Abstract

Fundo

A autofagia tem funções paradoxais e complexos no desenvolvimento do câncer, e autofagia relacionadas genes (ATG) são reguladores chave na autofagia. Até agora, mais de 30 proteínas ATG diferentes foram identificadas em levedura, e os seus homólogos de mamífero, também têm sido relatados. Embora os papéis de algumas proteínas ATG no câncer foram identificados, o papel de ATG10 é quase completamente desconhecido.

Metodologia /Principais Achados

Para investigar o papel clínico-patológico de ATG10 no cancro colorectal, analisamos a expressão ATG10 em tecidos de câncer colorretal e linhas celulares. Análise da expressão de proteínas revelou que ATG10 é altamente aumentada no cancro colo-rectal (tecido – 18/37 casos, 48%; linha de células de linhas de células -8/12, 66%). análise imuno-histoquímica com características clinicopatológicas indicou uma forte associação do aumento da regulação do ATG10 com linfa tumor metástase (p = 0,005) e invasão (p 0,001). Além disso, tanto sobrevida livre de doença em 5 anos e as taxas de sobrevida global de pacientes com tumores que não expressam ATG10 foram significativamente maiores do que os de pacientes com tumores ATG10 expressando (p = 0,012).

Conclusão /Significado

O aumento da expressão ATG10 no câncer colorretal está associada a invasão linfática e metástases em linfonodos indicando que ATG10 pode ser um potencial tomador de prognóstico no câncer colorretal

Citation:. Jo YK, Kim SC, Parque IJ , SJ Park, Jin DH, Hong SW, et al. (2012) a expressão aumentada de ATG10 em câncer colorretal está associada a linfovascular invasão e metástases linfonodais. PLoS ONE 7 (12): e52705. doi: 10.1371 /journal.pone.0052705

editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Alemanha |

Recebido: 23 Março, 2012; Aceito: 19 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Desenvolvimento e Comercialização de Anti-Cancer Therapeutics ea Saúde Korean 21 R D Projeto (A062254 e A102059, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, Coreia), o Instituto Asan para as Ciências da Vida (2011-069 ) e do Programa de Pesquisa Ciência básica (2010-0009164, a Fundação Nacional de Pesquisa, Coreia). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A /sistema de proteassoma 26S ubiquitina é uma das principais vias que regulam o turnover de proteína nas células. A autofagia é o mecanismo em grande parte responsável pela remoção de proteínas de longa duração e volume de negócios maior parte dos componentes citosólicos. Autofagossomas são vesículas de dupla membrana que engolir substratos alvo e se fundem com os lisossomos para produzir autolysosomes [1]. formação Autophagosome é regulada por uma família de genes relacionados evolutivamente conservada-autofagia (ATG) proteínas [2], [3].

ubiquitina (Ub) conjugação é um evento bem coordenada que requer E1, E2, e enzimas E3 [4]. Dois sistemas de conjugação de proteínas, que são semelhantes aos envolvidos na ubiquitinação de proteínas, são necessários para vesículas autofágicos [3]. ATG7 age como um E1-como enzima de activação, ligação a Atg8 /LC3 ou ATG12. Atg8 ou ATG12 activado é então transferida para as enzimas de conjugação E2-like, ATG3 e ATG10. Finalmente, o Atg8-fosfatidiletanolamina (PE) e os conjugados ATG12-Atg5 são formados. As formas conjugadas ATG12-Atg5 um complexo com ATG16 para actuar como uma enzima E3, como para o conjugado Atg8-PE, que se liga à membrana autophagosome através de uma reacção de lipidação [2]. As mutações nos locais de ligação de ATG7 ATG10 e evitar a formação do conjugado ATG12-Atg5 [5]. Porque autofagia está envolvida em muitos processos celulares e homeostase, da desregulação deste sistema parece desempenhar um papel em várias condições patofisiológicas humanos tais como a doença neurodegenerativa, diabetes tipo 2, doença infecciosa, doença imune inato, bem como cancro [6].

Como outras doenças, o papel da autofagia no câncer é bastante complexa. Estudos recentes têm demonstrado que a infra-regulação de genes de ATG (ou os seus reguladores) directa ou indirectamente acelerar o desenvolvimento de tumores [7], [8]. Além disso, diminuiu a autofagia aumenta a inflamação dependente de necrose, promover ainda mais o desenvolvimento do tumor [9]. No entanto, outros estudos sugerem que o aumento da autofagia também pode auxiliar o desenvolvimento do tumor. Com efeito, autofagia promove a sobrevivência de células após tensões através da regulação da homeostase metabólica. As células tumorais têm de sobreviver em hipoxia e de dissociação a partir de células vizinhas. Assim, poderia promover autofagia tumorigénese e metástase, aumentando a sobrevivência de células de tumor [7], [10]. Até à data, mais de 30 proteínas ATG diferentes foram identificadas em levedura, e os seus homólogos de mamífero também foram também relatadas [5], [11]. Apesar das funções de algumas proteínas ATG no cancro foram caracterizados, o papel de ATG10 é quase completamente desconhecidos. Aqui, foi avaliada a relação entre a expressão ATG10 e as características clinicopatológicas de carcinoma colorretal esporádico. Nossos resultados mostram que o aumento da expressão ATG10 é fortemente associada com metástases em linfonodos e invasão linfática no cancro colorectal.

Resultados

ATG10 Up-regulação no câncer colorretal

Para avaliar ATG10 expressão em cancro colo-rectal, analisamos primeiro os tecidos de câncer colorretal por Western blot. Os tecidos tumorais e seus tecidos circundantes normais foram obtidos no momento da cirurgia. O resultado mostrou que a expressão ATG10 em tumores foi significativamente maior do que a da mucosa normal adjacente. ATG10 foi aumentada em 18 dos 37 casos (48%) do cancro colo-rectal (Fig. 1a). Em seguida, examinaram a expressão ATG10 em linhas de células colorretal. Consistente com os resultados obtidos utilizando tecidos tumorais, ATG10 expressão foi mais elevada em linhas celulares de cancro incluindo AMC5, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO e CaCo2 do que na linha celular colorrectal normal de CCD841 (Fig. 1b). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que ATG10 é sobre-regulada no cancro colo-rectal

(a) Expressão em tecidos colorrectais ATG10 foi avaliada por análise de Western blot (n = 37;. T, tecido de tumor; N, correspondente normais tecido). ATG10 expressão foi normalizado para a expressão de actina (n = 37). (B) análise de Western blot de expressão ATG10 em várias linhas de células colorretal (Normal – CCD841; Cancer – HCT116, HT29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO, CaCo2). expressão ATG10 foi quantificada por densitometria.

Relação entre ATG10 Expressão e progressão tumoral e invasão

Além disso, investigamos o papel de ATG10 na progressão tumoral e invasão. Para examinar características clinicopatológicas, análise imuno-histoquimica de uma matriz de tecido com 127 espécimes de cancro colorrectal foi realizada (fig. 2 e Tabela 1). Tecidos sem manchas ou coloração fraca (≤10%) foram classificados como negativo (-). Tecidos com 10% da coloração foram categorizados como positivo (+). Trinta dos espécimes tumorais 127 (24%) mostraram expressão ATG10. A relação entre expressão e clínico-patológicas características ATG10 é mostrada na Tabela 2. Os resultados mostraram que a expressão ATG10 foi altamente associado a invasão linfática (

P Art 0,001) e metástases em linfonodos (

P

= 0,005). No entanto, a expressão ATG10 não foi significativamente associada com a idade, sexo, local do tumor, antígeno carcinoembrionário soro ou proliferação do tumor. Estes resultados demonstram que a expressão ATG10 está fortemente associada com a invasão linfovascular no cancro colorectal.

O padrão de expressão ATG10 no cancro colorectal foi determinada por análise imuno-histoquímica de um tissue microarray. (A e B) espécimes negativo (-) com ≤10% da coloração (200), (c e d) amostras com% da coloração 10% a 50 (+, × 200) e (E e F) amostras com 50 % da coloração (+, × 200).

relação entre a expressão ATG10 e paciente sobrevivência

os resultados da análise imuno-histoquímica mostrou que ATG10 está intimamente associada com a invasão do tumor, o que é conhecido fator de risco para a recorrência e sobrevivência resultados. Assim, foi avaliada a relação entre a expressão ATG10 e as taxas de sobrevivência de 5 anos livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS) em doentes com câncer colorretal. Os 5 anos DFS e OS taxas de pacientes com tumores que não expressam ATG10 foram significativamente maiores do que os de pacientes com tumores ATG10 expressando (OS 5 anos [média ± SEM], 76,4 ± 0,4%

vs

57,5 ​​± 0,1%,

P

= 0,012;. 5 anos DFS, 75,8 ± 0%

vs

42,8 ± 0,1%,

P

= 0,012) ( Fig. 3). Estes resultados sugeriram que ATG10 pode ser um potencial máquina de prognóstico no cancro colo-rectal. Em uma análise multivariada com as variáveis ​​de sobrevivência potenciais, linfonodo metástases sozinho foi significativamente associadas aos parâmetros de sobrevivência, enquanto que a expressão ATG10 não era (hazard ratio, 4,736

vs

1.404;. 95% intervalo de confiança, 1,763-12,723

vs

0,676-2,916;.

P

= 0,002

vs

0,363)

A relação entre a expressão ATG10 e sobrevida livre de doença em 5 anos (. DFS) e sobrevida global (OS) taxas de doentes com cancro colorectal foram analisadas por curvas de Kaplan-Meier.

Down-regulação da ATG10 suprimiu a proliferação celular em células de câncer colorretal

Nós ainda mais examinaram o efeito da sub-regulação de ATG10 sobre a proliferação celular em células HCT116. Depleção de expressão ATG10 por interferência de ARN suprimido ligeiramente a taxa de proliferação celular em células HCT116, sugerindo que ATG10 tem um papel funcional na proliferação celular (Fig. 4).

células HCT116 foram transfectadas transientemente com quer mexidos siARN negativo (Scram) ou siARN ATG10 específica (siATG10), em seguida, a taxa de proliferação de células foi determinada diariamente utilizando um kit de ensaio CCK-8 (a). A infra-regulação de ATG10 por siARN foi confirmada com a análise de Western blot (b). Os dados são representados pela média ± SEM (n = 3).

Discussão

Autophagy é controlado por proteínas ATG e os seus reguladores [5], [8]. proteínas ATG iniciar a formação de autophagosome através do sistema de conjugação autophagic [2]. O papel de ATG6 em cancro tem sido caracterizado. Estudos anteriores relataram que a diminuição ATG6 expressão promove tumorigênese em modelos animais, e ATG6 é regulada em vários cancros humanos [12] – [15]. No entanto, o papel de outras proteínas ATG na tumorigênese não é bem compreendida.

Neste estudo, avaliamos a expressão ATG10 em pacientes com câncer colorretal esporádico. ATG10 é uma enzima E2 semelhante envolvida na modificação Ub-like, que é essencial para a formação autophagosome. Estudos anteriores relataram que vários sobre-expressos Ub-E2 como proteínas promover o desenvolvimento do tumor em vários tipos de câncer [16] – [18]. No entanto, ainda não foi avaliado o papel de ATG10 no cancro. Ao contrário ATG6, que é regulada no cancro, os presentes resultados indicam que ATG10 é aumentada no cancro colorectal. Além disso, a expressão ATG10 foi fortemente associada à invasão tumoral e metástase. Nossos resultados sugerem que ATG10 pode ser uma proteína oncogénica. Também foram avaliados os efeitos da sobre-expressão ATG10 sobre a proliferação celular e num modelo de xenoenxerto de ratinho utilizando células de carcinoma que expressam estavelmente ATG10 RKO. A proliferação celular e o crescimento tumoral não foi significativamente influenciada pela expressão ectópica de ATG10 (dados não mostrados). No entanto, knock-down de expressão ATG10 com siRNA suprimida taxa de proliferação celular em células HCT116. Assim, continuamos a investigar o efeito de sobre-regulada ATG10 na tumorigênese.

As alterações genéticas são responsáveis ​​pelo aumento da expressão de muitas proteínas oncogênicos. A região cromossômica de ATG10 (5q14) é frequentemente perdido no câncer de ovário, câncer gástrico e câncer de mama [19], [20]. No entanto, estudos recentes de microarranjos de DNA do genoma revelaram que a região 5q14 é amplificado em neurofibrossarcoma e cancro pancreático [21], [22]. variações no número de cópias em 5q14 em câncer colorretal não são bem compreendidos. Assim, futuros estudos são necessários para determinar alterações alélicas neste locus no cancro colorectal.

A autofagia parece ter funções duplas no cancro. Em particular, a temporização da autofagia pode ser importante para o desenvolvimento do tumor. Na fase inicial de desenvolvimento de neoplasias, autofagia parece funcionar como um supressor do tumor. Como resultado, inibindo autofagia aumenta o dano do ADN, alterações cromossómicas tais como perda alélica e de ganho, e o stress oxidativo, o que poderia levar a acontecimentos oncogénicos [23], [24]. No entanto, também promove autofagia tumorigénese. indução de autofagia pelo desprendimento da sobrevivência celular assistências matriz extracelular do tumor durante anoikis, o que contribui para a divulgação e metástase [25], [26]. De acordo com estes estudos anteriores, nossos resultados mostraram que a expressão ATG10 está intimamente associada com linfovascular invasão e metástase ganglionar no cancro colorectal. Estes resultados podem ser explicados pela ligação de nodos substituído-tumorais ou agregados tumorais intravasculares com nódulos linfáticos sistémicas através de canais linfovascular [27], [28]. invasão de tumores e metástases são conhecidos fatores de risco para a recorrência e evolução sobrevivência. De acordo com esta noção, descobrimos que a expressão ATG10 em tumores foi associado com menores taxas de sobrevivência. No entanto, a relação entre ATG10 expressão e clínicos resultados devem ser confirmados com um grupo maior para melhor compreender o papel da ATG10 no câncer.

Em conclusão, ATG10-regulação no câncer colorretal está intimamente associada com a invasão linfática e linfonodo metástases, indicando que ATG10 pode ser útil como um marcador de prognóstico e como um alvo terapêutico no cancro colorectal.

Materiais e Métodos

pacientes e Tumor amostras

Para avaliar expressão ATG10, 37 amostras de tecido de cancro colorrectal foram escolhidos aleatoriamente a partir de amostras de arquivo de ressecções realizados entre junho de 1999 e maio de 2003 no Centro Médico Asan (Seul, Coréia). Para a validação clínica subsequente de padrões de expressão diferencial de proteínas, foram avaliadas amostras de tumor de um total de 124 pacientes com câncer colorretal esporádico, incluindo pacientes submetidos a ressecção com intenção curativa (ressecção R0, n = 119; R1 ressecção, n = 5) (Tabela 1). Os pacientes com câncer colorretal hereditário sem polipose ou polipose adenomatosa familiar foram excluídos, bem como aqueles que foram submetidos a quimioradioterapia pré-operatória. Recorrência, incluindo metástases regionais e à distância, ocorreu em 22 dos 124 pacientes (17,7%) que se submeteram à ressecção curativa durante o acompanhamento (média de 58 meses, variando de 3-123 meses). Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito, e o protocolo do estudo foi aprovado pelo IRB (Institutional Review Board), em conformidade com a Declaração de Helsinki.

Linhas de Células e reagentes

células CCD841 foram gentilmente fornecida pelo Dr. SY Rha (Universidade Yonsei, Seul, Coreia) [29]. A linha celular foi derivada AMC5 como previamente descrito [30]. E outras linhas celulares de cancro, tais como HCT116, HT29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO e CaCo2 foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora e mantidas em meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Western análise de mancha

proteínas de tecidos e as células foram preparadas utilizando tampão de amostra de proteína (Tris-HCl a 62,5, 25% de glicerol, 2% de SDS, 5% de 2-mercaptoetanol, 0,01% de azul de bromofenol) (BioRad, Hercules, CA). As proteínas (aproximadamente 50 ug) foram quantificadas por meio de uma solução de Bradford (BioRad) de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (BioRad). As membranas foram incubadas com anticorpos primários contra ATG10 (1:3000; MBL, Nagoya, Japão) e actina (1:10,000; Chemicon International, Temecula, CA). As membranas foram então incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. (1:5000; Pierce, Rockford, IL):

imuno-histoquímico de coloração

blocos de matriz de tecido foram preparadas usando um instrumento de precisão (Instruments Beecher , Sun Prairie, WI). coloração imuno-histoquímica com base no método de estreptavidina-biotina marcado foi levada a cabo usando um kit Dako LSAB (Dako, Carpinteria, CA) com anticorpos monoclonais ATG10 (MBL). coloração fraca (≤10%) e não a coloração foram marcados como negativos (-), e 10% da coloração foi classificada como positiva (+). As amostras com coloração imunoquímico negativos foram examinados duas vezes para verificar os resultados.

Proliferação Celular Ensaio

pequeno RNA de interferência para ATG10 (siATG10, siGENOME piscina inteligente) e mexidos controle não-targeting siRNA (Scramble) foram sintetizados por Dharmacon, Inc. (Thermo Scientific, Chicago, IL). As células HCT116 foram transfectadas com 0,5 mmol /L de siATG10 ou mexidos siARN com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em seguida, a taxa de proliferação celular foi medida utilizando um kit de ensaio de proliferação celular (CCK-8) de acordo com o protocolo do fabricante (Dojindo Corporation, Japão). Resumidamente, as células em placas de 96 poços foram misturados com 10 ul de solução de CCK-8, e em seguida foram incubadas durante uma hora em um de CO

2 incubadora. A mudança colorimétrico posterior foi medida utilizando um leitor Victor microtitulação placa (PerkinElmer) definido para monitorar as mudanças na absorvância a 450 nm.

Análise Estatística

Análise de Cross-tabela usando o teste exato de Fisher, com dois verificação unilateral foi utilizado para comparar os achados imuno-histoquímica de acordo com as características clínicas e incidência da recorrência dos pacientes. endpoints primários foram recorrência, de 5 anos DFS, e OS de 5 anos. As taxas de sobrevivência foram comparadas pelo método de Kaplan-Meier com o teste log-rank, e os fatores de sobrevivência potentes foram verificadas utilizando o modelo de regressão de Cox. O nível de significância de 5% foi escolhido para cada análise. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS (versão 19; SPSS Inc., Chicago, IL).