, portanto, para usar nosso PCaAnalyser, no mínimo, a versão do ImageJ 1.44d é necessária.

Uma das cinco seções com guias relacionados com a “máscara geração” é visível.

no geral, os algoritmos de PCaAnalyser pode ser dividido nas seguintes sequências:

i

) detecção esferóide e máscara geração geral,

ii

) núcleo e associação detecção,

iii

) detecção e citoplasma ler e

iv

) relatórios.

2.1 detecção spheroid e máscara Geração

Ch-1 tem a imagem dos núcleos, agrupados por esferóide . Ch-1 para o segmento é processado para detectar a área de esferóide completa e os limites, permitindo a formação de a-máscara limite utilizando um algoritmo (Figura 2) e os correspondentes passos principais são mostrados na Figura 3. O limite-máscara é utilizada para transformação imagens de CH-2 para: (a) a supressão de ruído e (b) para ler intensidades de áreas citoplasmáticas e de membrana, que variam de zero a valores elevados. Ch-2 tem intensidades muito irregulares, incluindo valores tão baixos como zero para a membrana e citoplasma área do esferóide, e também inclui muitos intensidade mais elevada e níveis mais baixos de SNR. Portanto, CH-2 não pode ser usado para a detecção limite do esferóide de forma fiável.

Principais passos do algoritmo de detecção de esferóide. As variáveis ​​com valores de amostra são colocados dentro dos colchetes (ou seja, … ).

As principais etapas envolvidas na detecção de esferóide são ilustrados

Durante o processamento de Ch. -1, dificuldades associadas com sinais resultantes de iluminação irregular são experientes. Usando a subtracção de fundo com um raio adequado do rolamento-ball-algoritmo, fomos capazes de eliminar esta imagem artefacto relacionado. Assumindo, como a altura de uma terceira dimensão sobre uma superfície 2D de uma imagem de fundo, o pixel fornece intensidade proporcionalmente dessa imagem. Com o propósito de se ter um fundo liso, o algoritmo de rolamento da bola pode assumir uma esfera de raio escolhido é enrolada sobre a superfície a 2D e o casco do volume atingido pela bola é o fundo smoothened esperado. A fim de realizar isto, primeiro o esferóide-limite foi detectado por aumento do contraste consideravelmente (6 vezes) para separar os sinais de baixa a partir do fundo. No passo seguinte, duas maneiras possíveis foram fornecidas para o utilizador a seguir: (a) auto ou (b) manual para identificar o contorno apropriado com base na profundidade do sinal original gradiente de objectos 3D e outros parâmetros morfológicos, tal como circularidade e tamanho (área). Opções para converter as imagens em níveis de bits inferiores também foram fornecidos, o que ajuda a separar o fragmento indesejado na imagem resultante de iluminação irregular causado pela configuração experimental.

Com os parâmetros pré-processados ​​e fornecidos, o ParticleAnalyzer foi implantado para detectar os esferóides – o algoritmo foi aplicado a cerca de 1000 imagens e a detecção resultante foi realizado com precisão superior a 90%, quando comparada com análise por microscopia manual e simples programas de reconhecimento de objectos. Por imagem, havia geralmente 10 esferóides, em média

2.2 Núcleo e Detecção Membership

O sinal do Ch-1 foi utilizado para a detecção de núcleo.; no entanto, a imagem correspondente tinha iluminação desigual que impactou a eficiência do programa de análise (ver “Imagem Original” na Figura 3). Assim, foi necessário construir e incorporar pelo menos 10 parâmetros adicionais para permitir a detecção núcleo-precisas e confiáveis. O algoritmo de detecção de núcleo final (Algoritmo 2) desenvolvido tem sido descrito em detalhe na Figura 4.

As principais etapas necessárias para o algoritmo de detecção de núcleo. As variáveis ​​com valores de amostra são colocados dentro dos colchetes (isto é, … ).

A imagem-núcleo, disponível em Ch-1 também tem sido utilizado para a detecção esferóide. Como mostrado no Algoritmo 2, na primeira instância, a subtracção de fundo foi usado para diminuir a iluminação irregular, e a resolução da imagem foi então aguçada (passo 3). Dentro de uma dada imagem, não todos os núcleos foram encontrados a ter a mesma altura ao longo do eixo z, resultando em alguns deles estar fora de foco porque eles residia num plano focal alternativa dentro do esferóide 3D. Aplicando o “reforço da nitidez ‘módulo (função ImageJ), fomos capazes de reduzir o número de pixels e, assim, melhorar a detecção do sinal dado. Nós também aplicado o módulo ‘funcionamento’ (função ImageJ) para evitar tipo de limite de detecção de não-lisa ou em ziguezague do núcleo. Um limiar do algoritmo adequado (passo 5) foi então aplicado para a segmentação e detecção do núcleo. Além disso, o filtro morfológica foi aplicado para filtrar o ruído indesejado. As etapas desta análise são mostrados na Figura 5.

Os passos críticos envolvidos na detecção de núcleo, além de realizar a tarefa de sobreposição de fronteiras esferóides correspondentes gerados anteriormente.

além dos grandes passos na detecção esferóide-membro de um núcleo qualitativamente (Figura 5), ​​temos simultaneamente quantitativamente detectou a adesão. Para isso, foi desenvolvido e implantado Algoritmo 3 (Figura 6). Para realizar o candidato de check-in Algoritmo 3, utilizamos a abordagem bounder-box para detectar se objeto Y é possivelmente dentro do objeto X ou não (Figura 7).

As principais etapas na detecção esferóide-pertença a uma núcleo são mostrados.

para realizar o candidato de check-in Algoritmo 3 para detectar principalmente se objeto Y é possivelmente dentro de objeto ou X não, usando a abordagem bounder-box. No caso de (A), Y é objecto dentro objecto X, por conseguinte, pelo menos, um canto de saca-caixa de entrada Y deve estar dentro da saca-box de X. No entanto, o, mesmo que qualquer um dos cantos do saca -box de Y é dentro de X, Y não pode realmente estar dentro de X, tais como, caso (B).

2.3 detecção e medição de intensidades de membrana e Áreas citoplasma

a informação disponível até CH-2 é esperado ter vários níveis de intensidade (sinais) em torno da membrana citoplasmática e da área do esferóide. áreas relevantes foram segmentadas, gerando o limite-máscara do esferóide nas etapas anteriores (seção 2.1). Isto permitiu-nos lidos de forma fiável a intensidade inferior da área de não-fundo e para evitar as áreas ruidosas.

Um objectivo foi analisar células baseada não só nas intensidades médias mas também sobre a distribuição de proteínas dadas. Determinar se a expressão de proteínas residem principalmente nas junções célula-célula, ou no citoplasma, vai ajudar a confirmar os níveis basais de expressão em células cancerosas e não cancerosas, e em que medida certa tratamentos tem na expressão da proteína. O algoritmo envolvidos na medição intensidades e classificação de distribuição de intensidade fornece 4 combinações possíveis grandes (Figura 8) que permitem um grau de liberdade de estudar vários padrões de distribuição de intensidade, especialmente importante para a classificação de área periférica e não-periférico. Definimos a segregação das áreas de forma automatizada e reprodutível de quatro maneiras possíveis. Eles são descritos como:.

Medir intensidades e classificação da distribuição de intensidade

i) Definir largura fixa de limite e área definida pelo limite-máscara. Esta combinação vai ler toda a área dentro da máscara e irá classificar a área medida em duas áreas distintas: “-área periférica ‘de largura

x

(variáveis) pixels dentro do perímetro ea área não-periférica restante (Figura 9).

principais etapas envolvidas na geração do-mapa ler classificado.

ii) Definir largura fixa de fronteira ea área comum da máscara e o limiar acima. Essas combinações são semelhantes à opção acima referida, que é

Número de viajantes – (

i

), exceto em vez de ler toda a área dentro da máscara, que levará em conta as intensidades que estão acima o limiar de valor atribuído. Os passos principais são mostrados na Figura 10. O limiar pode ser atribuído automaticamente usando, bem como o manual de diálogo apresentada na Figura 11. É também possível verificar visualmente o efeito. Um diálogo semelhante está disponível em ImageJ, no entanto a versão ImageJ da caixa de diálogo é limitado em passar-limiares selecionados para os plug-ins personalizados de PCaAnalyser. Assim, desenvolvemos um diálogo semelhante, mas estendida (Figura 11) para PCaAnalyser.

As principais etapas envolvidas na geração do-mapa ler classificadas via boundary-máscara e limite-máscara. Imagens retratam um esferóide DU145 cultivadas em uma matriz 3D seguinte imuno-marcação para a subunidade α6 integrina. Painéis nesta figura referem-se a intensidade do anticorpo e de distribuição da subunidade α6 integrina. Rotulagem estava presente principalmente na região periférica da estrutura esferóide.

iii) largura proporcional do centro do esferóide (objeto) por um fator y (onde), e área definida pela boundary-máscara. Ao contrário da largura fixa, esta opção determina primeiro o centro do objecto e, em seguida, aplica-se a largura proporcional ao classificar um pixel com base em se ele pertence a periférica ou a zona não periférica. O processo é mostrado na Figura 12A.

A) etapas envolvidas no processamento de mapa de ler as classificações com opções definidas para a largura proporcional e limite-máscara. Imagens retratam um esferóide DU145 em uma matriz 3D seguinte imuno-marcação para a subunidade β1 integrina. Painéis nesta figura referem-se a intensidade do anticorpo e de distribuição da subunidade de integrina β1. A distribuição de β1 manteve-se primeiramente em torno da membrana externa região /periférica do esferóide. B) Aplicação da imagem original de PCaAnalyser utilizando as funções de quebra de clump DU145 esferóide B ‘), após a ampliação do sinal do software encontradas sinais diferentes de zero entre os dois esferóides como massas e detectou-se como um único esferóide.

o periférico contra função não-periférica (Figura. 12A) foi particularmente útil para investigar o receptor de quimiocinas, CXCR4, expressão e distribuição em resposta ao ligando tratamento. Nosso objetivo foi avaliar se havia diferenças na expressão, tanto na ausência e presença de seu ligante, SDF-1α. Na ausência de SDF1α, a proteína CXCR4 só foi expressa nas regiões periféricas dos esferóides. Após o tratamento, no entanto, as alterações de expressão de CXCR4 e migra ainda mais para o meio do esferóide e foi encontrado no interior das regiões não-periféricas. Portanto, esta análise permite a validação quanto à existência ou não de uma proteína é funcional no sistema de modelo de cultura de células em 3D, ou não.

iv) proporcional largura do centro do esferóide (objecto) por um factor de y (onde ,) e área definida pelo limite-máscara e o limiar-máscara. Esta é a mesma que a combinação anterior imediato (

número

– (

iii)), com a excepção de que a leitura mapa exclui aqueles pixels que estão abaixo do valor (superior) do atribuído limiar-máscara.

Visualmente, a imagem representada na figura 12A poderia ser visto como dois esferóides separadas em estreita proximidade uns dos outros. No entanto, sabe-se que ao longo do tempo na cultura, os esferóides podem fundir e fundem-se para formar massas maiores [3]. Foi, portanto, imperativo para formular um processo que poderia verificar um único vs objeto fundido. Conseguimos isso através de um recurso chamado “falso moita-breaking” candidato. Este recurso ajuda o software PCaAnalyser para determinar se esferóides são verdadeiramente conectado ou não. O amontoado de quebra falsa é difícil de detectar visualmente, no entanto, o PCaAnalyser resolve este problema, amplificando o sinal de definir mais claramente a situação em baixo sinal existe (ou seja, falso candidato quebra-moita) (isto é, a verdadeira clump- relação existe nenhum sinal candidato de ruptura). O princípio é que a amplificação de “nenhum sinal” continuará a ser zero.