Abstract

O desenvolvimento de resistência a gemcitabina é uma grande preocupação na terapia do cancro da bexiga, e o mecanismo permanece obscuro. Eg5 foi recentemente identificada como um alvo atraente na quimioterapia do cancro, tão novo alvo quimioterapia com inibidor eg5 é esperado para melhorar o efeito anticancerígeno no cancro da bexiga gemcitabina-resistente. Nesta pesquisa, as células RT112-GR foram 350 vezes menos sensível a gemcitabina do que as linhas celulares parentais, enquanto que as células KU7-GR foram de 15 vezes menos sensível a gemcitabina do que as linhas celulares parentais. análise OneArray Microarray humano foi realizada para obter informações de largo espectro sobre os genes expressos diferencialmente em células RT112 e RT112-GR. A actividade anti-proliferativa de S (MeO) TLC, um inibidor de Eg5, foi analisada em linhas celulares RT112-GR utilizando um ensaio de viabilidade celular. Além disso, o efeito inibitório foi avaliada in vivo usando o modelo de tumor xenoenxerto subcutâneo. De acordo com o resultado de OneArray® Humano GeneChip, RRM1 e RRM2 foram up-regulada, enquanto não houve mudança significativa na Eg5. Trypan coloração azul confirmou que na combinação S viabilidade celular grupo (MEO) TLC S (MEO) TLC e gemcitabina foram significativamente menores em células RT112-Gr, em comparação com outros grupos. S (MEO) TLC e S (MEO) TLC + grupos gemcitabina proeminente suprimiu o crescimento do tumor em comparação com outros grupos ‘in vivo. Não houve diferenças significativas em C (MeO) TLC e gemcitabina + grupo S (MeO) CCF em o efeito de inibição do cancro da bexiga in vivo e in vitro. Os nossos dados demonstram colectivamente que S (MEO) TLC representa uma nova estratégia para o tratamento de câncer de bexiga resistente gemcitabina

Citation:. Sun L, Lu J, Niu Z, Ding K, Bi D, Liu S, et ai. (2015) A Estratégia quimioterápico Potent com Eg5 inibidor contra a gemcitabina resistente do cancro de bexiga. PLoS ONE 10 (12): e0144484. doi: 10.1371 /journal.pone.0144484

editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos

Recebido: 16 Outubro, 2014; Aceito: 19 de novembro de 2015; Publicação: 10 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Sun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Temos carregado os dados para ArrayExpress. Dados Revisão URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelas doações da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81.202.017) (https://www.nsfc.gov.cn), a Fundação de Ciência Natural da província de Shandong (No. ZR2011HQ027 e No. ZR2014HQ041) (https://www.sdnsf.gov.cn) e a Fundação de Ciência e Tecnologia de Investigação da província de Shandong (No. 2012YD18049) (https://www.sdnsf.gov.cn). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga (BCA) representa o quarto câncer mais comum nos Estados Unidos [1,2]. Aproximadamente 25% dos pacientes com câncer de bexiga são diagnosticados com câncer de bexiga músculo-invasivo (CINM), embora 75% dos tumores diagnosticados recentemente são não-muscular invasiva (Ta, Tis e T1); a maioria deles se repetem e 15-20% de progresso para invadir a túnica muscular. E a grande maioria das mortes específicos do cancro são devidos a MIBC, levando a invasão local e a metástase distante [3, 4]. A mortalidade da doença insta urologistas para explorar novos métodos para o tratamento de cancro da bexiga [5]. A quimioterapia com gemcitabina e cisplatina é a opção mais popular para câncer de bexiga. A gemcitabina é um análogo da desoxicitidina com elevada actividade contra vários tipos de tumores sólidos, incluindo pâncreas, do colo do útero, ovário, mama, bexiga, e cancros do pulmão de células não pequenas [6,7]. No entanto, o desenvolvimento de resistência a gemcitabina é agora uma das principais preocupações para urologistas. Apesar de uma taxa de resposta razoável após a quimioterapia inicial em pacientes com câncer de bexiga metastático, 60-70% dos pacientes que respondem recaída no primeiro ano, com uma sobrevida média de 12-14 meses. Esta eficácia limitada pode ser devido à resistência a drogas de novo e o desenvolvimento do fenótipo resistente à droga, durante o tratamento celular [8].

No entanto, os mecanismos subjacentes da indução de resistência à quimioterapia por gemcitabina permanecem desconhecidos. Recentemente, através do estudo de câncer pancreático, Nakahira S et al relataram um fator importante na resistência gemcitabina foi a superexpressão de ribonucleótido-redutase (RR) [9]. RR consiste nos grandes e pequenas subunidades dimerizada, M1 e M2, respectivamente. A subunidade M1 possui um local de ligação para a regulação da enzima (subunidade reguladora), e a subunidade M2 ​​está envolvido com actividade de RR (subunidade catalítica) [10]. RRM1 é suposto ter um papel na resistência gemcitabina da variedade de cancro como enzimas metabólicas do fármaco [9, 11]. RRM1 não é apenas um alvo celular de gemcitabina, mas também um supressor de tumor. estudos pré-clínicos demonstraram o seu envolvimento na supressão da proliferação de células de cancro, migração, e metástase [12, 13]. Em alguns tipos de cancro, um elevado nível de ARNm RRM2 se correlaciona com a resistência quimioterapêutico, capacidade de invasão celular e prognóstico insatisfeito, sugerindo que RRM2 contribui para a progressão maligna e é um alvo terapêutico potencial. No entanto, há pouca informação a respeito RRM1 e expressão da proteína RRM2 no cancro da bexiga, e para nosso conhecimento há relatos existem descrevendo o papel de RRM no processo de resistência a drogas em câncer de bexiga. Além disso, alguns estudos recentes têm indicado que RRM desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão de carcinomas humanos, mas o significado clínico de expressão em MRR BCa permanece obscura.

Por outro lado, é de grande importância para investigar nova estratégia quimioterapêutico de cancro da bexiga. drogas específicas no tratamento de tumores do trato urinário nos últimos anos mostraram resultados promissores. Nossos primeiros estudos descobriram que os inibidores Eg5 como drogas alvo in vivo e in vitro de tratamento de câncer de próstata e câncer de bexiga deve ter efeitos curativos satisfatórios [14, 15]. Eg5, uma molécula-chave envolvido na formação de fusos bipolares, é uma das enzimas-alvo mais atractivos na descoberta de drogas anti-mitótico [16]. contas Eg5 para muitos dos movimentos do fuso e cromossomas em células que se dividem e se localiza o eixo em células mitóticas dividindo [17]. Uma característica interessante do Eg5 é que ela localiza a microtúbulos na mitose, mas não para a interfase microtúbulos, o que sugere que um inibidor de Eg5 podem ser úteis para atingir especificamente a proliferar o tecido do tumor [18]. Vários tipos de químicos pequenos inibidores de Eg5 molécula têm sido relatada [16]. S- (4-metoxitritil) -L-cisteína (S (MeO) TLC), um derivado de S-trityl- L-cisteína (STLC), podem inibir especificamente Eg5, e induzir a formação do fuso mitótico monopolar [14, 15]. Avaria da função de Eg5 leva à paragem do ciclo celular na mitose com matrizes de microtúbulos monoastral. O papel importante de Eg5 em progressão mitótica torna um candidato atraente para o desenvolvimento de terapia direcionada cancro em [19]. No entanto, não há nenhum estudo do tratamento inibidor Eg5 de câncer de bexiga resistente gemcitabina.

Neste estudo, uma linha de células de câncer de bexiga humana gemcitabina resistente foi estabelecido, eo papel da RRM1 e RRM2 no desenvolvimento da gemcitabina resistência foi inicialmente investigada. Nós também avaliou a eficácia do efeito anticancerígeno de Eg5 terapia-alvo in vitro e in vivo, com o objetivo de oferecer uma melhor estratégia de tratamento clínico para pacientes com câncer de bexiga resistente gemcitabina.

Materiais e Métodos

ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal de Provincial Hospital Filiado à Universidade de Shandong (número de autorização: 2013-026). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. tecidos de cancro da bexiga foram coletadas de Shandong Provincial Hospital Filiado à Universidade de Shandong. Antes do estudo, o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Provincial Filiado à Universidade de Shandong (Permit Number: 2012-033). consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes.

Células, reagentes e amostras

linha de células de câncer de bexiga RT112 clínica e KU7 foram utilizados neste estudo e cultivadas como descrito anteriormente [14,20]. linhas de células RT112 e KU7 foram adquiridos a partir de banco de células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). células RT112 e KU7 foram utilizados principalmente no seguinte estudo, que se originam de cancro da bexiga não invasivo. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina, e incubadas a 37 ° C com um humidificada com 5% de CO

2 atmosfera.

Os inibidores de Eg5, S (MeO) TLC foram adquiridos a Bachem (Bubendorf, Suiça) e foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO). Anticorpo anti-RRM1 e anti-RRM2 (coelho) foi adquirida da Abcam (EUA); IRDye 800CW cabra conjugado anti-IgG de coelho eram de LI-COR Biosciences (EUA). Prime kit de RT-PCR Script foi adquirido da Takara (China). TRIzol foi adquirido de Invitrogen (EUA).

140 casos de tecidos de cancro da bexiga foram coletadas de Shandong Provincial Hospital Filiado à Universidade Shandong de dezembro de 2005 a março de 2007. A radioterapia, quimioterapia e imunoterapia não foram realizadas antes da cirurgia e todas as amostras foram verificadas por duas patologias após a cirurgia.

o estabelecimento de linhas celulares gemcitabina resistente

células gemcitabina-resistentes foram desenvolvidos pela crónica, a exposição repetida a gemcitabina que a cultura de gradiente. A linha de células resistentes estabelecida foi mantida em meio contendo 45 nmol /L de gemcitabina. Para todos os estudos, as células resistentes foram cultivados em meio isento de drogas durante 1 semana para remover a gemcitabina. gemcitabina células resistentes são referidos como células RT112-GR e KU7-Gr. IC50 de células RT112 gemcitabina resistente à gemcitabina é 4.2umol /L. IC50 de células KU7 gemcitabina resistente à gemcitabina é 0.285umol /L. Então, nós escolhemos células RT112-GR como um assunto nas experiências seguintes.

OneArray Microarray Humano

O RNA total foi extraído por Trizol reagente (Invitrogen, Xangai, CN) e enviado para o Biotech Phalanx grupo (Xangai, NC) para análise da expressão de microarray. hibridações em triplicado para cada amostra foram realizadas utilizando o Human todo o genoma OneArray 6.1.

RRM1 e análise de expressão RRM2 por IHC

A análise imunohistoquímica foi realizada para analisar RRM1 e expressão RRM2 no cancro da bexiga, como descrito previamente [21]. Os anticorpos anti-anti-RRM1 e RRM2 foram ambos utilizados numa diluição de 1: 100. Os controlos negativos consistiram de lâminas em que o anticorpo primário foi omitido. Capas foram avaliados como tendo coloração positiva se 10% do citoplasma das células tumorais foi corado. o grau do tumor eo estágio foram avaliados utilizando hematoxilina padrão e eosina (H E). coloração

A inibição da RRM1 /2 expressão de RNA de interferência

Células

RT112-GR (2×10

5) foram semeadas em placas de 6 poços em triplicado e 12h após a incubação, as células foram transfectadas com várias concentrações de siRNA usando HiPerfect Reagent (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O pequeno RNA de interferência usadas para segmentar sequência RRM1 /mRNA 2 foi sintetizado pela Qiagen.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular após o tratamento com inibidores Eg5 foi avaliada utilizando o 3- (4, 5- dimetiltiazol-2-il) -2, brometo (MTT) 5-difeniltetrazólio, como descrito anteriormente [20]. As células (2 x 10

3) foram semeadas em placas de 96 poços e incubou-se durante 24 h. Depois disso, a gemcitabina, S (MeO) TLC, gemcitabina + S (MeO) TLC e veículo (DMSO) foram adicionados na concentração indicada em poços em triplicado e a viabilidade celular foi medida após 24 h, 48 h e 72 h de tratamento, respectivamente . As concentrações de inibição do crescimento celular de 50% (IC50) foram calculados de acordo com SPSS17.0 Software.

Hoechst coloração

Após a administração com gemcitabina 45nm, 0,5 uM S (MEO) TLC, gemcitabina 45nm + 0,5 uM S (MeO) TLC ou veículo durante 24 h, 48h e 72 h, as células RT112-GR foram coradas com uma solução a Hoechst 33342 mM (Santa Cruz, Dallas, EUA) para a coloração nuclear e analisadas com um microscópio de fluorescência. As células com a condensação típico e fragmentação dos núcleos foram visualizados e identificados como células apoptóticas.

Reversa-PCR A análise da transcrição

e expressões RRM1 RRM2 em linhas celulares de cancro da bexiga foram determinados por RT-PCR análise usando métodos padrão tal como descrito anteriormente [22]. O ARN total foi extraído a partir de sedimentos de células RT112 e RT112-GR utilizando o reagente TRIzol e amplificado por transcrição reversa-PCR (RT-PCR) de acordo com as instruções do fabricante, respectivamente. Um gene de manutenção, fosfato desidrogenase glyceraldehydes (GAPDH), foi usado como um controle endógeno. GAPDH e RRM1 e RRM2 primers foram construídos usando Primer 5 Software e verificado por análise de sequenciamento de DNA. GAPDH (1382 pb) iniciadores foram: Forward: 5′-GATGCTGCGCCTGCGGTAGA-3′, Reverso: 5′-TTGGTTGAGCACAGGGTAC-3′; RRM1 (391bp) iniciadores foram: Forward: 5′-GTTGTATTCGGGCTACTGG-3′, Reverso: 5′-ACTTTGCGGACACGACCT-3′; RRM2 (882bp) iniciadores foram: Forward: 5′-GCCGCTTTGTCATCTTCC-3′, Reverso: 5′-TCCTCTGATACTCGCCTACT-3′. Os produtos de PCR foram, em seguida, a electroforese em 1,0% gel de agarose e visualizados por um transiluminador. A intensidade de pixel para cada banda foi determinada utilizando o AlphaImager

TM2200.

experimento animal

sexo feminino camundongos BALB /c nus seis a oito semanas de idade foram adquiridos a partir Vital River Company (Beijing, China). O estudo foi obtido a aprovação da Comissão da Investigação animal de Shandong Hospital Provincial da Universidade de Shandong e nosso cuidado estava em conformidade com as orientações da instituição.

Para modelos de xenotransplante subcutâneos, cerca de 4 × 10

6 RT112-Gr (células suspensas em 100 ul de PBS) foram inoculadas por via subcutânea em ambos os flancos por ratinho, tal como descrito anteriormente [23]. O volume do tumor foi calculado como se segue: volume = Largura

2 × comprimento /2. Quando os tumores eram palpáveis ​​e mensuráveis ​​(cerca de 50 mm

3), 20 ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e tratados uma vez por dia (cinco dias por semana) por injecção intraperitoneal com DMSO (controlo de veículo), 20 mg /kg S (MeO ) TLC, 50 mg /kg de gemcitabina, ou 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg de gemcitabina, durante 5 dias. Ratos pesa corpo e os tamanhos do tumor foram medidos a cada dois dias. Os outros ratos foram sacrificados no 21º dia após o tratamento inicial, e tumores também foram excisadas e parafina-embedded para a H . E coloração

A análise estatística

A importância das relações entre RRM1 e expressão RRM2 e os parâmetros clínico foi avaliada utilizando testes de qui-quadrado e ANOVA de duas vias. As médias foram comparadas usando

t

um teste de Student bilateral e a actividade inibidora de S (MeO) TLC e gemcitabina em modelos de xenoenxerto foram realizadas com um ANOVA de duas vias seguido pelo teste S-N-K. SPSS 17.0 software foi utilizado como a análise estatística.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

análise de expressão gênica global em linhas de células RT112 e RT112-GR

células

RT112-GR foram 350 vezes menos sensível a gemcitabina que as linhas celulares parentais, que IC50 foi de 4,2 pmol /l na primeira. células KU7-GR eram 15 vezes menos sensível a gemcitabina do que as linhas celulares parentais, que IC50 foi 0.285umol /l em primeiro. Microarray Analysis foi realizada para obter informações de largo espectro sobre os genes expressos diferencialmente em células RT112 e RT112-GR. Os ARN obtidos a partir de células RT112 e RT112-GR foram amplificados, fragmentado, marcado e hibridado para microarranjos GeneChip. Dos 55752 genes representados no OneArray® GeneChip Humana, 442 mostraram significativamente up-regulada e 235 sub-regulada. Entre eles, P-valor (expresso diferencialmente) de RRM1 é 0,046, 0,021 e RRM2 é, enquanto EG5 (KIF11) é 0,323. Nossos resultados de microarray foram carregados com sucesso em um repositório público chamado ‘ArrayExpress’, Dados Revisão URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/

Clustering foi realizado para visualizar as correlações entre as repetições e as condições da amostra variando. Um subconjunto de genes diferenciais foram selecionados para análise de agrupamento. Um filtro de intensidade foi usado para selecionar genes onde a diferença entre os valores máximos e mínimos de intensidade superior a 1000 entre todos os microarrays. Para este projeto microarray, o número de genes em cluster foi 227 (Fig 1).

Clustering foi realizada para visualizar as correlações entre as repetições e as condições da amostra variando. genes para cima e para baixo-regulados são representados em cores vermelho e verde, respectivamente. Um subconjunto de genes diferenciais foi selecionado para Cluster análise. Um filtro de intensidade foi usado para selecionar genes onde a diferença entre os valores máximos e mínimos de intensidade superior a 1000 entre todos os microarrays. Para este projeto microarray, o número de genes em cluster foi 227.

RRM1 e análise de expressão RRM2 em tecidos de cancro da bexiga e linhas celulares

A análise imunohistoquímica foi realizada para testar a expressão RRM1 e RRM2 em amostras cirurgicamente ressecados de câncer de bexiga. RRM1 e RRM2 coloração estava localizada no citoplasma. Havia 98 do sexo masculino e 42 do sexo feminino, com 65 casos de baixo grau e 75 casos de alto grau em grau histológico. A reactividade da coloração anti-anti-RRM1 e RRM2 foram mostrados na Tabela 1 e Figura 2, respectivamente. A análise de RT-PCR foi representada graficamente para identificar RRM1 ARNm e a expressão de ARNm em RRM2 RT112 e linhas celulares RT112-GR. RT-PCR demonstrou que mais células Gr-RT112 tiveram aumentos significativos nos níveis de ARNm e RRM1 RRM2 em comparação com as células parentais (

P

0,001)., Respectivamente (Figura 3)

a: coloração imuno-histoquímica de RRM1 e RRM2 em tecidos clínicos. RRM1 e RRM2 imunocoloração foi considerada positiva se o 10% do citoplasma das células cancerosas mostrou fraca intensidade ou maior. (I) alta expressão de RRM1 no cancro da bexiga clínica. (II) a expressão baixa de RRM1 no cancro da bexiga clínica (III) a expressão alta de RRM2 no cancro da bexiga clínica. (Ⅳ) Baixa expressão de RRM2 no cancro da bexiga clínica (todos os valores foram capturados em 400 × ampliação). B: (I) o gráfico de barras ilustra combinado imunocoloração pontuação para a expressão RRM1 de acordo com o grau do tumor. (II) o gráfico de barras ilustra combinado imunocoloração pontuação para a expressão RRM2 de acordo com o estágio do tumor (A cor de preto e cinza representam fracamente e fortemente positiva, respectivamente).

RT-PCR para RRM1 e mRNA RRM2 expressão em linhas celulares de cancro da bexiga. GAPDH serviu como controlo de carregamento. gráfico de barras ilustra RRM1 e expressão de mRNA RRM2 em linhas celulares de cancro da bexiga siRNA-RT112-GR RT112, RT112-Gr e. (

p Art 0,001).

Knockdown mediada por siRNA de RRM1 /2 em células de câncer de bexiga RT112-GR

Para avaliar os efeitos de RRM1 /2 em linhas celulares de cancro da bexiga RT112-GR, gene RRM1 /2 foram Knockdown, respectivamente (Fig 3). células RT112-GR foram deixados sem tratamento ou foram tratados com 45nm gemcitabina (GEM), Knockdown RNAi mediada por RRM1 e RRM2 em células de câncer de bexiga RT112-GR foram deixados sem tratamento ou foram tratados com 45nm gemcitabina (GEM). Setenta e duas horas mais tarde, a viabilidade foi analisada por coloração com azul de Tripano. Queda de RRM1 e RRM2 + GEM RNAi-mediada, efeito inibidor do tumor é o melhor entre os quatro grupos. A quantificação de cada valor é a partir de experiências independentes em triplicado (Figura 4). As células

RT112-GR foram deixadas sem tratamento ou foram tratadas com 45 nm gemcitabina (GEM), knockdown RNAi-mediada de RRM1 (A) e RRM2 (B ) em células de câncer de bexiga RT112-GR foram deixados sem tratamento ou foram tratados com 45nm gemcitabina (GEM). Setenta e duas horas mais tarde, a viabilidade foi analisada por coloração com azul de Tripano. Queda de RRM1 (A) e RRM2 (B) + GEM RNAi-mediada, efeito inibidor do tumor é o melhor entre os quatro grupos. A quantificação de cada valor é a partir de experiências independentes em triplicado. (

p Art 0,01).

efeitos antiproliferativa de S (MEO) TLC e gemcitabina em linhas celulares de cancro da bexiga gemcitabina-Resistant

Para avaliar a anti efeitos -proliferative de gemcitabina e S (MEO) CCF em linhas celulares de cancro da bexiga RT112-Gr, eles foram deixados sem tratamento ou foram tratados com gemcitabina 45nm, 0,5 uM S (MEO) TLC ou os dois juntos (gemcitabina + S (MEO) TLC) em 24 horas, 48 ​​horas e 72 horas, respectivamente. A gemcitabina e S (MeO) TLC suprimiu o crescimento celular de um modo dependente do tempo e exibido o carácter supressão mais proeminente nas 72 horas. Os IC50s de RT112 e RT112-Gr contra a gemcitabina em 72 horas foram 0.012μM e 4.2μM, enquanto IC50 de RT112 e RT112-Gr contra S (MEO) TLC foram 210μM e 290μM, respectivamente (Fig 5).

a: Os IC50s de gemcitabina em KU7, KU7-Gr, RT112 e RT112-Gr em 72 horas. B: Os IC50s de S (MEO) TLC de KU7, KU7-Gr, RT112 e RT112-Gr em 72 horas. C: KU7-GR e RT112-GR células foram deixados sem tratamento ou foram tratados com 45nm gemcitabina (GEM), 0,5 uM S (MEO) TLC ou os dois juntos (GEM + S (MEO) TLC). Setenta e duas horas mais tarde, a viabilidade foi analisada por coloração com azul de Tripano. S (MEO) TLC e GEM + S (MEO) TLC, inibindo efeito tumor é o melhor entre o grupo de quatro. A quantificação de cada valor é a partir de experiências independentes em triplicado. (

p Art 0,01).

A indução de apoptose por S (MEO) TLC e gemcitabina em linhas celulares de cancro da bexiga gemcitabina-Resistant

Hoechst 33342 nuclear coloração demonstraram que as células do fuso mitótico monopolares típicos com um fenótipo semelhante a característica roseta foram observados na fase mitótica em 24 horas após exposição a gemcitabina 45 nm, 0,5 uM S (MeO) TLC, 45nm gemcitabina + 0,5 uM S (MeO) TLC ou veículo e células em apoptose distintivas com condensação nuclear e fragmentação também foram identificados às 48 h após a exposição (Fig 6)

a:. células RT112-GR foram deixados sem tratamento; B: células RT112-GR foram tratados com 45nm gemcitabina; C: células RT112-GR foram tratados com 0,5 uM S (MEO) TLC; D:. Células RT112-GR foram tratados com ambos em conjunto (45nm Gemcitabina + 0,5 uM S (MeO) CCF) para os tempos indicados e, em seguida, a morfologia nuclear foi analisado com coloração de Hoechst e visualizadas por microscopia de fluorescência

Trypan azul coloração confirmou que, em gemcitabina + S grupo (MEO) TLC e viabilidade celular grupo S (MEO) TLC foram significativamente menores em células KU7-GR RT112-Gr e em comparação com o grupo controle (Fig 5).

Efeitos de S (MEO) TLC e gemcitabina no modelo de xenoenxerto de cancro da bexiga

Para a análise inicial da atividade anticâncer de S (MEO) TLC em modelos de xenotransplante subcutâneos, o volume do tumor foram avaliados após o tratamento com DMSO (controlo de veículo), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg de gencitabina ou 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg de gemcitabina. Após 3 semanas de observação, verificou-se que a S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemcitabina (50 mg /kg) e S (MeO) TLC (20mg /kg) grupos proeminentemente suprimiu o crescimento tumoral em comparação com gemcitabina (50 mg /kg ) e DMSO (controlo de veículo). perda de peso corporal não foi observado em nenhum dos grupos de tratamento. A necrose foi observada sobre a superfície do tumor de S grupo de tratamento (MeO); TLC (20 mg /kg) e S (MeO); TLC (20 mg /kg) + gemcitabina (50mg /kg), embora sem necrose óbvia foi observada no grupo de controlo . alterações de volume do tumor os ratinhos foram comparados entre os grupos de tratamento e de controlo, a diferença no volume final do tumor significativo entre os quatro grupos foi estatisticamente significativa (Fig 7).

. Após o estabelecimento bem sucedido de tumores de xenoenxertos subcutâneos, DMSO (controlo de veículo), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg de gencitabina ou ambos (S (MeO) CCF + GEM) foram administrados por via intraperitoneal diariamente durante 5 dias (setas) . Os volumes dos tumores foram medidos a cada dois dias. B. O peso corporal médio dos murganhos foram avaliados todos os dias. Não há nenhuma diferença significativa entre os três grupos (

P Art 0,05).

Discussão

chemoresistance é uma das principais causas de falha no tratamento de cancro da bexiga com gemcitabina. Por isso, é extremamente importante para esclarecer o mecanismo de quimioresistência e identificar marcadores preditivos de quimioresistência inerente e adquirida a gemcitabina [24]. ribonucleótido-redutase (RR) é uma heterotetr�ero e atividade requer dois grandes subunidades 90 kDa e duas pequenas subunidades de 45 kDa. O enzima é essencial para o fornecimento de desoxinucleótido para a síntese de novo de ADN e por isso para a proliferação celular. Consiste nas grandes e pequenas subunidades dimerizadas, M1 e M2. RRM1 é uma grande cadeia de péptido (α), enquanto RRM2 é uma pequena proteína de subunidades RR (β). Embora a actividade enzimática da RR é modulada por níveis de RRM2, RRM1 poderia desempenhar um papel-chave entre as subunidades 2 no decurso do tratamento gemcitabina [9, 13]. O papel da RRM1 na formação RR também tornou um alvo molecular atraente para o desenvolvimento de agentes quimioterapêuticos, tais como gemcitabina [13].

perfil de expressão gênica por microarrays análise fornece uma poderosa forma de obter uma visão geral do a expressão de genes e processos fisiológicos envolvidos em respostas a estímulos específicos. No estudo atual, nós estabelecemos linhas celulares de cancro da bexiga humana gemcitabina resistente RT112-GR e KU7-GR, as células RT112-GR foram 350 vezes menos sensível a gemcitabina do que as linhas celulares parentais, enquanto as células KU7-GR foram 15 vezes menos sensível a gemcitabina do que as linhas celulares parentais. Então, nós escolhemos células RT112-GR como um assunto nas experiências seguintes. análise de microarray foi usada para examinar as mudanças de expressão de genes entre as células RT112 e RT112-GR. Os nossos resultados indicam que 442 genes, incluindo RRM1 e RRM2, foram regulados positivamente, enquanto que 235 genes regulados negativamente em células RT112-GR. mudança eg5 não era óbvio. Nosso estudo indica que RRM1 e RRM2 estão envolvidos na resistência a gemcitabina no cancro da bexiga humana. Na célula, gemcitabina é fosforilado em monofosfato, difosfato, ou trifosfato antes da sua incorporação no ADN, que é necessária para a sua actividade inibidora de crescimento. A forma de gemcitabina diphosphorylated actua como um inibidor de RR, que é a causa da actividade citotóxica gemcitabina. RR aumenta a piscina desoxinucleótido trifosfato (dNTP) nas células, o que poderia levar a uma diminuição da incorporação de análogos de dNTP, tais como gemcitabina trifosforilado no ADN e pode reduzir o efeito antitumoral de gemcitabina [9]. Um número de estudos pré-clínicos e clínicos demonstraram que RRM1 podia ser a molécula alvo para regular a resistência gemcitabina. Além disso, os seus níveis de expressão pode ser um indicador útil de resistência gemcitabina. Shin Nakahira et al relataram que a expressão aumentada RRM1 foi significativamente associada com efeitos antitumorais e com a sobrevivência pobre após o tratamento com gemcitabina em pacientes com câncer pancreático [9]. Hao Xie et al relataram que, após a ressecção cirúrgica no adenocarcinoma do pâncreas, para conseguir a melhor sobrevivência, o nível de expressão RRM1 podem ser usadas para estratificar pacientes para receberem ou gemcitabina ou adjuvante terapia adjuvante não gemcitabina. Isto é consistente com os resultados de estudos de fase NSCLC primeiros [13], e esta implicação é suportado pelo papel de RRM1 como um supressor de tumores [12]. Além disso, RRM2 é conhecido por estar envolvido na quimiorresistência. Supressão de RRM2 poderia sensibilizar as células do cólon e do cancro do pâncreas agentes quimioterapêuticos [25]. A relação entre a expressão do efeito quimioterapêutico RRM2 e em amostras clínicas também tem sido investigada. Itoi et al examinou os níveis de mRNA RRM2 em amostras de biópsia de 35 pacientes com câncer pancreático irressecável em um estudo prospectivo, e descobriu que a taxa de resposta à quimioterapia gemcitabina foi significativamente maior em pacientes com expressão RRM2 baixo [26]. No entanto, nenhum dos estudos anteriores têm investigado a expressão de RRM no cancro da bexiga.

Nosso estudo descobriu que RRM1 e RRM2 foram expressas em tecidos de cancro da bexiga clínicos e linhas celulares de cancro da bexiga. É indicado que a expressão de RRM1 e RRM2 foi significativamente mais elevada em tumores de baixo grau do que os tumores de grau elevado. Os nossos dados sugerem que a superexpressão RRM2 RRM1 e poderia estar associada com a progressão do cancro da bexiga. Em linhas celulares de cancro da bexiga, os resultados de RT-PCR demonstrou que as células RT112-GR aumentou de forma significativa nos níveis de ARNm e RRM1 RRM2 em comparação com as células parentais (

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0,001), respectivamente. Para avaliar os efeitos da RRM1 /2 sobre linhas celulares de cancro da bexiga RT112-GR, gene RRM1 /2 foram knockdown. Nosso estudo indicou que, após knockdown de RRM1 /2, RT112-gr linhas celulares de cancro da bexiga sensíveis à gemcitabina novamente, indicando a superexpressão de RRM foi associada à resistência gemcitabina, e pode ser um novo biomarcador candidato a resistência gemcitabina. Dados a partir de inúmeros estudos clínicos mostraram que RRM1 /2 em células tumorais expressão está inversamente correlacionada com a sensibilidade das células tumorais para terapia de gemcitabina [9, 11, 12]. Por exemplo, Woon-Gye Chung et al relataram que o aumento da expressão RRM1 foi provavelmente responsável pela resistência a gemcitabina na CT-1-GR (resistência gemcitabina TC-1) células, o qual foi adicionalmente suportado pela observação de que a transfecção de RRM1 siRNA em TC-1-Gr células feitas as células mais sensíveis a gemcitabina HCl [27]. Zhang M et al relatou que pequeno interferir knockdown RRM2 mediada por RNA reverteu significativamente a resistência das células SKOV3 /DDP à cisplatina [28].

As evidências mostraram que os pacientes com resistência gemcitabina enfrentaria um resultado pior. Por conseguinte, o tratamento do cancro da bexiga gemcitabina resistência é muito importante. estudos crescentes demonstrado um resultado melhor usando a terapia de alvo no tratamento de cancro da bexiga. Nosso estudo inicial encontrados inibidores Eg5 como drogas alvo in vivo e in vitro de tratamento de cancro da bexiga pode ter um bom efeito curativo, além disso, que inicialmente demonstraram o efeito anticancerígeno do inibidor Eg5 sobre o cancro da bexiga resistência gemcitabina no presente trabalho.

Eg5 é um motor homotetrâmero formados pelo arranjo antiparalelo de dois dímeros. O tetrâmero Eg5 tem a capacidade para reticular microtúbulos antiparalelo emanam dos dois centrossomas em G2 /M [29]. A função primária de Eg5 é para formar o fuso bipolar durante a primeira prometáfase; falha para separar os centrossomas duplicados conduz a paragem da mitose e, finalmente, provoca a morte celular por apoptose em certas linhas celulares de tumores [30, 31].